摘要:
目的:研究片仔癀(PZH)对脂多糖(LPS)诱导的BV2 小胶质细胞神经炎症损伤的保护作用及机制.方法:将BV2 小胶质细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640 完全培养基中,并置于5%CO2,37°C培养箱中常规培养.将BV2 小胶质细胞以5×104 个/m L 的密度接种于96 孔板,LPS(100 ng/mL)诱导BV2 小胶质细胞炎症反应,同时分别用不同浓度PZH(0.05、0.10、0.15 mg/mL)干预12 h,加入MTT并于4 h 后检测其490 nm 处吸光度.将BV2 小胶质细胞以5×104 个/mL的浓密度接种于24 孔板,LPS(100 ng/mL)诱导BV2小胶质细胞炎症反应,分别用不同浓度PZH(0.05、0.10和0.15 mg/mL)干预12 h,收集上清并使用ELISA法测定细胞上清中IL-6的水平.将BV2小胶质细胞以1.6×105个/mL的密度接种于6 孔板,LPS(100 ng/mL)诱导BV2 小胶质细胞炎症反应,同时分别用不同浓度PZH(0.05、0.10、0.15 mg/mL)干预12 h,使用TRIzol 试剂提取总RNA,逆转录制备cDNA,然后采用RT-qPCR 法检测BV2 小胶质细胞中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α转录水平.将BV2小胶质细胞以1.6×105个/mL的密度接种于6孔板,LPS(100 ng/mL)诱导BV2小胶质细胞炎症反应,同时分别用不同浓度PZH(0.05、0.10、0.15 mg/mL)干预12 h,加入RIPA蛋白裂解液提取蛋白质,然后采用Western blot法检测BV2小胶质细胞中TLR4、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、COX-2和iNOS蛋白表达水平.结果:①MTT实验结果显示,与正常对照组比较,不同浓度PZH 和LPS 各自单独干预或者两者共同干预对BV2 小胶质细胞活力均无明显影响(P>0.05).②ELISA结果显示,与正常对照组比较,模型组IL-6分泌水平明显上升(P<0.001);与模型组比较,不同浓度PZH可显著降低IL-6分泌水平(P<0.05,P<0.05,P<0.01).③RT-qPCR结果显示,与正常对照组比较,模型组IL-1β(P<0.001)、IL-6(P<0.001)和TNF-α(P<0.01)转录水平明显上升;与模型组比较,不同浓度 PZH 可明显降低 IL-1β(P<0.05,P<0.01,P<0.001)、IL-6(P>0.05,P<0.01,P<0.001)和TNF-α(P<0.01,P<0.01,P<0.001)转录水平.④Western blot结果显示,不同浓度PZH能显著抑制LPS诱导的 TLR4/MAPK 信号通路的激活,减少 TLR4(P>0.05,P<0.05,P<0.05)、p-ERK1/2(P>0.05,P<0.05,P<0.01)、p-p38(P<0.05,P<0.01,P<0.01)、COX-2(P<0.01,P<0.01,P<0.001)和 iNOS(P<0.01,P<0.01,P<0.01)蛋白表达水平,但对p-JNK蛋白表达无明显影响(P>0.05).结论:片仔癀可明显改善LPS诱导的神经炎症损伤,其作用可能与抑制TLR4/MAPK 信号通路激活相关.