RT-LAMP

摘要： 猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspot-associated virus,AcCRaV)是侵染猕猴桃的主要病毒之一.为实现对猕猴桃中AcCRaV的快速检测和监控,本研究建立了一种逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)结合横向流动试纸条(LFD)的检测方法,可实现快速、可视化检测猕猴桃中AcCRaV.本研究基于AcCRaV外壳蛋白基因保守区域,设计了一套LAMP特异性引物,优化后的反应体系在62°C恒温条件下,反应60 min,再进行5 min试纸条显色反应,即可完成样品的检测.检测灵敏性实验结果表明,建立的RT-LAMP-LFD方法具有较高的灵敏性,其检测灵敏度是常规RT-PCR的100倍.二者检测结果一致,LFD试纸条实现了检测结果的可视化.总之,该检测方法可为检测猕猴桃中AcCRaV感染状况提供了一种省时、高效的诊断方法.

摘要： As a matter of fact, infectious diseases hamper everyone’s life and produce a lifelong threat to everyone neutral of age, sex, lifestyle and socio-economic status. Nowadays, come into the sight of Chikungunya viral (CHIKV) infection injured many Asian and African countries, also deliberated threat in rising countries and also low socio-economic countries. CHIKV is a positive-sense, enveloped single-stranded, RNA virus belonging to the genus Alphavirus, family Togaviridae. As the Dengue & Chikungunya viruses are spread simultaneously at the same time, so it is tough to identify them. In our resource-limited countries, swift detection of CHIKV by RT-LAMP is the simplest molecular technique in low-equipment settings without the use of any expensive decoration. Heat-treated centrifuged and uncentrifuged samples were used in this study and they showed the same result (100%). Different instruments like heat block, water bath, conventional thermal cycler & real-time thermal cycler were used to amplify the CHIKV RNA and they indicated that 100% samples were identified by all four instruments. The amplified products were visualized by turbidity test, color change by HNB, step-ladder band pattern in agarose gel electrophoresis and amplification curve in real-time thermal cycler naked eye, here the results also showed 100% samples were determined by all visualized methods. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) is a recent technique for amplifying RNA under limited temperature, with high tangibility, quickness and competency. To identify the CHIKV RNA Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification was fabricated and validated, and the results were also compared with reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The sensitivity was 95.71% and specificity was 100%, these results indicate that RT-LAMP is a feasible method for quick detection of CHIKV RNA.

摘要： 芜菁黄化花叶病毒(Turnipyellow mosaic virus, TYMV)是芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)的代表种,该病毒侵染白菜能够引起黄化、花叶和皱缩等症状,给白菜产业造成巨大的影响。在此,我们建立了反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术来检测白菜中的TYMV。针对TYMV分离株中保守的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因的区域设计的RT-LAMP检测引物。优化后的RT-LAMP方法对TYMV的检测具有特异性和灵敏度,灵敏度比RT-PCR高10,000倍。这种简单、高效、快速和灵敏的方法能够应用于白菜中TYMV的检测。

摘要： 为建立可视化一步RT-LAMP检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据GenBank中的BVDV的5′UTR序列,设计2组RT-LAMP引物,经过反应温度、反应时间、Mg^(2+)和甜菜碱的终浓度的优化,特异性及灵敏性试验,对3种常用显色指示剂钙黄绿素-MnCl_(2)、羟基萘酚蓝和中性红的显色效果进行评估,并使用商品化ELISA试剂盒与本方法进行对照试验。结果显示,经优化本方法在66°C30 min即可完成反应,采用中性红作为显色指示剂,检测BVDV可产生特异阳性反应;对BVDV RNA检测下限最低达0.021 pg/μL;对13份临床样品检测结果与商品化ELISA检测试剂盒相符率100%。结果表明,所建立的BVDV可视化一步RT-LAMP检测方法的特异性、灵敏性较好,可为BVDV临床快速检测提供帮助。

摘要： 本研究旨在建立针对中国流行蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.根据我国分离BTV毒株Seg5基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化反应条件及反应体系,进行特异性及灵敏度验证,建立BTV RT-LAMP检测方法;对46株中国分离的12种血清型BTV (BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24)代表毒株进行检测,进一步对120份BTV核酸阳性血液样品及60份2020年采集自监控动物的临床血液样品进行BTV的RT LAMP及qRT-PCR检测,验证建立的RT LAMP检测方法的准确性和可靠性.试验结果表明,本研究建立的RT-LAMP方法最佳反应条件为64°C,扩增45 min;反应体系中外引物∶内引物:环引物的最佳浓度及比例为0.2 μmol·L-1∶0.6μmol·L-1∶0.4 μmol·L-1.该方法可特异性检测中国流行的12种血清型BTV核酸,与动物流行性出血病病毒(EHDV)、中山病毒(CHUV)、阿卡斑病毒(AKAV)、口蹄疫病毒(FMDV)及非洲马瘟病毒(AHSV)核酸均无交叉扩增现象;最低可检测4.5拷贝·μL-1的BTV核酸.对46株分属12种血清型的BTV代表毒株的检测结果均为阳性;120份BTV核酸阳性血液样品的检测结果与qRT-PCR检测结果无显著差别(McNemar检验P＞0.05),符合率为95.0％;60份临床血液样品的检测结果与qRT-PCR结果完全一致,以上结果表明本研究建立的RT-LAMP方法准确可靠,对中国分离的BTV毒株及临床血液样品均具有良好的检测效果.本研究建立的BTV RT-LAMP检测方法具有反应快速、结果可视化、特异性强和敏感度高等优点,为我国开展BTV检测诊断与流行病学研究提供了技术支持,具有较好的应用前景.

摘要： 为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法.结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度为61°C,反应时间为50min,Mg2+和dNTPs浓度分别为8.0mmol/L和4.0mmol/L,外引物和内引物最佳浓度比为1∶4.特异性试验结果显示,该方法只能检测出PEDV,对其他病原检测均为阴性,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10-5 mg/L,而常规RT-PCR能检测到最低浓度为6.52×10-3 mg/L,表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍;重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验结果无明显差异,重复性较好.利用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对3份已知阳性样品,5份已知阴性样品以及52份未知临床样品进行检测.阳性样品经RT-LAMP和RT-PCR方法均检测到PEDV,阴性样品均未检测到PEDV.52份临床样品中,RT-LAMP对PEDV检测阳性率为23.08％(12/52);RT-PCR检测阳性率为17.31％(9/52),二者的符合率为94.23％.以上结果表明,建立的RT-LAMP方法具有成本低、检测快、灵敏度高、特异性强等优点.且结果易于判定、便于现场检测,在病原检测方面具有良好的应用前景,为该病的流行病学调查及综合防制提供重要的实验依据.

摘要： 帕利亚姆病毒(PALV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,为建立PALV可视化反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究根据我国分离的PALV株Seg-7基因序列设计特异性引物,优化反应条件,初步建立PALV的RT-LAMP检测方法.该方法的最佳反应温度为60C～64°C,最佳扩增时间为45 min;引物的最佳浓度为0.2 μmol/L(外引物)、0.8 μmol/L(内引物)、0.6 μmol/L(环引物).利用该方法检测PALV,蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、阿卡斑病毒、口蹄疫病毒及非洲马瘟病毒,结果显示除PALV是阳性扩增结果外,其他病毒均无扩增反应,表明该方法特异性较强;将PALV Seg-7 ssRNA 10倍倍比稀释后作为模板,分别进行RT-LAMP、RT-PCR与qRT-PCR检测,结果显示RT-LAMP及qRT-PCR的检测限均为23.7拷贝/μL,比一步法RT-PCR高10倍.利用该方法对我国分离的21株不同血清型PALV株和21份PALV阳性血液检测,结果均为阳性;取40份采自哨兵牛的血液样品分别进行PALV的RT-LAMP与qRT-PCR检测,结果显示两种方法均检测到8份PALV核酸阳性样品,符合率为100％.本研究首次建立了PALV RT-LAMP检测方法,其特异性强、敏感性高、反应时间短、结果可视化,为我国开展PALV现场快速检测及其流行病学研究提供了技术支持.

摘要： 为快速检测罗湖病毒(tilapia lake virus,TiLV),根据TiLV编码RNA聚合酶的片段1,设计了6条特异性引物,通过对反应体系优化,建立了检测TiLV的RT-LAMP方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行了评价.结果显示:该方法特异性好,仅能够对TiLV进行特异性扩增,对真鲷虹彩病毒等10种鱼类常见病毒扩增均呈阴性;灵敏度为2.5×10-7 ng/μL,且30 min即可得到试验结果;两组重复试验显示,该方法重复性良好,且熔解曲线相一致.结果表明,成功建立了快速检测TiLV的RT-LAMP方法.本研究为快速诊断、监测TiLV提供了技术支撑.

摘要： 马铃薯卷叶病毒是一种极具特点的病毒体,其会对马铃薯造成极大的危害,这种病毒在检测时,最长用到的就是RT-LAMP检测法,这方面获取的检测结果更加精确,且操作的成本较低,应用范围较广,而如何建立马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法,是一项技术性的问题,也是检测此类病毒的关键所在.要想建立起检测马铃薯卷叶病毒的RT-LAMP检测方法,要从多个角度进行考虑,而此次研究将以PLRVCP基因ORF3保守序列为靶标,以此来构建PLRV反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测方法,并重点探究该项检测方法的特异性以及应用效果,从而进行评估.

摘要： 为补充现有传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)分子生物学检测手段的不足,本研究以Genbank IPNV基因组中编码A片段多聚蛋白的核苷酸序列为靶序列,针对目标序列的6个区域设计了1对RT-LAMP内引物及1对RT-LAMP外引物。通过优化RT-LAMP方法的退火温度、反应时间等反应条件,同时进行了灵敏度试验及特异性试验,建立了IPNV RT-LAMP检测技术。试验结果为:通过优化各反应条件,结果退火温度为62°C、反应时间为45 min时为IPNV RT-LAMP最佳反应条件;特异性试验显示该方法只与目标病原IPNV有扩增反应,与其他水生动物病原无交叉反应,说明该方法具有良好的特异性;灵敏性试验显示该方法能够检测IPNV RNA的低限为0.01 pg RNA,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,表明本技术具备较高的灵敏度。试验结果表明,本研究建立的IPNV RT-LAMP技术特异性强、敏感性高、操作简便、反应快速,可通过肉眼判定结果,该方法特别适用于传染性胰脏坏死病的现场及野外检测与诊断,为传染性胰脏坏死病的检测及监测提供了重要的技术手段。

摘要： 针对CSFV的保守区设计并筛选出一套RT-LAMP引物,以石门株为标准毒株,采用梯度稀释法对各反应要素进行优化.最终确定CSFV RT-LAMP的反应体系为:4mM镁离子浓度,0．8 M甜菜碱,1．4 mM dNTP mix,8 U Bst DNA大片段聚合酶,2 U AMV反转录酶,5 pM F3,5 pM B3,50 pM FIP,50 pM BIP,25 pM LF,25 pM LB,1×Thermo butter,μl RNA;反应条件为63°C45min;80°C 10min.RT-LAMP反应可在普通水浴锅或恒温箱里完成,产物经琼脂糖凝胶电泳可见大小片段不等的斑马纹样条带;反应同时产生大量白色副产物,混浊可辨,离心后沉于管底形成白色沉淀物.特异性试验及酶切鉴定证明该方法具有很好的特异性.灵敏度试验显示该方法的灵敏度比常规RT-PCR高两个数量级.

摘要： 针对CSFV的保守区设计并筛选出一套RT-LAMP引物,以石门株为标准毒株,采用梯度稀释法对各反应要素进行优化.最终确定CSFV RT-LAMP的反应体系为:4mM镁离子浓度,0．8 M甜菜碱,1．4 mM dNTP mix,8 U Bst DNA大片段聚合酶,2 U AMV反转录酶,5 pM F3,5 pM B3,50 pM FIP,50 pM BIP,25 pM LF,25 pM LB,1×Thermo butter,μl RNA;反应条件为63°C45min;80°C 10min.RT-LAMP反应可在普通水浴锅或恒温箱里完成,产物经琼脂糖凝胶电泳可见大小片段不等的斑马纹样条带;反应同时产生大量白色副产物,混浊可辨,离心后沉于管底形成白色沉淀物.特异性试验及酶切鉴定证明该方法具有很好的特异性.灵敏度试验显示该方法的灵敏度比常规RT-PCR高两个数量级.

摘要： 针对CSFV的保守区设计并筛选出一套RT-LAMP引物,以石门株为标准毒株,采用梯度稀释法对各反应要素进行优化.最终确定CSFV RT-LAMP的反应体系为:4mM镁离子浓度,0．8 M甜菜碱,1．4 mM dNTP mix,8 U Bst DNA大片段聚合酶,2 U AMV反转录酶,5 pM F3,5 pM B3,50 pM FIP,50 pM BIP,25 pM LF,25 pM LB,1×Thermo butter,μl RNA;反应条件为63°C45min;80°C 10min.RT-LAMP反应可在普通水浴锅或恒温箱里完成,产物经琼脂糖凝胶电泳可见大小片段不等的斑马纹样条带;反应同时产生大量白色副产物,混浊可辨,离心后沉于管底形成白色沉淀物.特异性试验及酶切鉴定证明该方法具有很好的特异性.灵敏度试验显示该方法的灵敏度比常规RT-PCR高两个数量级.