带有伊喜替康和C-lock定点偶联基团的抗体偶联中间体、偶联方法及抗体偶联药物

摘要

本发明公开了一种带有伊喜替康和C‑lock定点偶联基团的抗体偶联中间体、偶联方法及抗体偶联药物，其中的抗体偶联药物中间体化学结构通式为：

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种抗体偶联药物，具体涉及一种带有伊喜替康和C-lock定点偶联基团的抗体偶联中间体、偶联方法及抗体偶联药物。

背景技术

抗体药物偶联物(Antibody drug conjugate，简称ADC)是一类新型的抗肿瘤药物，其原理是将细胞毒素连接在抗体上，通过抗体对癌细胞表面特定抗原的识别，通过内吞作用进入癌细胞，从而将细胞毒素运输到靶点，达到靶向性治疗恶性肿瘤的目的。ADC与传统的小分子抗肿瘤药物相比，因能借助抗体的靶向识别性与毒素的高活性，故更具备特异性和有效性。

ADC包括三个不同的组成部分，即抗体、连接子和细胞毒素。抗体实现靶向性，连接子保证在ADC在血液转运过程中的稳定性，而到达作用靶点后，毒素发挥对癌细胞的杀伤作用。根据作用机制的不同，适用于ADC的毒素分为微管类抑制剂(Microtubuleinhibitors)，DNA损伤剂(DNA damaging agents)和RNA聚合酶抑制剂(RNA polymeraseinhibitors)等。目前，以Monomethyl auristatin E (MMAE)为代表的微管蛋白抑制剂是应用最为广泛的Payload。在DNA损伤剂中喜树碱(Camptothecin，CPT)类是值得关注的，CPT通过作用于DNA拓扑异构酶I抑制DNA的复制和转录，导致肿瘤细胞死亡，但由于其水溶性差，生物利用度低，因此，临床应用有限。而CPT类衍生物伊立替康(CPT-11)的活性代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)因生物利用度高、抗肿瘤活性强，在ADC药物中得到广泛应用，如Sacituzumab govitecan和Labetuzumab govitecan均采用SN-38作为有效载荷。更值得一提的是，Exatecan甲磺酸盐是比伊立替康的活性代谢物SN-38更有效的DNA拓扑异构酶I(TOP1)抑制剂，与伊立替康相比，活性提高10倍，且DXd在血液中的半衰期显著缩短，有助于减少毒副作用的产生。目前已成功用于新一代ADC药物Enhertu(T-DXd)、Dato-DXd等的开发。连接子方面，主要应用的为可裂解型，如缬氨酸-瓜氨酸(Valine-Citriline)和环己基甲酸(MCC)，经过溶酶体水解后，药物仍然具有活性，并通过连接区与某个氨基酸残基结合在一起。

传统的ADC利用抗体赖氨酸的氨基或打开链间二硫键获得的半胱氨酸的巯基进行偶联，赖氨酸的氨基与活化的羧酸酯连接子通过酰胺键连接，半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺基团反应。一个抗体分子包含了80-90个赖氨酸，偶联可能会发生在将近40个不同赖氨酸残基上，打开链间二硫键会得到多个半胱氨酸残基，同时破坏了抗体分子的完整性，因此传统的ADC是高度异质混合物，其均一性差(即药物与抗体的比率(DAR)为1-8)，稳定性低，影响药效。ADC药物不同DAR值的成分通常表现出完全不同的性质，比如低DAR值(1-2)的ADC通常药效较差，高DAR值(6-8)的ADC通常容易出现聚集情况，同时高DAR值的ADC更容易出现体内循环过程中的小分子脱落，带来体内毒性。因此不均一的ADC的通常有更严重的药物安全问题。

MC-GGFG-Dxd是一种常用的ADC药物连接子，该分子通过马来酰亚胺基团(MC)与抗体上的半胱氨酸的巯基反应，将伊喜替康偶联到抗体上。大多数抗体具有4对链间二硫键，打开可以获得8个半胱氨酸巯基，如果全部偶联上药物小分子MC-GGFG-Dxd，因为较强的疏水性会导致抗体多聚体明显，并且DAR为8时抗体的链间二硫键全被破坏，会破坏抗体的完整性，所以第一三共(Daiichi Sankyo)的一款ADC药物DS-1062采用的平均DAR值为4的偶联比例。但是因为随机偶联的不可控性，ADC药物通常是DAR值2,4,6,8的混合物，如图27所示的HIC-HPLC就是典型的平均DAR值为4的随机偶联ADC的峰型。并且由于链间二硫键被打开，破坏了抗体的完整性，导致ADC药物稳定性差。稳定性差也会带来药物安全问题。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种带有伊喜替康和C-lock定点偶联基团的抗体偶联中间体、偶联方法及抗体偶联药物，该抗体偶联药物中间体用伊喜替康(Exatecan)作为细胞毒素，通过二甲基溴代喹恶啉活性反应基团且为C-lock定点偶联基团，起到将伊喜替康定点偶联到抗体上，从而有效提高ADC药物的均一性和稳定性，进而显著提高抗体对肿瘤细胞的灭杀效果。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种抗体偶联药物中间体，它的化学结构通式为：

其中，

                   

优选的，抗体偶联药物中间体包括但不限于如下化学结构：

本发明的又一目的在于提供一种上述抗体偶联药物中间体的偶联方法为：喹恶啉结构上有两个相邻的溴甲基可以同时与打开二硫键的2个巯基发生偶联反应，从而把细胞毒素偶联到抗体上，细胞毒素为伊喜替康(Exatecan)，起到杀伤肿瘤细胞的作用。

优选的，所述偶联反应机理如下：

优选的，所述抗体偶联药物中间体的定点偶联，包括：抗体还原打开的四对二硫键分别定点偶联上一个SET0569的小分子，得到DAR为4的均一的ADC药物，并且打开的二硫键被小分子的两个侧链重新连接，抗体重-重链和轻-重链再次被化学键连接，从而提高抗体药物的稳定性。下图是SET0569定点偶联的示意图：

本发明的再一目的在于提供一种上述带有伊喜替康和C-lock定点偶联基团的抗体偶联中间体通过偶联制成的抗体偶联药物，其结构通式如下：

其中，A为抗体或者抗体片段，Linker结构包含可被酶切的多肽结构，起到连接的作用，n为3-5。

将偶联药物中间体SET0538、SET0569、SET0571、SET0572分别与Trop-2靶点抗体(BY016)和BCMA靶点抗体(STI-1260)进行偶联得到ADC样品LN488-04-2(BY016 SET0538)、LN488-01-1(BY016 SET0569)、LN488-02-2(BY016 SET0571)、LN488-05-1(STI-1260SET0572)和LN488-05-2(BY016 SET0572)，结构如下：

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明抗体偶联药物中间体、偶联方法及抗体偶联药物，该抗体偶联药物中间体用伊喜替康(Exatecan)作为细胞毒素，通过二甲基溴代喹恶啉活性反应基团(C-lock)将伊喜替康定点偶联到抗体上，从而有效提高ADC药物的均一性和稳定性，进而显著提高抗体对肿瘤细胞的灭杀效果。

图1 SET0538 HNMR图谱；

图2 SET0538 LC-MS图谱；

图3 SET0569 HNMR图谱；

图4 SET0569 LC-MS图谱；

图5 SET0571 HNMR图谱；

图6 SET0571 LC-MS图谱；

图7 SET0572 LC-MS图谱；

图8 LN488-01-1 HIC图谱；

图9 LN488-01-2 HIC图谱；

图10 LN488-02-2 HIC图谱；

图11 LN488-04-2 HIC图谱；

图12 LN488-05-1 HIC图谱；

图13 LN488-05-2 HIC图谱；

图14 LN488-01-1和LN488-01-2 Trop2细胞活性曲线；

图15 LN488-02-2 Trop2细胞活性曲线；

图16 LN488-05-1和LN488-05-2 Trop2细胞活性曲线；

图17 LN488-01-1 CE-SDS图谱；

图18 LN488-01-2 CE-SDS图谱；

图19 Trop2-SET0218 ADC样品在猴血清中mAb浓度检测标准曲线；

图20 Trop2-SET0218 ADC样品在人血清中mAb浓度检测标准曲线；

图21 Trop2-SET0218 ADC样品在猴血清中ADC浓度检测标准曲线；

图22 Trop2-SET0218 ADC样品在人血清中ADC浓度检测标准曲线；

图23 Trop2-SET0569 ADC样品在猴血清中mAb浓度检测标准曲线；

图24 Trop2-SET0569 ADC样品在人血清中mAb浓度检测标准曲线；

图25 Trop2-SET0569 ADC样品在猴血清中ADC浓度检测标准曲线；

图26Trop2-SET0569 ADC样品在人血清中ADC浓度检测标准曲线；

图27为HIC-HPLC的随机偶联ADC峰型示意图。

具体实施方式

下面将结合对本发明优选实施方案进行详细说明。

实施例1

本实施例提供一种SET0538的合成方法，其合成路线如下：

其合成步骤包括：

步骤1、合成SET0538-1：将G5-FPDA(365mg，1.1eq)，HATU(215mg，1.5eq)加至50ml单口瓶中，加入DMF(5ml)搅拌溶清，加入DIPEA(97mg，2.0eq)，室温搅拌15min后，加入LND1030(200mg，1.0eq)，室温搅拌30min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用80g的C18反相柱中压纯化，流动相选用乙腈和0.05％TFA水，产物在H

步骤2、合成SET0538-2：将SET0538-1(273mg)加至25ml单口瓶中，加入DMF(3ml)冰浴搅拌10min后加入DEA(3ml)，搅拌20min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，旋干DEA，加入AcOH至反应液呈酸性，采用120g的C18反相柱中压纯化，流动相选用乙腈和0.05％AcOH水，产品在H

步骤3、合成SET0538：将SET0538-2(90mg,1.0eq)加至25ml单口瓶中，加入DMF(2ml)搅拌溶清后加入1，4-二溴-2,3-丁二酮(51mg，2.0eq)，室温反应5min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用高压制备纯化，流动相选用乙腈和0.05％TFA，产品在H2O：乙腈＝32％：68％处接收，冻干得SET0538 63mg，HPLC：90.42％，MS：1063.67。

实施例2

本实施例提供一种SET0569的合成方法，其合成路线如下：

其合成步骤包括：

步骤1、合成SET0569-2：取Exatecan(1.0eq，2.0g)于反应瓶中，无水DMF(20mL)和DIPEA(3.0eq，1.64g)，室温下搅拌5-10min；SET0569-1(3.83g，1.4eq)加入反应瓶，然后反应体系转移至低温反应器中，降温-5至5℃搅拌3-5min；取HATU(1.6eq，2.58g)加入反应体系，保温0-5℃反应1-3h；HPLC检测反应体系，反应完全后处理：反应体系直接中压反相纯化(0.1％TFA水/乙腈体系纯化，70-80％乙腈比例出产品)；收集产品冻干，得到SET0569-2黄色固体4.05g，HPLC纯度93.3％，收率90％。

步骤2、合成SET0569-3：取SET0569-2(1.0eq，4.0g)无水DMF(32mL)于反应瓶中，室温搅拌3-5min；将反应体系降温0-5℃搅拌3-5min；取DEA(2.75g，3.9mL)加入反应体系，保温0-5℃反应0.5-1h；HPLC检测反应体系，反应完全后处理：反应体系浓缩除去DEA；醋酸0.45g溶于少量DMF中加入反应体系摇匀；反应体系直接中压反相纯化(0.1％TFA水/乙腈体系纯化)；收集产品冻干，得到SET0569-3黄色固体2.87g，HPLC纯度93.2％，收率89％。

步骤3、合成SET0569-4：将二-FMOC-3，4-二氨基苯甲酸(137mg，1.1eq)，HATU(119mg，1.5eq)加至50ml单口瓶中，加入DMF(3ml)搅拌溶清，加入DIPEA(81mg，3.0eq)，室温搅拌15min后，加入SET0569-3(200mg，1.0eq)，室温搅拌1小时。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用80g的C18反相柱中压纯化，流动相选用乙腈和0.05％TFA水，产物在H2O：乙腈＝26％：74％处接收，冻干得SET0569-4 340mg。

步骤4、合成SET0569-5：将SET0569-4(340mg)加至25ml单口瓶中，加入DMF(4ml)搅拌溶清后加入DEA(1ml)，室温搅拌20min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，旋干DEA，采用80g的C18反相柱中压纯化，流动相选用乙腈和0.05％TFA水，产品在H

步骤5、合成SET0569：将SET0569-5(210mg,1.0eq)加至25ml单口瓶中，加入DMF(2ml)搅拌溶清后加入1，4-二溴-2,3-丁二酮(85mg，2.0eq)，室温反应5min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用高压制备纯化，流动相选用乙腈和纯水，产品在H2O：乙腈＝32％：68％处接收，冻干得SET0569 110mg(HPLC：92.68％)，MS：1183.95。

实施例3

本实施例提供一种SET0571的合成方法，其合成路线如下：

其合成步骤包括：

步骤1、合成SET0571-1：将Fmoc-GGFG(473mg，1.5eq)，HATU(322mg，1.5eq)加至50ml单口瓶中，加入DMF(5ml)搅拌溶清，加入DIPEA(219mg，3.0eq)，室温搅拌15min后，加入Exatecan(300mg，1.0eq)，室温搅拌2H。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用120g的C18反相柱中压纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA水，产物在H

步骤2、合成SET0571-2：将SET0571-1(650mg)加至50ml单口瓶中，加入DMF(10ml)搅拌溶清后加入DEA(2.5ml)，室温搅拌20min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，旋干DEA，采用120g的C18反相柱中压纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA水，产品在H

步骤3、合成SET0571-3：将二-FMOC-3，4-二氨基苯甲酸(347mg，1.2eq)，HATU(276mg，1.5eq)加至50ml单口瓶中，加入DMF(10ml)搅拌溶清，加入DIPEA(188mg，3.0eq)，室温搅拌15min后，加入SET0571-2(420mg，1.0eq)，室温搅拌1H。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用120g的C18反相柱中压纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA水，产物在H

步骤4、合成SET0571-4：将SET0571-3(530mg)加至25ml单口瓶中，加入DMF(5ml)搅拌溶清后加入DEA(1ml)，室温搅拌20min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，旋干DEA，采用120g的C18反相柱中压纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA水，产品在H

步骤5、合成SET0571：将SET0571-4(100mg，1.0eq)加至50ml单口瓶中，加入DMF(5ml)搅拌溶清后加入1，4-二溴-2,3-丁二酮(44mg，2.0eq)，室温反应5min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用高压制备纯化，流动相选用ACN和纯水，产品在H

实施例4

本实施例提供一种SET0572的合成方法，其合成路线如下：

其合成步骤包括：

步骤1、合成SET0572-1：将Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH(1g，1.0eq)加至100ml单口瓶中，加入THF(20ml)，加入Toluene(5ml)，室温下搅拌10min，在N

步骤2、合成SET0572-2：将SET0572-2(630mg，1.0eq)加至50ml单口瓶中，加入THF(15mL)搅拌溶清。加入乙醇酸苯甲酯(691mg，3.0eq)，TsOH.H2O(26.4mg，0.1eq)，40℃搅拌过夜20h。HPLC监测原料少量剩余。反应结束，采用100g的C18反相柱中压纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA水，产物在H

步骤3、合成SET0572-3：将SET0572-2(120mg，1.0eq)加至50ml单口瓶中，加入MeOH(20ml)中搅拌溶清，加入Pd/C(120mg，10wt％)，H

步骤4、合成SET0572-4：将SET0572-3(80mg，1.0eq)加至25ml单口瓶中，溶于DMF(4m1)，加入HATU(102mg，1.5eq)，DIPEA(46mg，2.0eq)，常温下搅拌5min。加入Exatecan(96mg，1.0eq)，室温下搅拌2h。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用60g的C18反相柱中压纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA水，产物在H

步骤5、合成SET0572-5：将SET0572-4(80mg)加至25ml单口瓶中，加入DMF(4ml)，加入DEA(1ml)，室温搅拌2h。HPLC监测无原料剩余。反应结束，除去DEA，加入乙酸调节pH至酸性。采用60g的C18反相柱中压纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA水，产物在H

步骤6、合成SET0572-6：将SET0572-5(27mg，1.0eq)，FPDA-G3(32mg，1.0eq)加至25ml单口瓶中，加入DMF(4ml)搅拌溶清，加入HATU(24mg，1.5eq)，DIPEA(16mg，3.0eq)，常温下搅拌，测pH值为5，再次加入10滴DIPEA，将pH调成8。N

步骤7、合成SET0572-7：在SET0572-6的反应液中，加入DEA(0.5ml)，搅拌40min。HPLC监测无原料剩余。反应结束，采用高压制备纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA，产品在H

步骤8、合成SET0572：将SET0572-7(27mg，1.0eq)加至25ml单口瓶中，加入DMF(2ml)搅拌溶清后加入1，4-二溴-2,3-丁二酮(14mg，2.0eq)，室温反应5min。LCMS监测无原料剩余。反应结束，采用高压制备纯化，流动相选用ACN和0.05％TFA，产品在H

实施例5

本实施例提供一种抗体偶联物LN488-04-2(BY016 SET0538)的制备方法，其制备路线如下：

其制备步骤如下：

步骤S1、Buffer1配置：Na

步骤S2、将抗体BY016置换到缓冲体系Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)中；

步骤S3、取抗体BY016(10umol)，加入10.0当量TCEP(100umol)，室温下搅拌2小时；

步骤S4、将还原后抗体通过超滤管用Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量还原剂；

步骤S5、取出还原后抗体(控制浓度10±5mg/mL)，然后加入8.0当量SET0538(80umol，溶剂：乙腈/水＝60/40)，室温下搅拌30分钟，HIC-HPLC检测；

步骤S6、后处理：将偶联后的ADC样品通过超滤管用Buffer1置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量小分子及有机溶剂等。得到目标ADC产品LN488-04-2，进行相关检测，低温储存。

实施例6

本实施例提供一种抗体偶联物LN488-01-1(BY016 SET0569)的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1、Buffer1配置：Na

步骤S2、将抗体BY016置换到缓冲体系Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)中；

步骤S3、取抗体BY016(10umol)，加入10.0当量TCEP(100umol)，室温下搅拌2小时；

步骤S4、将还原后抗体通过超滤管用Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量还原剂；

步骤S5、取出还原后抗体(控制浓度10±5mg/mL)，然后加入8.0当量SET0569(80umol，溶剂：乙腈/水＝60/40)，室温下搅拌30分钟，HIC-HPLC检测；

步骤S6、后处理：将偶联后的ADC样品通过超滤管用Buffer1置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量小分子及有机溶剂等。得到目标ADC产品LN488-01-1，进行相关检测，低温储存。

实施例7

本实施例提供一种抗体偶联物LN488-02-2(BY016 SET0571)的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1、Buffer1配置：Na

步骤S2、将抗体BY016置换到缓冲体系Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)中；

步骤S3、取抗体BY016(10umol)，加入10.0当量TCEP(100umol)，室温下搅拌2小时；

步骤S4、将还原后抗体通过超滤管用Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量还原剂；

步骤S5、取出还原后抗体(控制浓度10±5mg/mL)，然后加入8.0当量SET0571(80umol，溶剂：乙腈/水＝60/40)，室温下搅拌30分钟，HIC-HPLC检测；

步骤S6、后处理：将偶联后的ADC样品通过超滤管用Buffer1置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量小分子及有机溶剂等。得到目标ADC产品LN488-02-2，进行相关检测，低温储存。

实施例8

本实施例提供一种抗体偶联物LN488-05-1(STI-1260 SET0572)的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1、Buffer1配置：Na

步骤S2、将抗体STI-1260(其序列表参见序列表文件)置换到缓冲体系Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)中；

步骤S3、取抗体STI-1260(10umol)，加入10.0当量TCEP(100umol)，室温下搅拌2小时；

步骤S4、将还原后抗体通过超滤管用Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量还原剂；

步骤S5、取出还原后抗体(控制浓度10±5mg/mL)，然后加入8.0当量SET0572(80umol，溶剂：乙腈/水＝60/40)，室温下搅拌30分钟，HIC-HPLC检测；

步骤S6、后处理：将偶联后的ADC样品通过超滤管用Buffer1置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量小分子及有机溶剂等，得到目标ADC产品LN488-05-1，进行相关检测，低温储存。

实施例9

本实施例提供一种抗体偶联物LN488-05-2(BY016 SET0572)的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1、Buffer1配置：Na

步骤S2、将抗体BY016置换到缓冲体系Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)中；

步骤S3、取抗体BY016(10umol)，加入10.0当量TCEP(100umol)，室温下搅拌2小时；

步骤S4、将还原后抗体通过超滤管用Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量还原剂；

步骤S5、取出还原后抗体(控制浓度10±5mg/mL)，然后加入8.0当量SET0572(80umol，溶剂：乙腈/水＝60/40)，室温下搅拌30分钟，HIC-HPLC检测；

步骤S6、后处理：将偶联后的ADC样品通过超滤管用Buffer1置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量小分子及有机溶剂等。得到目标ADC产品LN488-05-2，进行相关检测，低温储存。

对比例

本例提供一种抗体偶联物LN488-01-2(BY016 MC-GGFG-Dxd)的制备方法，其制备路线如下：

其制备步骤包括：

步骤S1、Buffer1配置：Na

步骤S2、将抗体BY016置换到缓冲体系Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)中；

步骤S3、取抗体BY016(10umol)，加入10.0当量TCEP(100umol)，室温下搅拌2小时；

步骤S4、将还原后抗体通过超滤管用Buffer1(50mM PB，5mM EDTA，pH 7.2)置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量还原剂；

步骤S5、取出还原后抗体(控制浓度10±5mg/mL)，然后加入8.0当量MC-GGFG-Dxd(80umol，溶剂：乙腈/水＝60/40)，室温下搅拌30分钟，HIC-HPLC检测；

步骤S6、后处理：将偶联后的ADC样品通过超滤管用Buffer1置换3-5次(相当于总稀释倍数1000倍左右)，除去过量小分子及有机溶剂等。得到目标ADC产品LN488-01-2，进行相关检测，低温储存。

测试例1

本例提供一种Trop-2靶点细胞活性测试：293T(人肾上皮细胞)为高表达Trop-2的细胞。ADC与该细胞一起孵育后，可以结合细胞表面的Trop-2抗原，从而诱导ADC内陷到肿瘤细胞内，释放毒素分子，抑制肿瘤细胞的增殖。

将293T以10000细胞/孔(2×10

测试例2

本例提供一种ELISA血清稳定性测试：

1、样品制备

在生物安全柜中分别使用食蟹猴血清以及人血清将Trop2-SET0218/Trop2-SET0569稀释至100μg/mL，将样品等分在4支EP管中，其中2支立即储存在-70℃冰箱，剩余2支放入37℃恒温培养箱，96h将样品取出后储存在-70℃冰箱，使用酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定食蟹猴血清或人血清中的总抗和抗体偶联药物(ADC)。

2、酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定食蟹猴血清或人血清中的总抗和抗体偶联药物(ADC)

总抗以0.5μg/mLHuman Trop2 ECD为包被试剂过夜包被96孔板，洗板，使用3％milk室温封闭1～4小时，洗板，然后加入浓度为5％的食蟹猴血清或人血清稀释的Trop2-SET0218/Trop2-SET0569标准品、质控点(QC)及待测血清样品室温500rpm震荡孵育2h，洗板，使用0.025μg/mL Goat anti-Human IgG-h+l Biotinylated为检测抗体室温500rpm震荡孵育1h，洗板后加入0.025μg/mL High Sensivitiy Strptavidin-HRP室温500rpm震荡孵育0.5h。孵育过程中，形成了包被抗原-Trop2 Ab-BiotinantiHumanIgG-SA HRP的免疫复合物，通过洗板步骤去除未结合的抗体。最后经底物TMB显色及2M H

ADC以0.5μg/mLHuman Trop2 ECD为包被试剂过夜包被96孔板，洗板，使用3％milk室温封闭1～4小时，洗板，然后加入浓度为10％的使用食蟹猴血清或人血清稀释的Trop2-SET0218/Trop2-SET0569标准品、质控点(QC)及待测血清样品室温500rpm震荡孵育2h，洗板，使用0.2ug/mL Biotin-conjugated anti-Dxd mAb为检测抗体室温500rpm震荡孵育1h，，然后加入0.025μg/mL High Sensivitiy Strptavidin-HRP室温500rpm震荡孵育0.5h。孵育过程中，形成了包被抗原-Trop2 ADC-BiotinantiDxd-SAHRP的免疫复合物，通过洗涤步骤去除未结合的ADC。最后经底物TMB显色及2M H

把ADC样品的细胞活性与抗体STI-1260和BY016的细胞活性对比，发现抗体基本没有细胞杀伤能力，而五个ADC均表现很好的肿瘤细胞杀伤能力。对于293T(高表达Trop-2的人肾上皮细胞)，LN488-05-2(BY016 SET0572)有很好的杀伤效果，而LN488-05-1(STI-1260SET0572)没有杀伤，说明ADC样品仅对相应的靶点表达的细胞有杀伤，对不表达靶点的细胞无杀伤，说明定点偶联技术制得的ADC有很好的安全性。

在对比例中我们用随机偶联技术的药物连接子MC-GGFG-Dxd与Trop-2靶点抗体(BY016)进行偶联得到ADC样品LN488-01-2，并进行活性测试，EC50显示MC-GGFG-Dxd的ADC样品LN488-01-2细胞活性低于SET0569的ADC样品LN488-01-1。活性数据如图14、图15和图16所示，具体数据见下表

我们对LN488-01-1和LN488-01-2进行了疏水作用色谱(HIC)检测，图8结果显示LN488-01-1主峰DAR＝4的占比为90％，。图9结果显示LN488-01-2各峰占比情况为DAR＝2(14％)，DAR＝4(29％)，DAR＝6(42％)，DAR＝8(13％)。SET0569偶联形成的ADC抗体均一性明显优于MC-GGFG-Dxd，显示了定点偶联技术的优势。

我们还对LN488-01-1和LN488-01-2进行了毛细管电泳法(CE-SDS)检测，图17结果显示LN488-01-1完整抗体(HHLL)占比31％，图18结果显示LN488-01-2完整抗体(HHLL)占比只有10％，说明SET0569偶联形成的ADC抗体完整性明显优于MC-GGFG-Dxd，显示了定点偶联技术的优势。

我们还对LN488-01-1和LN488-01-2进行了血清稳定性检测，LN488-01-1样品mAb浓度下降很小，原因在于SET0569的双臂设计将打开的二硫键重新桥联，有助于保持抗体的稳定性。LN488-01-2样品ADC浓度下降更为明显，主要原因在于马来酰亚胺(MC)偶联方式会有逆迈克尔反应，导致药物连接子脱落，LN488-01-1不存在逆迈克尔反应，连接更加稳定。血清稳定性数据如图19-26所示，具体数据见下表

检测结果对比显示使用定点偶联技术和伊喜替康(Exatecan)的ADC药物在均一性、安全性、细胞活性、抗体完整性和血清稳定性都优于随机偶联的MC-GGFG-Dxd，证明了本专利公开技术的优势。

序列表抗体STI-1260序列表

抗体BY016序列表

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。