敲除

摘要： 【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后,坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株,与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力,为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。

摘要： 目的探究Clcn3敲除对幼龄小鼠实质器官发育的影响,为Clcn3基因敲除动物应用提供理论参考。方法PCR鉴定FVB小鼠基因型:野生型(Clcn3^(+/+))、杂合子(Clcn3^(+/-))及纯合子(Clcn3-/-);小鼠3周龄时,采集心、肝、脾、肺、肾和脑等主要实质器官并拍照,利用Image J软件测量其投影面积;中性福尔马林溶液固定各实质器官,石蜡切片进行HE染色,全切片利用全自动数字病理扫描分析系统扫描后观察器官细微结构。结果与Clcn3^(+/+)和Clcn3^(+/-)小鼠相比,Clcn3-/-小鼠体重显著降低(P0.05);HE染色显示,Clcn3-/-小鼠各实质器官组织结构未见异常,实质细胞体积相对较小。结论Clcn3敲除导致幼龄小鼠的实质器官减小,未对幼龄小鼠实质器官产生明显病理损伤。

摘要： 波形蛋白(Vimentin,VIM)可介导多种病毒进入机体,为研究病毒的感染机理,本研究将合成的敲除VIM基因的双sgRNA克隆于pX459-puro载体中,构建pX459-puro-V-1和pX459-puro-V-2敲除载体,经电转至大白猪肾成纤维细胞中,经嘌呤霉素筛选出14株单克隆细胞株。将筛选的单克隆细胞株通过PCR鉴定、测序验证、western blot鉴定,结果显示得到1株缺失VIM基因的单克隆细胞。通过100 ng/mL的脂多糖(LPS)分别刺激该单克隆细胞株和可传代大白猪肾成纤维细胞,通过western blot检测NF-κB和MAPK信号通路中p65、p38、JNK、ERK及磷酸化蛋白p-p65、p-p38、p-JNK、p-ERK的表达水平,结果显示经LPS刺激后,缺失VIM基因的单克隆细胞和可传代大白猪肾成纤维细胞中p65、p38、JNK、ERK、p-ERK的表达水平均无明显变化;缺失VIM基因的单克隆细胞中p-p65、p-p38、p-JNK的表达水平明显低于可传代大白猪肾成纤维细胞(P<0.01)。本研究得到了1株缺失VIM基因的单克隆细胞,利用该细胞株首次研究发现VIM基因缺失能够影响宿主细胞中NF-κB和MAPK信号通路中p-p65、p-p38、p-JNK的表达,从而起到降低炎症反应的作用,该缺失VIM基因的单克隆细胞为病毒感染机理的研究提供了良好的实验素材,对相关疫病的防控有重要意义。

摘要： 目的 构建Myo1h(Myosin 1H)基因与人同源的第30号外显子敲除模型小鼠(Myo1h小鼠)并验证其敲除效率。方法 采用Crispr/Cas9技术构建Myo1h基因敲除F0(the founder)代嵌合体小鼠,并进行配笼繁殖,经过基因型鉴定后获得纯合F2(the second filial generation,子2代)代实验鼠。利用实时荧光定量PCR技术和免疫印迹技术从mRNA水平和蛋白层面验证敲除效果;利用免疫荧光染色技术,对小鼠髁突区域Myo1h的表达进行观察,从体内验证敲除效果;通过Micro-CT三维重建测量有效下颌骨长度,对F2代小鼠进行表型评估;采用Prism 8.0软件包对数据进行统计学分析。结果 实时定量PCR和免疫印迹结果显示,Myo1h基因的mRNA水平显著降低(P<0.05)、蛋白表达降低。免疫荧光染色结果显示,Myo1h小鼠体内脑部、肺部以及髁突组织的Myo1h表达显著降低(P<0.05)。通过Micro-CT和身长测量分析进行表型评估后发现,Myo1h基因敲除后小鼠的有效身长比正常对照组短(P<0.05)。结论 本研究成功构建出Myo1h基因敲除小鼠,且该基因敲除小鼠与正常对照相比,身长发育受到抑制影响。随着Myo1h基因对发育影响研究的继续深入,或许能为颅颌面骨的生长发育研究提供新的思路。

摘要： 背景:高尔基体膜蛋白1在人体组织中广泛存在,它的异常表达与癌症、病毒感染等多种疾病密切相关。研究表明,高尔基体膜蛋白1可调控一些纤维化细胞因子,但关于其在肾纤维化中的作用尚不清楚。目的:研究高尔基体膜蛋白1对单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化的影响。方法:选取6-8周龄的高尔基体膜蛋白1敲除小鼠(KO小鼠)和C57BL/6野生型小鼠(WT小鼠)各12只,分别对小鼠左侧肾脏行单侧输尿管结扎(单侧输尿管梗阻)手术,其右侧肾脏作为对照。单侧输尿管梗阻术后4 d取小鼠肾脏,采用苏木精-伊红染色和Masson染色观察肾组织病理、肾纤维化程度;流式细胞术检测肾脏巨噬细胞浸润比例;qRT-PCR检测肾组织细胞外基质成分及炎症因子mRNA表达。实验方案经上海交通大学动物实验伦理委员会批准。结果与结论:①WT-单侧输尿管梗阻组和KO-单侧输尿管梗阻组均可见明显肾损伤和肾纤维化,细胞外基质成分Ⅰ型胶原蛋白α1和纤维连接蛋白表达量显著升高,且KO-单侧输尿管梗阻组肾损伤、肾纤维化程度及细胞外基质表达量均高于WT-单侧输尿管梗阻组(P<0.05);WT-对照组和KO-对照组肾脏均未出现明显的肾损伤、肾纤维化及细胞外基质沉积;②与WT-单侧输尿管梗阻组相比,KO-单侧输尿管梗阻组的巨噬细胞浸润比例显著增多(P<0.05),其炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β以及趋化因子CCL5、单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达明显升高(P<0.05)。WT-对照组和KO-对照组肾脏巨噬细胞浸润较少,炎症递质表达量低;③结果说明,高尔基体膜蛋白1在肾纤维化发展中起保护作用,其机制可能与巨噬细胞浸润、炎症递质的调控有关。

摘要： 功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步,基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步.基因敲除手段种类繁多,其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术,具有高效、便捷、精确等优点,在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用.随着科研工作的逐渐深入,CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中.文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用,为科研工作的开展提供参考.

摘要： 用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼(Danio Rerio)的trim47,收集TRIM47–/–(trim47基因敲除)和WT(野生型)斑马鱼的大脑和脾脏进行RNA-seq分析,以鉴定差异表达基因(DEGs).总共确定了271个DEGs,经过简要分析,将这些DEGs注释为KEGG途径和GO富集分析,与WT组相比,TRIM47-/-组的脑中DEGs集中在细胞黏附和谷氨酸能突触信号传导途径中.在脾脏中,与野生型组相比,TRIM47-/-组的DEGs在补体和凝血级联信号通路中发生了变化.使用qRT-PCR验证了脑和脾中与补体途径相关的基因,与转录组数据一致.这些结果表明,Trim47在脾脏和大脑中起着重要的生物学作用,尤其是通过补体途径参与先天免疫功能.体内感染实验表明,trim47基因敲除可提高斑马鱼中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的感染率.总之,这些发现为TRIM成员在先天免疫中的功能提供了新线索.

摘要： 目的 构建Prpf40b基因敲除大鼠,为该基因的生物学研究建立工具动物,同时初步探究该基因缺失后对心脏发育的影响.方法 利用CRISPR/Cas9技术构建Prpf40b基因敲除大鼠,测序及PCR技术鉴定敲除大鼠构建成功及仔代大鼠基因型.通过超声影像技术分析敲除大鼠心脏结构形态和功能改变,随后通过病理组织学观察分析该基因敲除后对大鼠心肌显微形态的组织学影响.结果 经PCR鉴定和测序比对,确认Prpf40b基因敲除大鼠构建成功.经超声影像学分析,与同窝阴性大鼠相比2月龄敲除大鼠心脏结构形态未见明显异常,而12月龄敲除大鼠收缩期及舒张期时心室腔内径及容积显著减小,同时射血分数显著减小.经病理组织学分析,与同窝阴性大鼠相比12月龄敲除大鼠心肌出现排列不齐,心肌纤维粗细不均及肌浆网扩张等现象.结论 Prpf40b基因缺失可诱发大鼠心脏整体结构形态改变及心肌组织学异常.

摘要： 目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)在小鼠重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)相关肺损伤中的作用.方法 32只小鼠随机(随机数字法)分为4组(每组8只):野生型对照组(WT+CON组)、野生型SAP组(WT+SAP组)、MIF基因敲除对照组(KO+CON组)、MIF基因敲除SAP组(KO+SAP组).通过腹腔注射L-精氨酸(4mg/g)制备SAP模型.在末次注射后72 h取材,通过ELISA检测血清淀粉酶(AMY)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、MIF表达,通过HE染色观察胰腺组织及肺组织病理变化,通过免疫组化检测肺组织中IL-6、TNF-α表达,通过Western blot检测肺组织核因子κB (NF-κ B)表达.计量资料两组间比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析.结果 与WT+CON组相比,WT+SAP组小鼠胰腺及肺组织损伤病理评分、AMY,血清及肺组织TNF-α、IL-6表达明显增高(P＜0.05),而KO+SAP组以上指标水平明显减低(P＜0.05).此外,KO+SAP组肺组织中NF-κB蛋白表达较WT+SAP组显著降低(P＜0.05).结论 敲除MIF基因可减轻小鼠SAP相关肺损伤,其作用机制可能与NF-κB有关.

摘要： 【目的】揭示漆酶基因Cglac10在杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长及侵染致病过程中的功能。【方法】利用qPCR技术对Cglac10在该菌侵染过程中的表达进行分析,并通过同源重组和PEG介导的原生质体转化法获得敲除突变体ΔCglac10H和回复菌株C-ΔCglac10H。【结果】Cglac10基因在侵染过程中的表达量是侵染前的8.02~13.66倍。回复菌株C-ΔCglac10H的表型与野生型菌株的无显著差异;突变体ΔCglac10H除在菌丝生长速率方面与野生型菌株差异不明显外,菌落颜色变为白色,培养10 d时菌丝中黑色素含量下降了67.33%,产孢量显著下降;在水膜中培养至24 h时,ΔCglac10H才偶见形成附着胞,36 h时的形成率仅为野生型菌株的44.85%;在PDB中培养6 d后,ΔCglac10H的胞内漆酶活性较野生型菌株下降了57.61%;不刺伤时,ΔCglac10H几乎不致病,刺伤接种6 d后,观察到ΔCglac10H的致病力比野生型菌株下降了52.94%。【结论】Cglac10在C.gloeosporioides无性繁殖及侵染致病过程中起着重要作用。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于在病毒或细胞基因组上条件性敲除目的基因的条件性敲除片段、质粒及条件性敲除目的基因的方法，所述条件性敲除片段包括目的基因左同源重组臂LA、筛选标记物基因表达元件、lac阻遏子基因表达元件、lac操纵子基因表达元件、目的基因右同源重组臂RA；同时构建了含有所述条件性敲除片段的质粒；并提供了一种运用上述质粒进行目的基因条件性敲除的方法。相对于现有技术，本发明仅通过一个条件敲除片段或含有条件敲除的质粒就实现了目的基因的条件性敲除，具有操作流程简单，敲除效率高，筛选过程便捷等优势。

摘要： 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的猪胚胎成纤维细胞系及其应用；本发明提供的TNFα基因敲除的sgRNA在TNFα基因上的靶点序列位于其第一外显子上，靶点序列如SEQ ID NO：1所示。在将所述sgRNA构建至载体pX330后，将表达载体pX330‑TNFα作为TNFα基因的打靶载体，转染猪胚胎成纤维细胞，获得TNFα基因敲除的猪胚胎成纤维细胞单克隆细胞株，得到的多种不同编辑类型的突变体均可造成移码突变，编辑效率较高。本发明制备得到的猪胚胎成纤维细胞细胞系可作为体细胞核移植的供体，用于转基因猪的制备，具有较大的应用研究价值。

摘要： 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。本发明提供了靶向敲除FRZB基因的双sgRNA，针对FRZB基因第一外显子上两个位点进行切割，后将所述sgRNA构建至表达载体后通过优化的电转体系转染猪成纤维细胞，再利用流式细胞仪分选出高纯度的阳性单克隆细胞，经基因组鉴定筛选得到FRZB敲除的细胞系。本发明解决了构建敲除细胞系过程中转染效率、打靶效率低、单克隆纯度低的难题，操作简便且得到了较长片段删除的编辑细胞系。涉及到的细胞系可作为体细胞核移植的供体，用于转基因猪的制备，为深度挖掘FRZB基因生物学功能提供了较好的研究工具。

摘要： 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种靶向敲除RPSA基因的sgRNA及RPSA基因敲除细胞系的构建方法。本发明设计了一种特异性靶向RPSA基因的sgRNA；所述的sgRNA能够特异性靶向RPSA基因，应用CRISPR‑Cas9技术实现了对宿主细胞中RPSA基因的完全敲除，敲除效率高；本发明还提供了一种通过CRISPR‑Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建RPSA基因敲除细胞系的方法；敲除宿主细胞中RPSA基因不仅能够促进FMDV病毒的复制，可用于提高FMDV疫苗的生产量和抗原表达量；而且还意外的发现，敲除宿主细胞中RPSA基因能够显著抑制塞内卡谷病毒在细胞内的复制；为进一步研究RPSA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。

摘要： 本发明属于生物技术领域，其公开了一种双sgRNA，为靶向第四外显子的STING‑sgRNA 1‑3中之一和靶向第八外显子的STING‑sgRNA 4‑5中之一的组合。该双sgRNA搭载到表达载体上之后能够得到合适的基因敲除载体，以大片段敲除猪成纤维细胞STING基因，由此得到的猪成纤维细胞系具有适于克隆、无敲除基因修复能力、无外源基因引入的猪成纤维细胞系。同时，本发明还公开了该猪成纤维细胞系的构建方法。

摘要： 本发明公开了一种敲除载体，包括CRISPR/Cas9载体骨架和连接到CRISPR/Cas9载体骨架上的一段互补DNA序列；CRISPR/Cas9载体骨架能够表达Cas9核酸酶；互补DNA序列能够被对应地转录为特异性识别PPARG基因中的特定序列的sgRNA，sgRNA能够与PPARG基因中对应的特定序列的互补链互补配对，使Cas9酶特异地切割特定序列，特定序列包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6中的一种或多种。本发明还公开了一种打靶载体，包括依次连接的5’同源基因、标记基因及3’同源基因，5’同源基因和3’同源基因分别与肝脏细胞中含有PPARG基因的染色体上的PPARG基因的切割位点的上游端相邻基因和下游端相邻基因的序列同源。本发明还公开一种肝脏细胞中的PPARG基因的体外敲除方法和一种PPARG基因敲除肝脏细胞。

摘要： 本发明公开了一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法。将pilA基因的启动子片段PpilA和sacB基因的ORF片段融合获得PpilA‑SacB的模块，扩增出四环素抗性基因，获得Ptet‑TCR模块，将PpilA‑SacB模块和Ptet‑TCR模块构建到pBJ113载体的BamHI和XbaI位点，获得质粒pBJ116。本发明的质粒pBJ116，其含有卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，通过两次正负筛选系统，实现黄色黏球菌基因组上大片段的敲除。经试验发现，本发明的方法获得的Myxochelin A编码基因ΔMXAN_3618突变体产生铁载体的水平显著降低，并且捕食铜绿假单胞菌的能力显著降低。并且该方法所需的时间较短。

摘要： 本发明提供一种炭疽菌脂肪酸羟化酶CsSCS7的应用及构建基因敲除载体、基因敲除突变体的方法，具体为炭疽菌脂肪酸羟化酶CsSCS7在降解杀菌剂中的应用，本发明通过构建CsSCS7基因敲除载体，获得CsSCS7基因敲除突变体，经过功能性实验，证实了该羟化酶对炭疽菌真菌菌丝生长极为重要，并参与调控真菌对咯菌腈的降解，可应用于对咯菌腈等吡咯类杀菌药剂降解的功能，具有良好的应用前景。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于在病毒或细胞基因组上条件性敲除目的基因的条件性敲除片段、质粒及条件性敲除目的基因的方法，所述条件性敲除片段包括目的基因左同源重组臂LA、筛选标记物基因表达元件、lac阻遏子基因表达元件、lac操纵子基因表达元件、目的基因右同源重组臂RA；同时构建了含有所述条件性敲除片段的质粒；并提供了一种运用上述质粒进行目的基因条件性敲除的方法。相对于现有技术，本发明仅通过一个条件敲除片段或含有条件敲除的质粒就实现了目的基因的条件性敲除，具有操作流程简单，敲除效率高，筛选过程便捷等优势。

摘要： 本发明提供了一种CSN1S1基因敲除载体以及CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的制备方法，涉及基因工程技术领域，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体质粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过该基因敲除载体简便、快速、高效地敲除了奶山羊CSN1S1基因，获得了纯合的敲除CSN1S1基因的奶山羊乳腺上皮细胞。