感受态细胞

摘要： 为了建立一种高效快捷的大肠杆菌(Escherichia coli)电转化方案,采用类似密度梯度离心的方法,使用角转子离心机达到快速除盐的目的 .研究发现,以20％甘油(V/V)/1.5％甘露醇(m/V)溶液作为梯度介质,采用菌悬液与梯度介质比例为1:5(V/V)时形成的密度梯度可有效地进行离心除盐,离心后的细胞以20％甘油(V/V)/1.5％甘露醇(m/V)溶液重悬,随后在电场强度为15 kV/cm的条件下进行电转化能得到较高的转化效率,而在室温条件下进行电转化试验不能提高转化效率.本研究仅通过2次离心,电转化效率可达到4.2×109 CFU/μg DNA,大大简化了试验流程.

摘要： 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为一种动物益生菌,可以直接添加在动物日粮中,提高动物对营养物质的消化吸收.随着基因技术的快速发展,枯草芽孢杆菌表达系统被广泛的应用于畜牧行业.为提高枯草芽孢杆菌感受态细胞的转化效率,在感受态细胞的制备过程中添加不同种类,不同体积浓度的有机溶剂以此达到优化制备方法和提高转化效率的目的.本实验在野生型枯草芽孢杆菌LN感受态细胞制备过程中,分别添加体积比为1.0％、2.0％、3.0％、4.0％和5.0％的吐温-80、甲醇和丙酮,统计感受态细胞的复活菌数.将目的基因长度为500和2 680 bp的外源质粒pGEM-kpgt、pGEM-kmpgt通过化学转化的方式分别转入制备好的感受态细胞中,以P4326F/P4326R、KgF/KgR为引物,利用PCR验证转化结果,并计算转化效率.结果显示,在野生型枯草芽孢杆菌LN感受态细胞的制备过程中添加4.0％的甲醇,所制备的感受态细胞复活数最多为546±13个/μL,经转化后可获得52±4个转化子/μg,转化效率最高;目的基因片段长度延长至2～3 kb,转化效率为29±2个转化子/μg.通过对感受态制备方法的改进,提高了枯草芽孢杆菌感受态的转化效率,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供参考.%Bacillus subtilis is a probiotics that can be added directly to the diet to improve the uptake of nutrients in animals.With the rapid development of gene technology,the expression system of B.subtilis is widely used in the livestock industry.In order to ameliorate the transformation efficiency of B.subtilis competent cells,different types and concentrations organic solvents were added in the process of competent cells preparation to optimize the transformation efficiency.In this study,1.0％,2.0％,3.0％,4.0％ and 5.0％ of the Tween-80,methanol and acetone were added in preparation of wild-type Bacillus subtilis LN competent cell.The number of viable bacteria was calculated by dilution plate counting method to determine the best addition reagent and its concentration.The plasmid pGEM-kpgt and pGEM-kmpgt with the length of 500 and 2 680 bp was transformed into individual competent cells.The transformation results were determined by PCR using P4326F/P4326R and KgF/KgR as primers and the transformation efficiency was calculated.The results showed that the count of viable competent cell is 546± 13 cell/μL and the highest transformation efficiency is 52±4 transformants/μg DNA when adding 4％ methanol in the preparation process.When the length of the target gene fragment was extended to 2～3 kb,the transformation efficiency was 29 ± 2 transformants/μg.Through the optimization of the preparation method of the competent cell,the transformation efficiency of the competent cell of Bacillus subtilis was improved,which provides a potential tool for genetic engineering of Bacillus subtilis.

摘要： In order to study the formation mechanism of competence cells under the induction of metal ions and reveal the transformation mechanism,Ca2 + and Sr2 +(0 ~ 140 mmol/ L)were respectively used in this study to prepare E. coli competence cells and transform them. The results showed that the valence of competence cells induced by different concentration of Ca2 + ;Sr2 + ions was different and the two metal ions all had fairly large effects on E. coli cell internal and external membrane permeability,however,no direct relation to the degree of variation and transformation rate of the cell internal and external membrane. The results of EM observation showed that the untreated cells were adhered with each other into cluster;but the competence cells were disperse in total,adhered partly;the existence of cells af-ter transformation were independent with clear edges.%为研究金属离子诱导下感受态细胞形成的机理及揭示转化发生的机制，分别用 Ca2+和 Sr2+（0~140 mmol/ L）制备大肠埃希菌感受态细胞并转化。研究结果表明，不同浓度的 Ca2+和 Sr2+诱导的感受态细胞的效价不同，两种金属离子对大肠埃希菌细胞内外膜的通透性均有较大影响，但细胞内外膜的改变程度与转化率无直接关系；电镜结果显示，未处理的细胞呈簇聚集发生粘连现象，感受态细胞整体呈分散状态，局部发生聚集，而转化后的细胞独立存在，边缘异常清晰。

摘要： 针对大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，以pGM－T、pMD－18T为载体，在传统CaCl2方法的基础上，对制备及转化条件进行了改进和优化，结果表明，42°C热激的最佳时间为100 s，最适冷却时间为6～8 min。本研究将常规的50 mL离心管改成了1．5 mL EP管，有效降低了分装过程中可能产生的污染风险，简化了试验程序，提高了转化效率。

摘要： 研究了CaCl2溶液处理方法、长期保存的原始菌种活化次数、离心条件对感受态细胞最终转化效率的影响，并分析其最佳转化效率参数、优化感受态制备和转化方法。结果发现：使用过滤处理的CaCl2比灭菌处理的CaCl2制备的感受态细胞转化效率高。在其他条件相同的情况下，长期保存的大肠杆菌菌种活化3次以上的转化率最高；制备感受态细胞第1次离心在4°C、4000 g条件下离心15 min，第2次离心时在4°C、4000 g条件下离心5 min得到的感受态细胞转化率最高。

摘要： 目的：构建变异链球菌clpC缺陷突变株，检测该基因对变异链球菌感受态形成的影响。方法分别以变异链球菌UA159基因组和pIB107质粒为模板，PCR扩增clpC基因片段和卡那霉素基因盒（lox71-KMR-lox66）；将clpC基因片段插入pMD-19T simple载体，经ClaⅠ／EcoRⅠ酶切、补平后连入卡那霉素基因盒，构建clpC缺陷突变同源重组载体pCKX2；SalⅠ线性化pCKX2并转化变异链球菌，卡那霉素筛选阳性菌落；质粒pCrePA转化阳性菌株，30°C培养剔除卡那霉素基因盒；37°C培养去除pCrePA，获得clpC缺陷突变株，PCR和测序鉴定；提取细菌总RNA并逆转录成cDNA，用RT-PCR法扩增clpC缺失序列的核苷酸片段并进行产物的电泳分析；pDL276分别转化变异链球菌和clpC缺陷突变株，观察感受态细胞形成变化。结果 PCR和测序结果证实成功构建同源重组载体pCKX2及变异链球菌clpC缺陷突变株；RT-PCR结果显示，△clpC缺失的核苷酸片段PCR产物电泳结果并无相应的条带出现；clpC缺陷突变株的感受态形成期延迟并延长维持期。结论 clpC基因具有负调控变异链球菌晚期感受态细胞形成的作用。%Objective To construct a mutant strain of Streptococcus mutans ( S.mutans ) with clpC-deletion and to investigate the role of clpC gene in genetic competence.Methods The fragment of clpC gene and the kanamycin resistant cassette flanked by two loxP sites were amplified by PCR.The purified fragment of clpC gene was cloned into pMD-19T simple vector to construct pCKX1.The pCKX1 vector was digested with ClaⅠ/EcoRⅠ, then blunted and introduced into lox71-KMR-lox66 to obtain pCKX2 vector via homologous recombination.The pCKX2 vector was linearized with SalⅠ and transformed into S.mutans UA159 strain.The positive strains constructed via homologous recombination were screened with kanamycin and transformed with the thermosensitive plasmid pCrePA.The KMR cassette was excised after incubating at 30°C for 48 hours.Then the pCrePA plasmid was removed after overnight incubating at 37°Cfor the prepara-tion of clpC-deletion mutant.Total RNA were extracted from the S.mutans UA159 strain and the clpC-dele-tion mutant strain respectively, and then reverse transcribed into first strand cDNA.The target gene frag-ments were amplified by RT-PCR and analyzed by the agarose gel electrophoresis and sequencing.After be-ing verified by PCR and sequencing, the S.mutans UA159 strain and the clpC-deletion mutant strain were re-spectively transformed with E.coli-S.mutans shuttle vector pDL276 to observe the competence development induced by the competence-stimulating peptide (CSP).Results The PCR and sequencing results showed that the pCKX2 vector and the mutant strain with clpC-deletion were constructed successfully via homologous recombination.No clpC gene was detected in the clpC-deletion mutant as indicated by RT-PCR analysis.The formation of competent clpC-deletion mutant was delayed and the competence state was prolonged as com-pared with its parent strains.Conclusion The clpC gene negatively regulated the formation of competent S.mutans.

摘要： 目的：筛选携带抗鼻咽癌质粒 pFY 的稳定高产菌株。方法以 CaCl2法制备大肠杆菌 JM109感受态,将抗鼻咽癌质粒 pFY 转化 JM109感受态,对琼脂平板上获得的菌落进行筛选,选出符合标准的单菌落为菌种,进行菌种稳定性实验。用质粒提取试剂盒检测质粒含量。将抗鼻咽癌质粒 pFY 转染到细胞 CNE-2中,四氮唑蓝(MTT)比色法观察转染试剂及质粒载体对细胞生长增殖的影响。结果筛选得到菌株的培养液中质粒 DNA 含量为30 mg/mL,超螺旋 DNA 比例为92%。经电泳和酶切鉴定,该菌株的50子代所携带质粒与原代一致。质粒 pFY 对 CNE-2细胞株生长有明显的抑制作用。结论成功筛选出携带抗鼻咽癌质粒 pFY 的稳定高产菌株,为大批量制备临床应用级质粒奠定了基础。%Objective To screen the stable high-producing strains carrying anti-nasopharyngeal carcinoma(NPC)plasmid pFY.Methods Competent E.coli JM109 was prepared by the CaCl2 method and transformed with anti-NPC plasmid pFY.The bacterial colonies obtained from the agar plate were screened for selecting the single colony conforming to the standards as the bac-terial strain and conducting the stability test.The plasmid content was detected by the plasmid extraction reagent kit.Anti-NPC plasmid pFY was transfected into nasopharynegal carcinoma cell line CNE-2.The influence of transfection reagent and the plasmid vector on the cell proliferation was detected by MTT.Results The DNA concentration of plasmids in the culture solution of bacte-rial strain obtained by screening was 30 mg/mL.The proportion of supercoiled DNA was 92%.The identification of electrophoresis and restriction enzymes showed that the plasmids harbored in the 50th progeny of this strain were same as those in the primary. Plasmid pFY had the evident inhibiting effect on the growth of CNE-3 cell line.Conclusion The stable high-producing strains of E. coli carrying anti-NPC plasmid pFY is successfully screened out,which lays the foundation for large-scale preparation of plasmid pFY for clinical utility.

摘要： CaCl2法制备感受态细胞虽然已经成为一种成熟而经典的方法,但Ca2+是如何诱导细胞形成感受态并维持细胞的这种状态,目前尚不清楚.是否在细胞膜及细胞内存在Ca2+受体及其响应机制亦未可知.为此,本研究以E.coli DH5α为研究对象,采用转录组学和蛋白组学对100mM CaCl2诱导E.coli DH5α形成感受态细胞时转录组水平和蛋白组水平的变化进行关联性分析,找出在感受态形成过程中响应Ca2+的关键基因和蛋白.结果表明,在转录组水平,差异性表达基因共有333个,其中317个基因上调,16个基因下调.基因表达差异倍数大于4的基因共有15个且均为上调基因,其中srA,ygeI,psuK基因表达量分别是对照组的13.688倍,13.344倍和12.327倍.其余的12个基因表达倍数在4.07～6.58倍之间.差异性表达倍数大于2的基因共有101个.在所有差异性表达基因中,与细胞膜相关的基因共有41个,其中与细胞内膜相关的基因有25个如qiJ,yjiZ,yaiY,pspD等;与细胞外膜相关的基因共有8个,如yfaZ,ompL,yfeN等;与膜结构相关基因共8个与离子转运或结合相关的基因有11个,其中差异倍数大于2的共有五个,分别为:ybdR、kdpA、yciF、ddp、mntP,细胞表面信号传递相关基因为bhsA;表达差异倍数大于2的无特征基因蛋白五个,他们分别是yncJ、yebV、yfeK、ygaC、ygeI,其中基因ygeI表达差异倍数为13.3.

摘要： 本研究以E.coli DH5α为研究对象,基于Ca2+诱导下E.coli DHSα形成感受态细胞时转录组和蛋白组的分析结果,采用生物信息学在线分析软件对膜蛋白yiaW的理化性质、保守结构域、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点及相互作用蛋白拓扑网络进行了预测分析.利用Red同源重组技术构建yiaW基因缺陷型菌株,研究在yiaW基因缺失对Ca2+诱导E.coli DH5α感受态形成的影响.结果表明yiaW为疏水性蛋白,分子中存在2个跨膜区,不存在信号肽序列,也没有磷酸化位点,yiaW有2个糖基化位点.α-螺旋占57.94％.对其相互作用蛋白的拓扑网络预测发现,yiaW与yiaV蛋白为膜融合蛋白(外排泵组件、信号锚,与物质外排有关),和ycdZ(DUF1097家族内膜蛋白)、nrfA(亚硝酸还原酶)、nrfD(甲酸依赖亚硝酸盐还原酶)蛋白相互作用关系最为密切.突变菌株E.coliDH5α∷ΔyiaW生长状态与野生型相比差异性不显著(p＞0.05),Ca2+处理下突变菌株质粒pET-32a的转化效率为1.37×106CFU/μg,野生型转化效率为1.08×107CFU/μg,差异极显著(p＜0.01).综合以上研究结果,基因yiaW在Ca2+诱导E.coli DH5α感受态细胞形成过程中起到了十分重要的作用,其可能是细胞膜上的Ca2+受体之一.

摘要： 芽孢杆菌在高渗透压的条件下,易转化为感受态细胞.甘氨酸的加入有助电击时保护细胞膜.本文通过甘露醇山梨醇制造高渗透压,同时调整甘氨酸加入时期、细胞生长程度及电转电压的调整,建立了感受态细胞对质粒pWB980的高效电转化方法.当OD600为0.8时加入甘氨酸,培养至OD600为1.6时停止生长、转化时电压为2100V的时候,可以得到536个转化子,经鉴定均为阳性克隆子.而常规电转化的最高仅为20个转化子.为以解淀粉芽孢杆菌为宿主进行高效电转化提供了模型,也为建立适合工业应用的分泌型表达载体的构建打下了一定基础.

摘要： 以大肠杆菌OH5a、JM109为受体菌，质粒DNA加入感受态细胞，经短暂冰浴和热休克后，直接涂布预热至37°C的平板或加入LB培养基，复活一定时间后涂板。研究不同型号的菌株、不同转化溶液、感受态细胞的存放时间、转化时间及转化后的复苏时间等对质粒转化效率的影响。结果表明：以0.10mol/L,CaSO4溶液制备感受态细胞，冰浴转化30min，经42°C热休克，作用90s后，不复苏直接用无菌水进行8倍稀释，涂平板筛选转化子，可获得较好的转化效率，每微克(μ g)质粒DNA可以得到高达105个转化菌落。转化溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有明显的影响，而转化时间、冰浴时间和转化后的振荡培养复苏时间对转化效率的影响不明显。

摘要： 本文介绍了利用Mu转座重组技术对能抑制病原真菌生长的地衣芽孢杆菌菌株进行的功能基因组分析.Mu转座复合物是由人工Mu转座子(携带一个卡那霉素抗性基因),在体外与四聚体MuA转座酶形成,然后,电转化地衣芽孢杆菌的受体细胞,引起插入位点基因的失活和相应表型的改变,经重组抗性和表型筛选,可以进一步探索未知的芽孢杆菌抑真菌肽相关基因.用含Glycine的M9-YE液体培养基培养细胞至对数早期(OD600=0.5左右),制备感受态细胞,电击电压为1.8kV,在国际上首次成功地将Mu转座复合物电转化入地衣芽孢杆菌中,转化效率为3.1×102CFU/μgDNA,同时得到芽孢杆菌抑真菌作用变小的转化子.

摘要： 本发明涉及用于制备感受态细胞的细胞与其用途、新颖的大肠杆菌与其用途以及制备感受态细胞的方法。本发明提供了一种用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力，且该细胞用于感受态细胞的制备。

摘要： 本发明公开了一种制备高转化率革兰氏阴性临床菌感受态细胞的方法。该方法中所用培养基为：18～22g/L胰蛋白胨，4～6g/L酵母提取物，0.005～0.015mol/LNaCl，0.002～0.003mol/L KCL；菌体的清洗和重悬均使用8～12％甘油；感受态细胞分装后即刻用液氮速冻后再进行超低温保存。本发明对临床菌感受态细胞的制备工艺进行了优化，包括培养基和工艺条件的优化，培养基中不加入MgCl2/MgSO4，并筛选优化了合适配比的培养基配方，以及制备、保存条件，按照该方法制备的革兰氏阴性临床菌感受态细胞，其转化率得到大幅提升，解决了目前临床菌感受态制备的一个大问题，且该方法更简单高效，具有很好的应用价值和前景。

摘要： 本发明公开了一种适于制备高效价感受态细胞的缓冲液TSS‑HI，其配方是：聚乙二醇8000 60g/L‑140g/L、二甲基亚砜50±5mL/L、甘油80mL/L‑120mL/L、氯化镁1.9g/L‑4.76g/L、用胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L配制的LB液体培养基补齐到1L并用盐酸调pH至6.1±0.1，121°C高压灭菌后加入无菌4M的氯化锰25.6mL/L‑52.6mL/L。本发明还公开了所述缓冲液在制备大肠杆菌高效价的感受态细胞实现DNA的高效转化中的应用。实验证实，应用本发明的缓冲液可以使普通大肠杆菌感受态效价由107CFU/μg DNA提高到108CFU/μg DNA，其中BW3KD效价可达到7.21×109±1.85×109CFU/μg DNA，极具应用前景。

摘要： 本发明涉及用于制备感受态细胞的细胞与其用途、新颖的大肠杆菌与其用途以及制备感受态细胞的方法。本发明提供了一种用于制备感受态细胞的细胞，其中该细胞具备在细胞内自发性累积自体产生的海藻糖的能力，且该细胞用于感受态细胞的制备。

摘要： 本发明涉及一种用于酿酒酵母电转感受态细胞的制备的重悬液及酿酒酵母电转感受态细胞的制备方法，所述的重悬液包括5~15mM的甘氨酸‑NaOH缓冲液、占所述的重悬液总体积1~5%的乙二醇、占所述的重悬液总体积2~8%的二甲基亚砜、0.5~1.5M的山梨醇。本发明解决了现有技术中的酿酒酵母电转感受态细胞不可冻存的问题，本发明中的酿酒酵母电转感受态细胞冻存后效价衰减较弱，能够满足实验需求，从而能够长期冻存，无需现配先用。

摘要： 本发明涉及细菌冻存转化技术领域，具体为一种芽孢杆菌目的菌株感受态细胞冻存悬液及感受态细胞和冻存悬液的制备方法。本发明通过将芽孢杆菌目的菌株感受态细胞保存在特定的冻存液中制成冻存悬液，能够实现感受态细胞在低温环境中长期保存，感受态细胞的活力可以维持高达180天，冻存后感受态细胞的转化效率最高可达1800cfu/μg，达到常规分子生物学转化效率的需求，实现随取随用，改变了现有技术有关短芽孢杆菌和芽孢杆菌化学转化感受态细胞不能冻存的现状。应用本发明方法可将现有的感受态制备和转化技术需连续操作48h以上缩短至每次操作仅需不到16h，极大的提高了工作便利性及工作效率。

摘要： 本发明公开了一种用于制备感受态细胞的缓冲液及制备感受态细胞的方法，属于生物技术领域。所述缓冲液为包括哌嗪‑1,4‑二乙磺酸、N,N‑(2‑羟乙基)‑2‑氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，所述缓冲液的pH值为6.0～7.0，所述缓冲液中哌嗪‑1,4‑二乙磺酸、N,N‑(2‑羟乙基)‑2‑氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的浓度分别为5～30mM、3～20mM、5～25mM、50～300mM和10～50mM。本发明实施例提供的缓冲液，通过添加N,N‑(2‑羟乙基)‑2‑氨基乙磺酸能够增加细胞膜的通透性，从而使制备的感受态细胞的转化效率大大提高，且所得感受态细胞能够适用于长片段的转化，同时，本发明实施例提供的制备方法能够高效快速地制备感受态细胞。

摘要： 本发明公开了一种用于大肠杆菌DH5α感受态细胞的冻干保护剂及其使用方法与应用，属于菌株的冻存和质粒转化技术领域，其由聚乙二醇4000、脱脂奶粉、二甲基亚砜及水组成，每100ml冻干保护剂中各物质的含量为：聚乙二醇4000 0.5～4g，脱脂奶粉10～25g，二甲基亚砜2～8ml，其余体积为水。本发明示例的大肠杆菌DH5α感受态细胞的冻干保护剂，利用活性较高的冻干菌株直接制备感受态细胞，该方法极大地缩短了分子克隆的实验流程，且得到的冻干活性菌株适温性较广，可保存在‑20°C至‑80°C的温度环境中，有效降低了感受态细胞的运输和保藏成本。

摘要： 本发明公开了一种提高感受态细胞转化率的方法，在感受态细胞的制备或存放的过程中加入糖脂类生物表面活性剂，从而显著提高感受态细胞的转化率。

摘要： 本申请涉及微生物技术领域，具体公开了一种大肠杆菌感受态细胞及其制备方法。一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法包括以下步骤：大肠杆菌单菌落的基础培养；取培养物在25‑30°C，200rpm的条件下振荡培养至OD600值为0.55‑0.6，制得菌悬液；将所述菌悬液转移到预冷的无菌离心管中，冰浴后，离心弃上清，保留细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入浓度为0.5‑1.5mM预冷的氯化钙溶液和浓度为0.1‑0.5%的非离子有机硅表面活性剂，冰浴后，离心弃上清，即得感受态细胞。大肠杆菌感受态细胞的转化率在1.01×109 cfu/μg以上。