一种检测中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的SNP位点基因型的试剂及其应用

摘要

本发明公开了一种检测中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的SNP位点基因型的试剂及其应用。本发明公开了中国荷斯坦奶牛的PPP1R15A基因外显子3的第250个碱基处的SNP位点，所述位点的TT基因型的样本的乳脂和干物质含量，显著高于AT基因型的样本。所述位点在群体中遗传多态性丰富，分布均匀，遗传稳定，所表达的性状能稳定保留。本发明构建核苷酸序列如SEQ ID NO：1和2所示的引物，检测所述SNP位点，制备试剂盒，用于评价中国荷斯坦奶牛乳品质中乳脂和干物质性状，为中国荷斯坦奶牛育种挑选出优良乳品质的奶牛品种。

说明书

技术领域

本发明涉及奶牛性状分析技术领域，具体地，涉及一种检测中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的SNP位点基因型的试剂及其应用。

背景技术

中国荷斯坦奶牛是由中国的黄牛与荷斯坦奶牛杂交并经过长期选育而成的品种，泌乳系统发育良好，可肉乳兼用，也是目前我国养殖最多的奶牛品种。

牛奶中与乳品质相关的性状有乳脂、乳蛋白质、乳糖、体细胞数和尿素氮等，乳品质相关的性状有不同的调控方法，其中通过研究基因对调控奶牛乳脂的合成具有重大影响。

磷酸酶(phosphatase)对许多生物学功能至关重要，因为磷酸化(通过蛋白激酶)和去磷酸化(通过磷酸酶)在细胞调节和信号传导中起着至关重要作用，与肥胖、糖尿病、癌症、神经退行性等疾病有着千丝万缕的联系。PPP1R15A是一种蛋白质编码基因，也叫GADD34，是PTP家族的一员，而PPP1R15A的过量表达可能导致蛋白质的错误折叠，针对错误折叠蛋白质的异常积累，细胞会启动保护机制，使真核翻译启动因子2(Eukaryotictranslation initiator 2,eIF2)暂时性磷酸化，减少蛋白质错误折叠。磷酸化的eIF2减少蛋白合成，阻止错误折叠蛋白质在内质网中的积累。因此，抑制PPP1R15A可以延长eIF2的磷酸化，有利于治疗与蛋白质错误折叠相关的疾病。有一种叫guanabenz的抗高血压药物可以延长eIF2的磷酸化时间，并抑制PPP1R15A的信号传导。研究人员将该药物作为先导化合物研究，但是长时间追踪发现，guanabenz会导致小鼠神经系统紊乱，不良反应较大，于是被放弃了。之后Das等人合成guanabenz的衍生物Sep hin 1，发现它能够抑制PPP1R15A的信号转导，纠正这种蛋白质错误折叠。该药有良好的药物动力学参数，并且靶向中枢神经与外周神经系统。Sephin1是内质网应激诱导的PPP1R15A的选择性抑制剂，靶向治疗与错误折叠蛋白的积累相关的疾病。目前国内外对PPP1R115A基因多集中在肿瘤、癌症相关的研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种检测中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的SNP位点基因型的试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种检测中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的SNP位点的基因型的试剂。

本发明的第二个目的是提供一种检测所述SNP位点的基因型的引物。

本发明的第三个目的是提供所述的试剂，或所述的引物中的任意一种或几种在评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述的试剂，或所述的引物中的任意一种或几种在中国荷斯坦奶牛育种中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述的试剂，或所述的引物中的任意一种或几种在制备评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的方法。

本发明的第七个目的是提供一种评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种检测中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的SNP位点的基因型的试剂，所述SNP位点位于PPP1R15A基因外显子3的第250个碱基处，所述PPP1R15A基因在Ensemble中的编号为ENSBTAT00000001702.6。

进一步地，所述试剂为引物。

进一步地，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和2所示。

一种检测所述SNP位点的基因型的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和2所示。

所述的试剂，或所述的引物中的任意一种或几种在评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状中的应用。

进一步地，所述乳品质相关的性状为乳脂和干物质含量。

所述的试剂，或所述的引物中的任意一种或几种在中国荷斯坦奶牛育种中的应用。

所述的试剂，或所述的引物中的任意一种或几种在制备评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的试剂盒中的应用。

进一步地，所述乳品质相关的性状为乳脂和干物质含量。

一种评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的方法，检测位于PPP1R15A基因外显子3的第250个碱基的SNP位点的基因型，

SNP位点的基因型为TT的样本的乳脂和干物质含量，显著高于基因型为AT的样本；

所述PPP1R15A基因在Ensemble中的编号为ENSBTAT00000001702.6。

一种评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的试剂盒，所述试剂盒含有所述的引物。

进一步地，所述试剂盒还含有PCR试剂。

进一步地，所述PCR试剂为Taq PCR Master Mix(2×red dye)和ddH

其使用方法为：

以中国荷斯坦奶牛血液基因组DNA混池为DNA模板，进行PCR扩增，

其中总体积为20μL的PCR扩增体系由DNA模板1.0μL、上下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物)各0.5μL、Taq PCR Master Mix(2×red dye)10μL和ddH

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min；

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测确认目的片段正确后，进行测序，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SNP位点位于所述扩增产物第386个碱基处，为A单峰，样本基因型为AA，为T单峰，样本基因型为TT，为A/T重叠峰，样本基因型为AT；

SNP位点的基因型为TT的样本，其中国荷斯坦奶牛个体的乳脂和干物质含量，显著高于基因型为AT的中国荷斯坦奶牛个体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了中国荷斯坦奶牛的磷酸酶1调节亚基15A(protein phosphatase1,regulatory subunit 15A，PPP1R15A)基因的外显子3的第250个碱基的SNP位点E3-250 T>A。所述SNP位点存在三个基因型，分别为AA、AT和TT；所述SNP位点的TT基因型的样本的乳脂和干物质含量，显著高于AT基因型的样本。

所述SNP位点的基因杂合度(H)和多态信息含量(PIC)均处在0.25～0.50之间，这一结果表明E3-250 T>A位点在群体中表现为中度多态，杂合度较高，保障中国荷斯坦奶牛种群的多样性，遗传多态性较丰富。有效等位基因数(Ne)为1.8000，该位点有2个等位基因，说明所述SNP位点基因在群体中分布均匀。卡方检验(2)结果表明，所述SNP位点在中国荷斯坦奶牛群体中处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)，表明所述SNP位点在中国荷斯坦奶牛群体保持一个相对稳定的基因库，遗传稳定。所述SNP位点表达出利于中国荷斯坦奶牛生产性能的优势性状，能稳定保留下来。

本发明构建核苷酸序列如SEQ ID NO：1和2所示的引物，检测所述SNP位点，制备试剂盒，用于评价中国荷斯坦奶牛乳品质中脂肪和干物质性状，为中国荷斯坦奶牛育种挑选出乳品质高的奶牛品种，为奶牛PPP1R15A基因生物学功能研究和优质奶牛选育提供分子理论依据。

附图说明

图1为中国荷斯坦奶牛PPP1R15A基因混池PCR扩增产物电泳图。其中M为DL-2000DNA Marker，泳道1～3为PCR产物电泳结果。

图2为中国荷斯坦奶牛PPP1R15A基因混池PCR扩增产物测序结果图。

图3为中国荷斯坦奶牛个体PCR扩增产物电泳图。其中M为DL-5000DNA Marker，泳道1～14为PCR产物电泳结果。

图4为PPP1R15A基因E3-250 T＞A 3种基因型的测序图。Ⅰ～Ⅲ基因型分别为AA、AT和TT个体。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

1、实验动物与血液样品DNA采集

本实验采用89头中国荷斯坦奶牛为实验对象，实验牛群饲养于黑龙江牛场且均采用同一饲养管理水平，血液样品取自牛尾统一部位静脉血，用试剂盒提取血液DNA，后置于-80℃冰箱保存备用。

2、主要的仪器设备

-20℃冰箱；-80℃超低温冰箱、HL-300制冰机(SANYO)；TGear微型离心机(北京天根科技)；电泳仪(北京六一)；Nano-Drop 2000、高速台式离心机(Thermo)；LX系列400小型离心机(北美离心机)；伯乐T100梯度PCR仪(Bio-Rad)；凝胶成像分析系统(Tannon)。

3、主要的试剂

血液DNA提取试剂盒(天根)；Taq PCR Master Mix(2×red dye)；DL2000DNAMarker(TaKaRa)；琼脂糖(博格林生物)；TAE缓冲液；4S GelBlue核酸染料(生工生物工程)。

实施例1引物设计、扩增及测序鉴定基因型

一、实验方法

1、引物的设计

根据Ensemble中公布的牛PPP1R15A基因序列(ENSBTAT00000001702.6)，使用primer5.0软件对PPP1R15A基因进行引物设计，其上游引物序列为：5’-GGCAAGATAACAAGCCAGATG-3’(SEQ ID NO：1)，下游引物序列：5’-CACACGGAGACGCTACTTACTAC-3’(SEQ ID NO：2)。

2、混池DNA扩增及测序

以89头中国荷斯坦奶牛血液基因组DNA混池为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系(总体积为20μL)：DNA模板1.0μL，上下游引物各0.5μL，Taq PCR Master Mix(2×red dye)10μL，ddH

3、对中国荷斯坦奶牛个体的血液DNA进行PCR扩增和测序，确定PPP1R15A基因突变位点和基因型，PCR扩增方法同实施例1步骤2。

二、实验结果

1、图1是用凝胶成像分析系统拍照而成的显示图，引物扩增PCR产物条带大小为573bp，引物扩增PCR产物呈现一条明亮清晰的条带，没有出现拖尾、弥散、抹带、模糊和引物二聚体等情况，表明目的基因状况良好。扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2、使用Chromas软件对目的基因的测序结果进行观察，结果发现基因峰形图有一处明显的重叠峰，即在PPP1R15A基因外显子3第250个碱基有一处突变位点，其碱基T突变为A，即为E3-250 T>A位点，基因峰形结果见图2。

3、图3是部分中国荷斯坦奶牛个体PCR产物电泳检测结果，每个个体PCR产物电泳条带清晰，无拖尾、弥散、抹带、模糊和引物二聚体等情况，PCR产物扩增特异性效果良好。PPP1R15A基因E3-250 T>A位点(即NC_037345.1:55477445，ARS-UCD1.2版牛基因组的第18染色体的第55477445位，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的扩增产物的第386位碱基)共有三种不同基因型，分别是AA、AT和TT，基因峰形结果见图4。

实施例2SNP位点遗传效应分析

一、实验方法

对实施例1的89头中国荷斯坦奶牛个体的测序结果进行计算分析，对实施例1确定的PPP1R15A基因E3-250 T>A位点的基因频率、基因型频率、基因杂合度(H)、多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)和卡方值(2)进行数据统计分析，各计算公式如下：

1、等位基因频率的计算公式：

P(A)＝(2AA+Aa)/2N；P(a)＝(2aa+Aa)/2N

其中P(A)表示等位基因A的基因频率，A表示等位基因，P(a)表示等位基因a的基因频率，a表示等位基因。

2、基因型频率的计算公式：

P(AA)＝AA/N；P(Aa)和P(aa)同理

P(AA)表示基因型AA的基因型频率，P(Aa)表示基因型Aa的基因型频率，P(aa)表示基因型aa的基因型频率；AA表示AA基因型的个数，Aa表示Aa基因型的个数，aa表示aa基因型的个数，N表示群体总数。。

3、基因杂合度计算公式：

n表示等位基因数；Pi表示第i个等位基因频率。

4、多态信息含量的计算公式：

n表示等位基因数，Pi表示第i个等位基因的频率，，Pj表示第j个等位基因的频率。

5、有效等位基因数计算公式：

n表示等位基因数；Pi表示第i个等位基因频率。

6、卡方检验计算公式：

其中df≥2，Ei：理论值，Oi：实际观察值，n为等位基因数。。

二、实验结果

1、PPP1R15A基因E3-250 T>A位点的群体遗传特性结果如表1所示，等位基因A和T的基因频率为0.3333和0.6667，AA、AT、TT的基因型频率分别为0.1170，0.4255，0.4574；根据表1的数据得出在E3-250 T>A位点中，其优势等位基因为T，其频率大于0.5，优势基因型频率为AT和TT，其中AT和TT的基因型频率的统计结果相近，均处于0.40～0.46之间，E3-250T>A位点的基因杂合度(H)和多态信息含量(PIC)均处在0.25～0.50之间，这一结果表明E3-250T>A位点在群体中表现为中度多态，杂合度较高，保障中国荷斯坦奶牛种群的多样性，遗传多态性较丰富。有效等位基因数(Ne)为1.8000，该位点有2个等位基因，说明该位点基因在群体中分布较均匀。卡方检验(2)结果表明，E3-250T>A位点在中国荷斯坦奶牛群体中处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)，表明此位点在中国荷斯坦奶牛群体可以保持一个相对稳定的基因库，该位点基因表达出利于中国荷斯坦奶牛生产性能的优势性状，则可以较好的保留下来。

表1中国荷斯坦奶牛PPP1R15A基因在E3-250 T>A位点群体遗传特性分析结果

注：χ

2、由表2所示，基因型AA的奶量、乳糖、尿素氮和校正奶都高于基因型AT和TT，但与基因型AT和TT的差异性均不显著(P>0.05)。根据单因素方差中的多重比较结果显示，基因型AA与基因型AT和TT的脂肪含量差异不显著，但基因型AT个体与TT个体的脂肪含量差异极显著(P<0.01)；基因型AA个体与基因型AT和TT个体的干物质含量差异不显著，但基因型AT个体与TT个体的干物质含量差异极显著(P<0.01)；其他奶量、蛋白、乳糖、体细胞数、尿素氮和校正奶等乳品质性状差异不显著。

表2PPP1R15A基因E3-250 T>A位点不同基因型中国荷斯坦奶牛乳品质性状比较分析结果

注：不同上标字母表示差异极显著(P<0.01)。

实施例3一种评价中国荷斯坦奶牛乳品质相关的性状的试剂盒

一、组成

实施例1中核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物、Taq PCR Master Mix(2×red dye)和ddH

二、使用方法

以中国荷斯坦奶牛血液基因组DNA混池为模板，进行PCR扩增。

PCR扩增体系(总体积为20μL)：

DNA模板1.0μL、上下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物)各0.5μL、Taq PCR Master Mix(2×red dye)10μL和ddH

PCR扩增程序：94℃预变性4min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测确认目的片段正确后，进行测序。

三、结果判读

扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SNP位点位于所述扩增产物第386个碱基处(即PPP1R15A基因外显子3第250个碱基位点，NC_037345.1:55477445，ARS-UCD1.2版牛基因组的第18染色体的第55477445位)，为A单峰，样本基因型为AA，为T单峰，样本基因型为TT，为A/T重叠峰，样本基因型为AT。

SNP位点的基因型为TT的样本，其中国荷斯坦奶牛个体的乳脂和干物质含量，显著高于基因型为AT的中国荷斯坦奶牛个体。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。