基因工程菌

摘要： 紫色杆菌素是微生物以色氨酸分子为前体物质氧化缩合得到的一种非水溶性次级代谢产物,不仅可用做染色剂,还具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒及抗氧化等生物活性。目前,虽然Chromobacterium violaceum、Janthinobacterium lividum和Pseudoalteromonas luteoviolacea等被证实具有紫色杆菌素合成能力,由于紫色杆菌素合成机制复杂,涉及多酶级联反应,而且野生型菌株易形成无色突变体,导致紫色杆菌素产量不高,因此现阶段主要采取合成生物学和代谢工程手段在微生物宿主中进行异源生产。本文从紫色杆菌素合成基因簇的多样性、基因工程菌的构建以及工程菌生产途径的调控机制三方面具体介绍紫色杆菌素生产菌的构建及生产途径调控方面的研究进展,以期从微生物资源及基因来源等方面改善微生物菌株的紫色杆菌素生产能力,提出进行途径工程的调控策略,为实现紫色杆菌素产量规模化提供思路。

摘要： 为了解添加牦牛乳对大肠杆菌生长的影响,将采集的牦牛乳经冻干稀释后加入实验室常用基因工程菌BL21和DH5α的培养基中,通过体外菌液培养试验测定不同浓度牦牛乳对大肠杆菌生长的影响。结果表明:在氨苄青霉素抗性和无抗性的大肠杆菌BL21和DH5α培养过程中,外源加入5 mg/ml的牦牛乳对四种大肠杆菌的生长有促进作用。

摘要： 对基因工程菌Streptomyces bingchenggensis BCJ60的次级代谢产物化学成分及杀虫活性进行研究,采用正相硅胶柱层析、反向硅胶柱层析和Sephadex LH-20分离纯化,结合核磁共振、质谱等波谱学方法鉴定化合物结构,从中分离获得11个化合物,分别为3,4-dihydro-3-hydroxy-5-oxomilbemycin A3(1)、3,4-dihydro-3-hydroxy-5-oxomilbemycin A4(2)、seco-milbemycin C(3)、seco-milbemycin A(4)、米尔贝霉素H(5)、米尔贝霉素β13(6)、米尔贝霉素ST906(7)、米尔贝霉素β3(8)、25-ethylmilbemycinβ3(9)、米尔贝霉素β6(10)和米尔贝霉素β7(11)。其中化合物1和2为新化合物,杀虫活性结果显示,化合物1和2对朱砂叶螨(LC 50=0.121±0.010 mg/L和0.116±0.015 mg/L)和松材线虫(LC 50=5.217±0.064 mg/L和5.581±0.059 mg/L)具有显著的杀虫活性,与商品化的杀虫剂米尔贝霉素A3/A4相比没有显著性差异。

摘要： 选用色氨酸合成酶基因工程菌,催化底物L-丝氨酸和吲哚反应生成L-色氨酸,优化色氨酸吸附洗脱条件,提高L-色氨酸回收率。色氨酸合成酶大肠杆菌为菌种,用LB培养基培养,经过三代活化、发酵,再和底物反应,得到转化液。用层析法对转化液进行点样定性分析,用离子交换法分离,氨水洗脱717阳离子树脂吸附L-色氨酸,结晶得到L-色氨酸。试验结果表明:1 mL/min为吸附最优动态滴入速率,氨水体积分数为2 mol/L,氨水用量为20 mL,0.5 mL/min为洗脱最优动态滴入速率,动态实验下717树脂对L-色氨酸吸附和洗脱,L-色氨酸回收率为72.63%。

摘要： 本文在构建罗非鱼无乳链球菌病亚单位疫苗基因工程菌的基础上,针对中试生产环节,进一步开展基因工程菌高密度发酵及目标蛋白提取条件的研究,从发酵培养基的筛选、诱导剂的使用剂量、诱导时间,以及目标蛋白提取与纯化等方面优化工艺条件,以实现基因工程菌高密度培养和获得较高目标产物浓度的目的,进一步节约疫苗生产成本并提高产出效率,解决规模化生产决定性环节的问题,为基因工程疫苗走向产业化奠定基础。

摘要： 酿酒酵母具有安全、遗传背景清楚、生长速度快、高糖耐受性、高乙醇产量以及高胁迫耐受性等特性,是乙醇生产较为理想的细胞工厂.甘油是酿酒酵母发酵产乙醇过程中的一种主要伴生副产物,过量表达甘油影响糖醇转化率.通过基因工程改造甘油代谢和乙醇生产途径,是降低甘油产量和提高乙醇转化率的有效策略.首先分析改造酿酒酵母细胞中甘油和乙醇代谢路径,阐明甘油在酿酒酵母中生理功能;然后,根据甘油合成途径、分解途径和NAD+/NADH代谢途径,分析低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建的技术路径,比较各种基因改造策略对甘油合成和乙醇产率的影响;最后,针对基因整合技术、工程菌遗传稳定型以及工程菌代谢负担加重方面存在的问题,提出可供参考的解决方案,为构建酿酒酵母工程菌高效生产乙醇提供参考.

摘要： 当前农药污染问题已经对人们的生活环境产生影响,而生物降解技术在处理农药污染方面有着独特优势和发展前景.该研究首先介绍了农药残留生物降解的机理以及影响降解的因素;然后分别阐述微生物菌剂、酶制剂、工程菌剂以及微生物联合体、植物微生物联合等不同降解方式在农药残留方面的研究现状和具体应用,由于不同降解方式有其不同的降解特点,若把新技术与传统降解方式结合将会有新的突破;最后指出当前存在问题以及展望,如结合固定化技术、基因工程技术可以更好的发挥降解剂的效能,但在实际应用中也有一些问题仍待解决.生物降解剂在农业、工业、环境等领域的农药残留方面具有很大的研究潜力与应用前景,对了解农药残留生物降解剂有所帮助.

摘要： 基于子囊霉素的生物合成途径和机制,根据生物合成基因簇序列设计引物,应用PCR扩增游动放线菌(Antinoplanes sp.)N902-109赖氨酸合成途径关键基因——天冬氨酸激酶/天冬氨酸半醛脱氢酶/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(lysC/asd/ppc)基因,整合至子囊霉素产生菌株吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中,成功构建了过表达lysC/asd/ppc基因的重组工程菌,命名为AS-07.将AS-07工程菌进行摇瓶发酵研究,结果表明,与野生菌相比,子囊霉素的产量提高了25％.通过初步优化摇瓶发酵工艺,AS-07工程菌与野生菌相比,子囊霉素的产量提高了85％.

摘要： 通过基因重组技术构建重组苯乙烯单加氧酶基因的高产靛蓝色素大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli AB,研究优化工程菌E.coli AB生物合成靛蓝色素的发酵条件.单因素试验分别考察不同发酵温度、底物质量浓度、起始pH值和接种量4个因素对于靛蓝色素合成的影响,选取发酵温度、底物浓度和起始pH值3个对靛蓝色素产量影响显著的因素进行响应面设计试验优化.经模型分析获得优化发酵条件为:底物质量浓度0.95mg/mL,发酵温度29°C,起始pH6.9.在该条件下,工程菌E.coli AB催化合成靛蓝色素产量为67.65mg/mL.优化发酵条件的实验结果与预测值相符,说明回归模型切实可行.

摘要： 目的:优化核苷磷酸化酶(包括嘌呤和嘧啶核苷磷酸化酶)基因工程菌的发酵条件.方法:通过工程菌摇瓶培养,测定吸光度D值,考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白,SDS-PAGE电泳和凝胶成像扫描分析表达量,优化表达条件;通过正交试验优化50L发酵罐发酵条件.结果:摇瓶培养时当起始pH值为7.0～7.2,于30°C培养4hr,加入终浓度为0.4mmol/1的IPTG诱导8hr后收获菌体,可得到较高的生物量和重组酶蛋白表达量.IPTG诱导浓度和诱导开始时间对酶蛋白表达有显著影响.50L发酵罐正交试验显示IPTG诱导浓度和培养温度对蛋白表达量影响较大,试验结果显示50L发酵罐的最佳条件为:起始pH值为7.0～7.2,于32°C培4hr,加入终浓度为0.4mmol/1的IPTG诱导9hr后收获菌体,发酵结果:每升发酵液可得2g以上的酶蛋白.结论:基因工程菌发酵表达核苷磷酸化酶产量较高,可工业化生产,为酶法合成核苷酸类似物奠定了基础.

摘要： 目的:建立评价百日咳PT基因工程菌的检测方法.方法:对由CS株进行基因改构而构建百日咳PT基因工程菌和对照的CS菌种进行培养特性、血清学、主要抗原表型和卡那霉素抗性的检测比较,通过提取基因组DNA,对敲除FHA编码基因而插入PT编码基因的目的区域进行扩增,设计8个测序引物对回收扩增产物进行测序分析,与GeneBank公布的CS株PT基因序列进行比对.结果:百日咳PT基因工程菌保持了百日咳菌种的培养特性,为Ⅰ相血清型,表达PT、PRN和FIM2,3抗原,不表达FHA抗原,PT抗原表达量增加,显示卡那霉素抗性,基因测序表明改构区域基因序列与CS株PT基因序列完全一致.结论:百日咳PT基因工程菌能增加PT表达量,而不表达FHA,是用于组分纯化疫苗生产的理想菌种.

摘要： 在苏氨酸发酵生产过程中,经常会出现噬菌体污染苏氨酸基因工程菌的现象,从而影响生产效率,甚至直接导致发酵罐的发酵异常.本文从发酵生产过程中各个环节染菌对发酵水平影响展开叙述,并对发酵过程中染菌的种类及其原因进行了分析与讨论.

摘要： 生物吸附与降解是解决持久性有机污染物(POPs)最有潜力的方法之一,有必要介绍利用微生物把目标污染物转化为易降解的物质甚至矿化的POPs修复原理及其技术.对此,概述了近年来国内外基于微生物通过膜融合、胞质融合和核融合形成能够降解POPs的杂种细胞的细胞融合技术;基于降解性质粒的相容性,把能够降解不同污染物的质粒组合到一个菌种中,形成多质粒的新菌种,使微生物由于代谢途径的改变能够矿化POPs的基因工程菌构建技术;基于通过某些载体把酶固定于其中实现活性稳定、可以回收及可重复利用的酶固定化技术,以及基于降解菌活性酶分子亚基置换、降解菌活性酶的定点突变、降解酶的体外定向进化这几方面的酶构建技术;进一步分析基于分子生物学提高POPs生物修复能力的原理,指出经生物技术改造的工程菌和固定化酶未能进入实际应用的障碍所在.以多溴联苯醚(PBDEs)的微生物细胞吸收和降解机理作为典型POPs生物修复的案例,强调生物降解的过程强化需要建立多尺度上功能方面的适合;提出了分子生物学与基因工程学的结合在解决POPs环境污染方面未来的基础科学问题与研究思路.综合上述.典型POPs的生物修复技术的构建需要考虑宏观污染物协同降解的工艺理论,在基因水平、分子水平、反应器水平及工程水平上追求更高功能方面的适合.

摘要： 在众多的纺织纤维中,麻类纤维是极具发展潜力的绿色环保纤维.然而,作为麻类纤维原料的原麻中含有大量的胶质,如果胶、半纤维素、木质素和蜡脂质等,不能直接用于纺纱工艺,必须经脱胶处理才能进行后续加工.麻脱胶是一个复杂的提取麻纤维的过程.从环境保护角度考虑,生物脱胶被认为是能够取代耗能大、效率低、污染严重的传统脱胶工艺的极有发展前途的一种方法.用基因工程菌产生的碱性果胶酶处理代替碱对麻织物进行煮练加工和整理工艺,以去除初生胞壁中的果胶物质,在比较缓和的pH值和温度条件下使织物手感柔软,强度高,而且还能避免因微生物处理造成的纤维素的降解.

摘要： 中性内切纤维素酶在纺织及造纸工业具有重要的应用.通过单因素方法结合析因设计对基因工程菌GS 115-pPIC9K-eg Ⅰ的产酶条件进行优化,发酵酶活力为278.28±8.67U/mL,较优化前提高了74％.对工程菌GS 115-pPIC9K-eg Ⅱ的培养体系进行优化，发酵酶活力可达4205.88±9.87U/mL。15L发酵罐进行放大培养，蛋白含量为1378ug/ml，最终酶活力高达32529U/mL，提高了7.8倍，比活提高了2.15倍。本文通过(NH4)2SO4盐析、透析、浓缩和Q Sepharose Fast Flow离子交换进行纯化，纯化倍数为1.8倍，回收率为18.3%。该内切纤维素酶相对分子质量约为46KD、最适反应温度为70°C，热稳定性较好，60°C保温30min仍能保留80%以上的活力;在pH 6.0-7.0有较高的稳定性，最适反应pH为6.5;Fe3+,Li+对其有激活作用，而K+,Ca2+,Cu2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Al3+对酶具有不同程度的抑制作用，Mg2+,Na+,Ba2+对其影响不大。

摘要： 以安普霉素生物合成基因aprJ为靶标,克隆其上下游序列作为同源交换臂,构建重组质粒pFJ401,利用接合转移技术将其导入S.tenebrarius Tt-49,获得一株工程菌TX302(△aprJ).代谢产物分析表明,工程菌总效价略有下降,约为出发菌株的85％。质谱检测结果显示,安普霉素的合成已被成功阻断,工程菌TX302主产氨甲酰妥布霉素。

摘要： 氨基葡萄糖及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖作为化妆品、食品添加剂和药物原料被广泛应用.近年来,由于其在预防和治疗骨关节疾病中的广阔应用前景而被广泛关注.目前,氨基葡萄糖的生产主要通过甲壳素酸解法,由于此方法具有受原料取材限制、设备要求较高及环境污染的诸多缺点.近年来微生物发酵法受到越来越多学者的青睐.本文介绍了近年来氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖生产的研究进展.

摘要： 氨基葡萄糖及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖作为化妆品、食品添加剂和药物原料被广泛应用.近年来,由于其在预防和治疗骨关节疾病中的广阔应用前景而被广泛关注.目前,氨基葡萄糖的生产主要通过甲壳素酸解法,由于此方法具有受原料取材限制、设备要求较高及环境污染的诸多缺点.近年来微生物发酵法受到越来越多学者的青睐.本文介绍了近年来氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖生产的研究进展.

摘要： 本发明公开了一种青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌的应用，所述方法为：获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；将PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体；将该超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，得到青霉基因工程菌。本发明获得的青霉工程菌产脂肪酶能力强，青霉工程菌制备的脂肪酶酶活比出发菌青霉野生菌提高了100％～150％。

摘要： 本发明公开了一种腈水合酶基因工程菌的构建方法，主要是利用诺卡氏菌/红球菌-大肠杆菌穿梭质粒在诺卡氏菌/红球菌和大肠杆菌中都能复制的特点构建能高表达腈水合酶的重组穿梭质粒，然后用电穿孔法转化诺卡氏菌和紫红红球菌宿主获得基因重组诺卡氏菌和基因重组紫红红球菌。应用该方法构建了能高表达腈水合酶的诺卡氏菌TH-1和紫红红球菌TH-2，该菌株能高表达腈水合酶，并且酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本发明还公开了利用基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，用该方法生产的丙烯酰胺质量高。

摘要： 本发明公开了一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶。本发明的基因工程菌的制备方法包括：去除壳聚糖酶编码基因csn信号肽编码序列；将芽孢杆菌信号肽编码序列连接csn，插入大肠杆菌‑芽孢杆菌穿梭载体，并转入芽孢杆菌中，即可获得能够大量分泌表达重组壳聚糖酶蛋白的基因工程菌。将基因工程菌在适宜条件下培养后可大量分泌重组壳聚糖酶，通过简单醇沉及亲和层析即可获得高纯度的重组壳聚糖酶。本发明制备壳聚糖酶的工艺简单，适于工业放大，可广泛应用于食品、药品、生物等领域。

摘要： 本发明公开了一种L‑天冬氨酸酶基因工程菌发酵培养基及发酵培养L‑天冬氨酸酶基因工程菌方法，其中，培养基包括以下质量浓度的组分：酵母粉2‑10g/L、蛋白胨5‑20g/L、乳糖1‑10g/L、氯化钠1‑10g/L、黄豆饼粉1‑15g/L、玉米浆1‑5g/L、籼米粉0.5‑5g/L、钼酸铵0.5‑2g/L、钴盐0.5‑10mg/L、通过本发明公开的技术方案培养L‑天冬氨酸酶基因工程菌，不仅菌细胞密度大，且L‑天冬氨酸酶基因工程菌增殖快速，细胞浓度较高。

摘要： 本发明公开了一种基因工程菌生产β‑胡萝卜素的方法及其基因工程菌。该基因工程菌是一种含有carRA基因和carB基因的耶罗维解脂酵母(Yarrowia lipotica)基因工程菌。本发明通过基因工程方法向耶罗维解脂酵母引入来源于三孢布拉霉(Blakeslea trispora)carRA基因和carB基因，进一步增强双香儿基焦磷酸合酶(GGS)和3‑羟基3‑甲基乙酰辅酶A还原酶(HMG‑CoAcata reductase)的表达，敲除3‑磷酸甘油脱氢酶(Gut2)与过氧化物酶(Pox2)，获得了异源表达β‑胡萝卜素的耶罗维解脂酵母菌株，发酵条件简单，β‑胡萝卜素产量较高，具有重要的生产价值。

摘要： 本发明公开了一种青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌的应用，所述方法为：获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；将PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体；将该超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，得到青霉基因工程菌。本发明获得的青霉工程菌产脂肪酶能力强，青霉工程菌制备的脂肪酶酶活比出发菌青霉野生菌提高了100％～150％。

摘要： 本发明公开了一种腈水合酶基因工程菌的构建方法，主要是利用诺卡氏菌/红球菌－大肠杆菌穿梭质粒在诺卡氏菌/红球菌和大肠杆菌中都能复制的特点构建能高表达腈水合酶的重组穿梭质粒，然后用电穿孔法转化诺卡氏菌和紫红红球菌宿主获得基因重组诺卡氏菌和基因重组紫红红球菌。应用该方法构建了能高表达腈水合酶的诺卡氏菌TH－1和紫红红球菌TH－2，该菌株能高表达腈水合酶，并且酶活水平高，热稳定性好，对丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本发明还公开了利用基因工程菌株生产丙烯酰胺的方法，用该方法生产的丙烯酰胺质量高。

摘要： 本发明公开了一种高效分泌Nisin的基因工程菌构建方法及其工程菌和应用，本发明属于工业微生物技术领域。本发明通过来源于质粒pUC57的前乳链菌肽基因nisA和抗Nisin基因nisI、来源于乳酸乳球菌CICC6242的参与Nisin表达的调控基因nisRK及其自有启动子组成的重组质粒pNZ8148‑AIRK单重转化乳酸乳球菌CICC6242提高Nisin产量，转化过程简单，工程量小且获得的重组工程菌Nisin产量显著提高，从而在工业化生产乳酸链球菌素中具有重要价值，应用前景广阔。

摘要： 本发明涉及希瓦氏菌EPA合成基因簇及含该基因簇的基因工程菌。本发明获得了包含希瓦氏菌shewanella piezotolerans WP3的EPA合成基因簇的大肠杆菌基因工程菌并确定了基因簇负责EPA在WP3中的合成，该EPA合成基因簇包含有一个磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)基因和pfaA，B，C，D基因，基因转录量受到PfaA上游Fis型转录调控因子的调控。低温和高压条件能导致其提高EPA的合成。

摘要： 本发明提供了一种基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途，该基因工程菌株包括如下两种形式中一种：a、敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因；b、在敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因的基础上进一步敲除了绿针假单胞菌基因组中的pykF基因。该培养方法为无痕敲除绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因或绿针假单胞菌基因组中的pykF基因。该基因工程菌株可以用于2,3‑二氢‑3‑羟基邻氨基苯甲酸中的制备。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、用于生产DHHA的菌株为绿针假单胞菌，至今未有致病性的报道，因此其环境友好，安全可靠；2、DHHA为GP72的天然代谢中间体，无需外源基因的引入，因此更加安全可靠。