慢病毒表达载体

摘要： 【目的】研究白细胞介素-10(IL-10)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体(pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro)进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验(IFA)观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度(TCID50)。【结果】试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID50在感染后48 h极显著高于PK-15细胞(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。

摘要： 目的:构建淋巴细胞活化因子3(LAG3)-mCherry红色荧光蛋白的LAG3-mCherry慢病毒表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达LAG3-mCherry融合蛋白的细胞系,探讨LAG3-mCherry融合蛋白在HEK293T细胞中的定位。方法:将LAG3质粒和带有mCherry的慢病毒载体分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切,构建pEZ-LAG3-mCherry表达载体。将测序正确的质粒利用Lipofectamine 3000转染HEK293T细胞,利用荧光显微镜观察LAG3-mCherry在HEK293T细胞中的表达定位,Western blotting法检测LAG3-mCherry融合蛋白的表达情况。结果:酶切鉴定结果,电泳后重组质粒双酶切后可见约为8012和2066 bp大小的2条DNA条带,与pEZ-Lv-mCherry载体及LAG3基因片段大小相符;DNA测序结果,LAG3基因成功插入到慢病毒表达载体中。荧光显微镜观察,LAG3-mCherry融合蛋白主要在HEK293T细胞膜上表达,少量蛋白滞留在细胞质中。Western blotting法检测,在转染pEZ-LAG3-mCherry质粒中检测到LAG3对应特异性条带。结论:成功构建了LAG3-mCherry慢病毒表达载体pEZ-LAG3-mCherry。通过稳定转染成功制备了稳定表达LAG3-mCherry的细胞系。LAG3-mCherry融合蛋白主要分布于HEK293T细胞的细胞膜上。

摘要： 目的:构建T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域-绿色荧光蛋白(TIGITGFP)慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP的细胞系,探讨TIGIT-GFP融合蛋白在稳定表达细胞系中的表达情况。方法:将TIGIT质粒和慢病毒载体pLenti-GFP分别采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,凝胶回收后连接构建重组质粒pLenti-TIGIT-GFP。将测序正确的重组质粒转染人胚胎肾HEK293T细胞作为实验组,转染TIGIT质粒的HEK293T细胞作为对照组,转染48 h后荧光显微镜下观察细胞膜上GFP表达情况。将实验组细胞继续培养,采用嘌呤霉素筛选2周后,挑取单克隆扩大培养,荧光显微镜观察细胞膜上GFP表达情况,Western blotting法检测在转染的人胚胎肾HEK293T细胞中TIGIT-GFP蛋白表达情况。结果:酶切鉴定,TIGIT基因成功插入pLenti-GFP表达载体,DNA测序未检测到突变发生。实验组细胞膜上检测到GFP表达。Western blotting法检测,实验组细胞裂解液中检测到TIGIT-GFP特异性条带。结论:成功构建pLenti-TIGIT-GFP慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP融合蛋白的细胞系,TIGIT-GFP融合蛋白主要在稳定细胞系的细胞膜上表达。

摘要： 目的:构建针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的CAR慢病毒表达载体,并包装病毒颗粒.方法:设计并合成针对PSMA的CAR基因序列,将设计的CAR片段连入pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro载体中,经酶切、PCR及测序鉴定构建是否成功.应用慢病毒三质粒包装系统将PSMA-CAR载体进行包装,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测GFP鉴定包装结果及包装时的转染效率.通过超速离心方法浓缩病毒颗粒.结果:成功构建了PSMA-CAR慢病毒表达载体,成功包装了PSMA-CAR慢病毒颗粒且包装时的转染效率为70.43％,经测定获得的PSMA-CAR慢病毒滴度为5×105 TU/mL.结论:PSMA-CAR慢病毒表达载体的成功构建及病毒颗粒的包装为应用CAR技术治疗前列腺癌奠定了基础.

摘要： 目的:构建miR-513a-5p慢病毒过表达载体,转染人骨肉瘤细胞株,观察miR-513a-5p对人骨肉瘤细胞放疗敏感性的影响.方法:PCR法扩增人miR-513a-5p基因,克隆入pLentis-CMV-GFP-MCS-PGK-PURO载体获得重组质粒pLentis-miR513a,双酶切鉴定并测序后将正确的重组质粒和对照质粒转染293FT细胞制备慢病毒,分别转染骨肉瘤HOS和U2OS细胞,qRT-PCR法及荧光显微镜鉴定转染结果.克隆形成实验、MTT法检测miR-513a-5p高表达HOS和U2OS细胞在X射线照射下细胞存活情况.结果:双酶切及测序结果确定成功构建miR-513a-5p慢病毒载体pLentis-miR513a.qRT-PCR结果提示,转染骨肉瘤细胞株后miR-513a-5p表达显著升高.克隆形成实验结果显示miR-513a-5p高表达后骨肉瘤细胞在X射线照射下细胞增殖减慢.MTT结果提示miR-513a-5p高表达骨肉瘤细胞经X射线照射后细胞存活减少.结论:成功构建了miR-513a-5p慢病毒载体,建立了高效稳定表达miR-513a-5p的骨肉瘤细胞株,高表达miR-513a-5p能显著增加X射线照射后骨肉瘤细胞的放疗敏感性.

摘要： 目的 构建白介素-6(IL-6)过表达慢病毒稳转细胞系,探讨其对乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝病毒DNA(HBV-DNA)表达的影响.方法 以Huh7细胞gDNA为模板,通过PCR技术扩增获得IL-6片段并克隆到pMIGR1载体上,测序鉴定正确后,分别用pMIGR1质粒和pMIGR1-IL-6质粒与慢病毒包装质粒pCL-10A1共转染293T细胞,获得重组慢病毒颗粒,分别感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出成功表达目的质粒的阳性细胞,分别命名为Huh7/con和Huh7/IL-6,电化学发光法检测细胞培养上清液中IL-6表达水平;qRT-PCR技术检测细胞中IL-6 mRNA表达水平;化学发光微粒子免疫检测法检测HBsAg、HBeAg表达水平,PCR-荧光探针法检测HBV-DNA表达水平.结果 通过测序验证成功构建pMIGR1-IL-6质粒;通过慢病毒介导成功筛选出Huh7/con和Huh7/IL-6细胞系;电化学发光法及qRT-PCR结果显示,与对照组Huh7/con细胞系比较,Huh7/IL-6细胞系培养上清液IL-6水平及细胞中IL-6 mR-NA水平显著升高;pcDNA1.3质粒转染Huh7、HepG2、Huh7/IL-6细胞6、12、24、48 h后上清液中IL-6表达水平显著升高;20 ng/ml IL-6处理pcDNA1.3质粒转染后的Huh7和HepG2细胞6、12、24、48 h后上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表达水平显著下降;pcDNA1.3质粒转染Huh7/IL-6细胞6、12、24、48 h后上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表达水平显著下降.结论 成功构建IL-6慢病毒表达载体,并建立稳定过表达IL-6的Huh7细胞系;pcDNA1.3质粒转染可使IL-6表达上调;IL-6可使HBsAg、HBeAg、HBV-DNA表达水平下降.

摘要： 目的 研究CYP4Z1 RNAi慢病毒表达载体作用人乳腺癌细胞后对CYP4Z1 mRNA表达及对细胞增殖和MAPK信号通路的影响.方法 用RT-PCR和Western blot检测MDA-MB-468、T-47D和MDA-MB-231细胞中CYP4Z1的表达.构建3种CYP4Z1 RNAi慢病毒载体,转染CYP4Z1高表达的乳腺癌细胞,筛选出干扰效果最好的靶点序列.用RT-PCR检测转染后CYP4Z1 mRNA表达.用MTT和Western blot分别检测CYP4Z1 siRNA后对乳腺癌细胞增殖和MAPK信号通路的影响.结果 在MDA-MB-468细胞中CYP4Z1 mRNA和蛋白表达显著高于MDA-MB-231及T-47D乳腺癌细胞(P<0.05).成功构建了3组重组慢病毒载体(LV-CYP4Z1-RNAi-1/2/3),3组重组慢病毒感染MDA-MB-468细胞系后,CYP4Z1 mRNA的表达受到抑制,其中以LV-CYP4Z1-RNAi-2组抑制作用最显著,敲减率达到81％(P<0.01).与正常对照组相比,CYP4Z1-RNAi-2组MDA-MB-468细胞增殖受到抑制,p-ERK1/2表达水平显著降低(P<0.05).结论 成功构建了CYP4Z1 RNAi慢病毒表达载体,且CYP4Z1-RNAi-2可通过下调ERK1/2通路抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖.

摘要： 目的：在于构建PLV-miR-183慢病毒载体并在293T细胞和猪胚胎细胞中进行验证. 方法：以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,克隆miR-183前体及部分侧翼序列,利用T4连接酶将其连入pLV-CMV-MCS-EF1载体,构建PLV-miR-183慢病毒载体.在293T细胞中过表达miR-183,通过胞质注射生产转miR-183的猪胚胎. 结果：双酶切和测序结果证明成功构建了PLV-miR-183重组载体,将重组载体转染293T细胞,经胞质注射后观察到其在猪胚胎早期和囊胚期均有绿色荧光表达. 结论：本实验成功构建了猪miR-183慢病毒表达载体,在293T细胞中过表达同时生产出转miR-183的阳性胚胎,为后续研究miR-183的功能奠定基础.

摘要： 目的：构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)慢病毒表达载体. 方法：Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向人端粒酶逆转录酶hTERT基因特异性的小发卡RNA(shRNA)干扰序列,将hTERT-shRNA基因片段插入重组慢病毒pGLV3/H1/GFP+Puro中,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT.通过酶切、DNA测序验证hTERT片段的准确性,将LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,将该重组慢病毒感染caski细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染成功与否以及估计转染效率.用制好的病毒来感染宫颈癌caski细胞后,流式细胞仪检测病毒感染率,荧光定量PCR法检测转染后基因hTERT mRNA的表达情况,采用cck-8法和细胞平板克隆法检测细胞增殖情况. 结果：将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒.包装病毒后能够有效地感染宫颈癌caski细胞,荧光定量PCR检测结果证实构建的hTERT-小片段干涉RNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因表达.Anti-htert-LV组细胞增殖受抑制,生长速度较对照组生长缓慢. 结论：成功构建了携带hTERT-shRNA慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT,并稳定转染caski细胞系.该载体能够有效抑制hTERT的表达,使细胞增殖缓慢,为进一步的探讨hTERT基因在宫颈癌caski细胞中的发病机制和体外基因干预治疗方面奠定基础.

摘要： 线粒体转录终止因子3 (mitochondrial transcription termination factor 3,MTERF3)是MTERF蛋白家族中进化最保守的成员,从低等的果蝇到高等的哺乳动物中都存在.ParkC等在Cell杂志上首次报道MTERF3是哺乳动物线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子.已有研究显示人MTERF3蛋白表达异常在肿瘤发生发展中具有重要意义,但MTERF3在不同类型肿瘤或者同种肿瘤的不同阶段发挥的作用并不相同.为了更好地了解人MTERF3基因在宫颈癌发生发展中的作用及其相关机制,本研究通过构建重组慢病毒表达载体,建立稳定过表达MTERF3基因的宫颈癌HeLa细胞株,为宫颈癌的基因治疗提供一定的实验依据.

摘要： 观察白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)基因慢病毒表达载体转染肺腺癌A549细胞后对肺癌细胞增殖生长、凋亡生物学等行为的影响,并探讨其可能的作用机制.

摘要： 利用慢病毒干扰系统,对东北梅花鹿角柄骨膜干细胞(PP细胞)P21基因进行干扰.结果表明:1)筛选出的两条针对梅花鹿P21基因的siRNA与载体质粒PLVTHM连接成功,并与pMD2.G、pCMV-dr8.9质粒共转染到293t细胞,获得重组慢病毒;2)通过感染PP细胞并利用流式细胞仪进行分选,获得了纯度90％以上的感染细胞;3)荧光定量RT-PCR检测表明P21基因的mRNA水平大幅度下调,干扰效率达到70％.表明本实验成功干扰了P21基因在PP细胞中的表达,获得了低表达P21的PP细胞系,为以后研究P21基因在鹿茸再生过程中的作用奠定了基础.

摘要： 本发明提供了一种慢病毒重组表达载体和重组慢病毒及应用、宿主细胞及其制备方法。本发明提供的慢病毒重组表达载体或重组慢病毒能将雌激素相关受体蛋白（ERR）的编码基因通过基因重组插入宿主基因组，从而持续、稳定地表达ERR。本发明提供的宿主细胞可持久稳定地表达ERR，还可为动物活体实验提供足够地高质量的病毒液。此外，本发明提供的慢病毒重组表达载体或重组慢病毒具有广泛的宿主范围，能侵染神经元、肌细胞、肝细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等多种类型的细胞，应用范围十分广泛。

摘要： 本发明公开了一种特异抑制肺癌PPARd基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的靶向PPARd的shRNA寡核苷酸序列插入pLVX‑shRNA2‑Puro表达载体构建得到的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、高效、稳定、特异地沉默肺癌PPARd基因表达的优点，抑制效果好，可用于肺癌研究，肺癌药物筛选与肺癌基因治疗等方面。

摘要： 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、高亲和性Her2单链抗体、人CD8a分子柔性片段与跨膜区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。本发明制备的嵌合抗原受体能够靶向Her2，提高CAR‑T细胞治疗效果。

摘要： 本发明公开了一种在缺氧条件下诱导HPV16E6/E7基因表达的慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体含有缺氧反应元件、CMV‑最小启动子和HPV16E6/E7基因，所述慢病毒表达载体能够在缺氧条件下诱导造血干细胞定向分化为永生化的红系祖细胞，永生化的红系祖细胞又可以在正常供氧条件下继续分化为成熟红细胞。使用本发明提供的载体所诱导出的红细胞具有与正常成熟红细胞接近的变形性和结合、释放氧气的能力，血红蛋白含氧量可达28±2mmHg，并且其在输注小鼠体内后的10分钟至24小时直径开始变小，在第24小时细胞就显示出了成熟红细胞的形态，在机体内显示出很好的生存适应性。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达单元、重组慢病毒表达载体、重组慢病毒及其制备方法和应用。本发明合成了人源PIRT基因启动子序列和兔源RFT‑I最小启动子序列，并将切割SNARE的蛋白酶编码序列分别插入到这两个启动子下游，制备得到两种不同的重组慢病毒表达载体和病毒。本发明的慢病毒具备特异性抑制外周痛觉发生和信号传导的特点，有效切割了SNARE蛋白，抑制了痛觉神经递质的分泌，达到基因治疗疼痛的目的。

摘要： 本发明属于表达载体技术领域，具体涉及一种IL‑17G‑197A慢病毒表达载体、其构建方法及慢病毒的包装测定方法，所述表达载体是将IL‑17G‑197A插入慢病毒载体pL6‑TO‑V5‑GIM构建而成，利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，可以高水平的表达效应分子，在转基因IL‑17G‑197A研究及市场化过程中具有潜在、广泛应用前景。

摘要： 本发明公开了一种双基因表达效果较好的慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法。该慢病毒表达载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列被替换为带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9得到；带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-第一弗林蛋白酶切割位点-V5标签-第一Spacer-第一2A肽-Casp9-第二多克隆位点。这种慢病毒表达载体利用2A肽实现双外源基因在哺乳动物细胞内的表达，可以从理论上保证了双外源基因在哺乳动物细胞内的等量表达，相对于传统的用于双基因表达的慢病毒载体，这种慢病毒表达载体的双基因表达效果较好。

摘要： 本发明公开了一种及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法，所述慢病毒表达载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体，pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列被替换为双基因表达盒子Dual得到；双基因表达盒子Dual包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-弗林蛋白酶切割位点-V5标签-Spacer-2A肽-第二多克隆位点，其中，“-”代表连接。这种慢病毒表达载体利用2A肽实现双外源基因在哺乳动物细胞内的表达，2A肽具有“自我剪切”的特性，在蛋白质的翻译过程中，2A肽改变了核糖体的活性，促进2A肽残基Gly与tRNA

摘要： 本发明公开了一种神经母细胞miR‑200b/c高表达的慢病毒表达载体，包括：PCDH‑copGFP载体及miR200b/c基因序列，所述miR200b/c基因序列酶切插入PCDH‑copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，所述PCDH‑copGFP载体和miR200b/c的前体DNA序列均包含BamHl和EcoRI两个酶切位点,根据本发明实施例提供的神经母细胞miR‑200b/c高表达的慢病毒表达载体及构建方法，利用miR200b/c基因序列酶切插入PCDH‑copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，其转染效率高，可在神经母细胞中稳定地抑制miRNA‑200b/c表达，进而对基因表达起到调控作用。

摘要： 本发明涉及一种特异抑制c‑myc基因表达的shRNA慢病毒表达载体构建方法与应用。一种特异抑制c‑myc基因表达的shRNA包括依次连接的靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列以及终止位点，其中，靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。上述shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中c‑myc基因的表达。