γ-分泌酶

摘要： 目的 构建早老蛋白增强子2(PSENEN)基因沉默的人永生化角质形成细胞(HaCaT)模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响.方法 设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定.将HaCaT细胞分为5 组进行转染:shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液,NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液,空白组不加病毒液.转染完成后,荧光显微镜下观察荧光表达,流式细胞仪检测转染效率.CCK8 法测定HaCaT 细胞增殖活性,实时荧光定量PCR(qPCR)、Western 印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白(NCT)、早老蛋白1(PS1)、前咽缺陷蛋白1a(APH1a)mRNA、蛋白的相对表达量.统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验.结果 倒置荧光显微镜下观察到shRNA1～shRNA3组、NC组均有荧光表达,流式细胞仪示转染效率均达98％以上.qPCR、Western 印迹法显示,与NC组(1.054±0.272、1.076±0.075)相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3 组 PSENEN mRNA(0.187±0.010、0.163±0.022、0.174±0.009)、蛋白(0.219±0.097、0.208±0.014、0.185±0.062)表达均显著降低(均P＜0.001).CCK8法显示,与NC组相比,shRNA1 组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高(均P＜0.05),24和60h差异无统计学意义(均P＞0.05);shRNA2、shRNA3 组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC 组(均P＜0.05).shRNA1 组、shRNA2组、shRNA3 组、NC 组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义(F值分别为8.168、4.644、1.981,均P＞0.05),mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义(F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663,均P≤0.01).与NC组相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低(均P＜0.01),imNCT蛋白表达变化无统计学意义(均P＞0.05).结论 成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型,PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强,γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降.

摘要： 目的 探讨nicastrin (nct)基因对斑马鱼黑素细胞生物学功能的影响.方法 利用吗啉代寡核苷酸(M0)技术针对斑马鱼nct基因mRNA设计nct-MO序列,同时设计对照MO序列(ctrl-MO),并构建5'端为MO靶序列的增强绿色荧光蛋白(EGFP) mRNA,通过显微注射的方式将nct-MO或ctrl-MO与EGFP mRNA共注射入斑马鱼胚胎中,验证nct-MO的沉默效率,观察其表型变化.以野生型斑马鱼作为空白对照组,实时荧光定量PCR检测黑素合成notch信号通路相关基因mitfa、tyr、tyrp1a、tyrp1b、dct、pmela、notch1a、notch1b、hey1 mRNA表达水平的变化.多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验.结果 斑马鱼受精后8h,ctrl-MO+ EGFP mRNA组斑马鱼胚胎中均有绿色荧光表达,而nct-MO+ EGFP mRNA组及空白对照组胚胎均未见绿色荧光.受精后48 h,nct-MO组幼鱼尾部色素沉着区面积占比(0.169±0.083)低于ctrl-MO组(0.258±0.042,t=3.202,P=0.005),且nct-MO组色素分布紊乱.实时荧光定量PCR显示,nct-MO组、ctrl-MO组、空白对照组间pmela、tyrp1a、hey1基因mRNA相对表达量差异有统计学意义(均P＜0.05),mitfa、tyr、tyrp1b、dct、notch1a、notch1b mRNA相对表达差异无统计学意义(均P＞0.05);nct-MO组pmela、tyrp1a相对表达水平(0.708±0.028、0.558±0.136)低于ctrl-MO组(1.023±0.142、1.016±0.134,均P＜0.05).结论 nct基因可能通过调控斑马鱼黑素合成影响黑素细胞生物学功能.

摘要： 目的 在人神经元样细胞SY5Y中激活和抑制环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化,检测γ分泌酶复合体蛋白及β淀粉样蛋白前体(APP)水平的变化,分析通过调控CREB磷酸化防治阿尔茨海默病(AD)的可行性.方法 培养空载体SY5Y细胞(Vector-SY5Y)、过表达Gαq(Gαq-SY5Y)细胞、过表达APP(APP-SY5Y)细胞,分别用cAMP激动剂Forskolin、蛋白激酶(PK)A受体抑制剂H 892HCL处理上述3种细胞,Western印迹检测APP及γ分泌酶复合体的蛋白成分早老素增强子(PEN2)及早老素C端(PS1-CTF)的水平变化.结果 ①在Vector-SY5Y细胞中,激动剂组APP的表达无明显变化,PEN2、PS1-CTF表达明显上调;抑制剂组APP的表达明显上调,PEN2、PS1-CTF变化不明显.②在Gαq-SY5Y细胞中,激动剂组APP明显下降,PEN2表达量明显上调,PS1-CTF明显下降;抑制剂组APP明显下降,PEN2明显下调,PS1-CTF无明显变化.③在APP-SY5Y细胞中,激动剂组APP变化不明显,PEN2表达明显上调,PS1-CTF表达明显下降;抑制剂组APP明显上升,PEN2表达明显下降,PS1-CTF明显上调.结论 激活CREB的磷酸化可上调γ分泌酶复合体中PEN2水平,协同过表达Gαq可明显降低APP水平,可设计基于CREB和Gαq的AD防治策略.

摘要： [目的]探讨白桦脂醇在老年痴呆大鼠中的干预作用及可能机制,为探索老年痴呆治疗提供新的可能。[方法]选用健康成年SD大鼠,随机分为对照组、模型组、白桦脂醇低剂量组和高剂量组,每组12只,连续灌胃给药3个月后进行相关指标检测,采用Morris水迷宫实验观测大鼠空间学习记忆能力,采用双荧光素酶报告基因系统检测γ分泌酶活性,采用实时定量-聚合酶链反应(RT-PCR)法和蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测中前咽缺陷蛋白-1(APH-1)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)、早老蛋白增强子-2(PEN-2)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)表达水平。[结果]水迷宫检测结果发现白桦脂醇能明显改善模型大鼠认知功能障碍;双荧光素酶报告基因系统检测结果显示白桦脂醇可以抑制γ分泌酶活性;RT-PCR法和Western Blot法检测结果显示白桦脂醇可以抑制PEN-2和CREB表达,但对APH-1和HIF-1表达无明显影响。[结论]白桦脂醇可以显著改善老年痴呆模型大鼠的行为学,提高学习记忆能力和空间认知能力,显著降低老年痴呆模型大鼠PEN-2相关基因及蛋白的作用,但对APH-1相关基因及蛋白则无明显影响。

摘要： Notch基因家族编码一组高度保守的细胞表面膜受体,其参与的信号通路是决定胚胎组织细胞生长、分化和凋亡的关键通路之一;另一方面,Notch通路的过度表达也被认为是多种血液和实体肿瘤发病的重要分子机制,且具有成为新治疗靶点的潜力.本文拟就该通路在肾癌、膀胱癌、前列癌等泌尿系肿瘤中的研究进展进行综述.

摘要： 阿尔茨海默病(AD)是一种衰老相关的神经退行性疾病,主要病理特征是大脑中存在异常聚集的β淀粉样蛋白(Aβ).AD可分为家族性和散发性,其中早老蛋白1(PS1)是家族性AD最主要的风险基因,PS1突变占已知致家族性AD突变的80％以上.PS1是构成γ-分泌酶的催化亚基,后者负责加工Aβ前体蛋白(APP)生成Aβ.虽然新型PS1突变日渐被报道,但其诱发家族性AD的分子机制仍无定论.由于90％的PS1突变降低γ-分泌酶活性,学术界提出了PS1功能缺失性突变假说,认为PS1突变通过显性负效应导致PS1功能下降或缺失是诱发家族性AD的关键.近年,大量实验研究支持了该假说.首先,PS1功能缺失性突变通过干扰γ-分泌酶在APP上的切割位点促进长链Aβ生成,进而增加Aβ42/Aβ40比率;其次,PS1功能缺失性突变可破坏神经细胞内质网中的钙离子稳态以及通过阻断神经细胞自噬活性导致APP加工产物的异常聚集;再者,PS1功能缺失性突变可通过干扰神经元的内吞和转胞吞作用诱发神经元萎缩以及通过激活神经免疫细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)增强神经炎症;最后,PS1功能缺失性突变降低糖酵解和乳酸输出,破坏机体对神经元的能量供应.本文总结了PS1功能缺失性突变诱发家族性AD的分子机制,并对今后潜在的研究方向进行了探讨.

摘要： Acne inversa is a chronic inflammatory skin disease of the folliculo-sebaceous-apocrine unit.Currently,genetic and immunological factors are hot topics in the study of its pathogenesis.Genetic factors are mainly related to γ-secretase mutations,and abnormal expression of the γ-secretase-Notch axis leads to increased keratinization of hair follicles and inflammation in some patients with haploinsufficiency of the y-secretase gene.Mutations in the γ-secretase gene are not necessary for acne inversa,and the risk of Alzheimer's disease in familial acne inversa patients still remains unclear.Some progress has been made in researches on the association of genotype with phenotype in acne inversa patients,but further studies with large sample size are needed for verification.%反常性痤疮是毛囊-皮脂腺-顶泌汗腺单元的慢性炎症性皮肤病,遗传和免疫因素是目前发病机制研究的热点.遗传因素主要与γ分泌酶突变有关:在y分泌酶基因单倍体不足的遗传背景下,部分患者γ分泌酶-Notch轴表达异常,导致毛囊角化和炎症加剧.γ分泌酶基因突变并不一定引起反常性痤疮的发生,家族性反常性痤疮患者阿尔茨海默病的发病风险仍不清楚,基因型和表型的联系已取得一定的进展,但还需大样本研究的验证.

摘要： β-淀粉样蛋白(Aβ)被认为在阿尔兹海默病(AD)中扮演着重要角色.生成过多或降解减少,都会影响Aβ的沉积.在多种影响Aβ沉积的因素中,β-分泌酶、γ分泌酶、钙离子和脑啡肽酶对其影响较大并且日益受到重视.本文对近年来单味中药及其单体成分通过这四种途径影响Aβ沉积的实验研究进行了综述,以期为学者们后续的研究提供新思路.

摘要： γ-分泌酶复合体是一种大分子量膜整合蛋白酶复合体,包括早老素、单过性跨膜蛋白、前咽缺陷蛋白1和早老素增强子2四个亚基.γ-分泌酶能够切割多种I型跨膜蛋白,例如淀粉样蛋白前体蛋白、Notch受体、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白和血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1).γ-分泌酶通过影响Notch信号通路,改变基因的转录和表达,参与多种疾病的发生,如化脓性汗腺炎、阿尔茨海默病、心肌疾病、肿瘤及痴呆.本文综述了γ-分泌酶基因的分类、定位、功能以及与疾病表型的相关性.%γ-secretase is a kind of macromolecular membrane-integrated protease complex,including four subunits presenilin (PS),Nicastrin,(NCSTN), anterior-pharynx-defective-1(APH-1) and presenilin enhancer-2 (PEN-2). It can be used to cleave a variety of type I transmembrane proteins,such as amyloid precursor protein (APP), Notch receptor, N-cadherin and vascular endothelial growth factor receptor 1 (VEGFR-1). It has been found that γ-secretase affects the genes transcription and expression by affecting Notch signaling pathway and is involved in some diseases, such as suppurative sweat gland inflammation, Alzheimer's disease,cardiomyopathy,tumor and dementia. This paper summarizes the classification,locali-zation,function and relevance of the γ-secretase gene.

摘要： PEN-2蛋白(Presenilin enhancer protein 2)是一种与阿尔茨海默氏症(Alzheimer's Disease,AD)密切相关的蛋白.PEN-2在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色,它对于AD途径和Notch信号转导途径起着调节作用。为了研究PEN-2在阿尔茨海默氏症病理过程中的作用,我们以PEN-2为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白.我们发现PCBP4和GRK5肽段可结合PEN-2,并在酵母体系用β一半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用。这些结果指出PCBP4和GRK5可能在阿尔茨海默氏症的形成中有重要作用。

摘要： PEN-2蛋白(Presenilin enhancer protein 2)是一种与阿尔茨海默氏症(Alzheimer's Disease,AD)密切相关的蛋白.PEN-2在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色,它对于AD途径和Notch信号转导途径起着调节作用。为了研究PEN-2在阿尔茨海默氏症病理过程中的作用,我们以PEN-2为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白.我们发现PCBP4和GRK5肽段可结合PEN-2,并在酵母体系用β一半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用。这些结果指出PCBP4和GRK5可能在阿尔茨海默氏症的形成中有重要作用。

摘要： PEN-2蛋白(Presenilin enhancer protein 2)是一种与阿尔茨海默氏症(Alzheimer's Disease,AD)密切相关的蛋白.PEN-2在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色,它对于AD途径和Notch信号转导途径起着调节作用。为了研究PEN-2在阿尔茨海默氏症病理过程中的作用,我们以PEN-2为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白.我们发现PCBP4和GRK5肽段可结合PEN-2,并在酵母体系用β一半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用。这些结果指出PCBP4和GRK5可能在阿尔茨海默氏症的形成中有重要作用。

摘要： PEN-2蛋白(Presenilin enhancer protein 2)是一种与阿尔茨海默氏症(Alzheimer's Disease,AD)密切相关的蛋白.PEN-2在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色,它对于AD途径和Notch信号转导途径起着调节作用。为了研究PEN-2在阿尔茨海默氏症病理过程中的作用,我们以PEN-2为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白.我们发现PCBP4和GRK5肽段可结合PEN-2,并在酵母体系用β一半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用。这些结果指出PCBP4和GRK5可能在阿尔茨海默氏症的形成中有重要作用。

摘要： PEN-2蛋白(Presenilin enhancer protein 2)是一种与阿尔茨海默氏症(Alzheimer's Disease,AD)密切相关的蛋白.PEN-2在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色,它对于AD途径和Notch信号转导途径起着调节作用。为了研究PEN-2在阿尔茨海默氏症病理过程中的作用,我们以PEN-2为诱饵蛋白用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的蛋白.我们发现PCBP4和GRK5肽段可结合PEN-2,并在酵母体系用β一半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用。这些结果指出PCBP4和GRK5可能在阿尔茨海默氏症的形成中有重要作用。

摘要： 本发明公开了一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用基因重组技术将毕赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pGAPZ等系列衍生质粒连接，并与GOD共表达转化入Pichia pastoris GS115菌株中，考察其效果，并通过模块化组合优化，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活1972.9U/mL。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

摘要： 本发明公开了一种胞外分泌褐藻胶裂解酶和纤维素酶的重组解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程技术领域，本发明将褐藻胶裂解酶，纤维素酶编码基因与表达质粒连接，电转化入解淀粉芽孢杆菌中，获得重组解淀粉芽孢杆菌；培养重组解淀粉芽孢杆菌种子液，直接接种于海带渣培养基，添加氮源硫酸铵，发酵96小时，转化海带渣生产富含海藻寡糖和解淀粉芽孢杆菌的菌肥。本发明利用重组解淀粉芽孢杆菌发酵海带渣，简便快速的将其转化为富含寡糖和活性解淀粉芽孢杆菌的复合菌肥。本发明提供的复合菌肥，活性菌数比例高，富含新型生物刺激素‑‑海藻寡糖，将更好的促进植物生长和生根。本发明为海带渣在农业综合利用领域提供了新思路。

摘要： 本发明提供了一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用，所述褐藻胶裂解酶具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(II)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过1‑20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有褐藻胶裂解酶的活性。本发明中，将褐藻胶裂解酶全基因进行截短，降低分子量，显著提高了宿主细胞对褐藻胶裂解酶的表达量，分泌的褐藻胶裂解酶活性高、稳定性好、对褐藻酸钠的降解能力强。

摘要： 本发明公开一种诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌、细胞壁降解酶及抗芦笋茎枯病品种的筛选方法，属于生物技术领域。本发明提供的诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌为天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi，保藏编号为：CGMCC No.13874。本发明提供的诱导分泌高含量细胞壁降解酶的芦笋茎枯病菌可以诱导芦笋诱导分泌高含量防细胞壁降解酶，为抗病新品种选育和抗病品种合理布局服务。

摘要： 本发明提供了降低个体中前ADAM 10和/或BACE蛋白的水平的方法，该方法包括向有需要的个体给予杂环化合物或其药物可接受的盐、水合物或前药。

摘要： 本发明公开了一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用基因重组技术将毕赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pGAPZ等系列衍生质粒连接，并与GOD共表达转化入Pichia pastoris GS115菌株中，考察其效果，并通过模块化组合优化，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活1972.9U/mL。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

摘要： 本发明公开了一种改造蛋白折叠分泌途径增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用基因重组技术将毕赤酵母中KAR2、CNE1、ERO1、SSA4、SSO2、SEC53、BMH2、HRD1、UBC1、GCN4等基因分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pGAPZ等系列衍生质粒连接，并与GOD共表达转化入Pichia pastorisGS115菌株中，考察其效果，并通过模块化组合优化，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活1972.9U/mL。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

摘要： 本发明公开了一种胞外分泌褐藻胶裂解酶和纤维素酶的重组解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程技术领域，本发明将褐藻胶裂解酶，纤维素酶编码基因与表达质粒连接，电转化入解淀粉芽孢杆菌中，获得重组解淀粉芽孢杆菌；培养重组解淀粉芽孢杆菌种子液，直接接种于海带渣培养基，添加氮源硫酸铵，发酵96小时，转化海带渣生产富含海藻寡糖和解淀粉芽孢杆菌的菌肥。本发明利用重组解淀粉芽孢杆菌发酵海带渣，简便快速的将其转化为富含寡糖和活性解淀粉芽孢杆菌的复合菌肥。本发明提供的复合菌肥，活性菌数比例高，富含新型生物刺激素‑‑海藻寡糖，将更好的促进植物生长和生根。本发明为海带渣在农业综合利用领域提供了新思路。

摘要： 本发明提供了一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用，所述褐藻胶裂解酶具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(II)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过1‑20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有褐藻胶裂解酶的活性。本发明中，将褐藻胶裂解酶全基因进行截短，降低分子量，显著提高了宿主细胞对褐藻胶裂解酶的表达量，分泌的褐藻胶裂解酶活性高、稳定性好、对褐藻酸钠的降解能力强。

摘要： 本实用新型涉及海水加工的技术领域，具体为用于海水体快速分泌产生裂变活性酶的智能酶解装置，其提高了酶解的反应速率，对海水中的杂质进行过滤并清理，提高了海水酶解后的质量，提高了实用性；包括罐体、驱动电机、搅拌桶、清理电机和加酶装置，罐体内设置有腔室，驱动电机安装于罐体的底端，驱动电机的输出端连接有传动轴，传动轴自罐体的底端伸入至腔室内，搅拌桶的底端安装于传动轴的顶端，腔室的内侧壁顶部开设有环形滑槽，搅拌桶的外侧顶部安装有环形滑板，环形滑板环形滑槽内滑动连接，搅拌桶的内侧壁开设有多组过滤孔，搅拌桶的内侧壁等角度均匀安装有多组搅拌叶，搅拌桶的内侧底部开设有下开口，下开口内安装有收集箱。