摘要:
背景和目的:慢性乙型肝炎是我国常见的慢性传染病之一,最终可导致肝硬化和肝癌,严重威胁我国人民的健康。肝纤维化是慢性乙型肝炎导致这些后果的共同病理基础,而肝星状细胞(HepaticStellate Cell,HSC)的激活是纤维化发生的中心环节。根据目前的肝纤维化理论,星状细胞的激活是多种细胞因子的作用结果,而乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)对细胞似乎没有直接作用。但本实验室曾发现HBV在体外能直接促进肝星状细胞系LX-2细胞的增殖;HBV对LX-2细胞Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达也有明显的促进作用。另外,临床和流行病学研究也提示,乙肝病毒载量与慢性乙肝的预后有明显关联。另外,考虑到HBV具有泛嗜性,所以我们假设HBV有可能直接感染HSC、并激活该细胞。因此,本研究将着重探讨HBV能否体外感染LX-2细胞,以期为阐明慢性乙肝的致病机理提供新的实验依据。rn 方法和材料:1.体外培养LX-2细胞(美国旧金山总医院肝病研究中心Friedman教授惠赠),细胞数目达到10/培养瓶时,用HBV感染者的血清进行感染,HBVDNA终浓度分别为10、10、10、10拷贝/ml,同一浓度的感染时间均为24、48和72小时。按照观察时间点收取细胞,进行以下检测。2.透射电镜和胶体金标记(单克隆乙肝表面抗体、多克隆的乙肝核心抗体)免疫电镜观察细胞内是否存在病毒颗粒及特异性结合的金颗粒。3.用荧光定量多聚酶链反应(Polymerase chainreaction,FQ-PCR)方法测定细胞内的HBVDNA和共价闭合环状DNA(cccDNA);用斑点杂交(Dot blot)和Southern blot方法测定细胞内是否存在病毒复制中间体;用斑点杂交和Northern blot方法测定细胞内是否存在病毒复制时的mRNA;原位杂交(NBT/BCIP显色)检测细胞内HBVDNA存在与否及其位置;4.免疫组织化学法(DAB显色)测定HBV在细胞内是否表达乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBcAg)。rn 结果:1.透射电镜下,在LX-2细胞中没有发现完整病毒颗粒。但在少数细胞内,可见少量类病毒颗粒(直径40nm)和小球型颗粒(直径20nm)存在胞浆内的囊泡结构中。在HepG2.2.15细胞找到少量病毒颗粒。胶体金标记的免疫电镜下,LX-2细胞的胞浆和胞核中发现了直径5nm和20nm胶体金颗粒。颗粒数量较少,散在分布,但在小球型颗粒周围没有发现金颗粒。2.在少量LX-2细胞中,检测到HBVDNA,均在0.05拷贝/细胞以下,在所有LX-2细胞中没有检测到cccDNA;在HepG2.2.15细胞中,检测到了HBVDNA和cccDNA,分别为2.58拷贝/细胞和O.86拷贝/细胞。用斑点杂交、Southern blot和Northernblot方法没有检测到LX-2细胞中存在HBV复制中间体及mRNA;而在慢性乙肝患者肝组织中检测到阳性条带。原位杂交检测HBVDNA时,LX-2细胞中未发现阳性颗粒;在PUC HBV1.2质粒转染72小时后的HepG2中,发现蓝紫色阳性颗粒,位于胞浆和胞核中。3.用免疫组化方法标记HBsAg和HBcAg时,LX-2细胞中未发现阳性颗粒;HepG2.2.15细胞中有少量棕黄色颗粒,位于胞浆中;慢性乙肝患者肝组织中可见大量棕黄色颗粒。rn 结论:1.在体外培养中HBV可能进入了星状细胞,这种进入可能与细胞吞噬有关。2.现有证据不能证明HBV在LX-2细胞内进行DNA复制和抗原表达。