Hippo-Yap通路调控剂在促进诱导性多能干细胞向胰腺前体细胞定向分化中的应用

摘要

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及Hippo‑Yap通路调控剂在促进诱导性多能干细胞向胰腺前体细胞定向分化中的应用。用本发明的方法能够在体外高效获得非人灵长类恒河猴来源的胰腺前体细胞，为进一步获得非人灵长类恒河猴功能性胰岛β细胞提供了材料来源，更为实现非人灵长类糖尿病动物模型自体移植治疗提供了现实基础。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及Hippo-Yap通路调控剂在促进诱导性多能干细胞向胰腺前体细胞定向分化中的应用。

背景技术

糖尿病是一种无法正常调控生物机体内血糖水平的代谢失调疾病。其中Ⅰ型糖尿病主要是由于患者体内胰岛β细胞遭到自身免疫攻击进而导致β细胞功能下降缺少绝对胰岛素的分泌所引起。迄今，除了给Ⅰ型糖尿病患者长期注射外源胰岛素进行治疗外，胰岛移植正被证明同样能够有效治愈Ⅰ型糖尿病。然而由于胰岛供体的极度缺乏以及异体免疫排斥的存在，以致于该种疗法未能成为医治Ⅰ型糖尿病的主要手段。

动物模型是研究人类疾病的基础，目前对于糖尿病的研究最为常用的模型动物仍为啮齿类。而啮齿类动物与灵长类动物在生理机能各方面存在巨大差异，特别是与人类在进化上相距甚远，故而啮齿类动物模型更适合用做基础研究，以其为对象在真正意义上对于临床指导的意义并不大。恒河猴作为非人灵长类动物在解剖学、病理生理学、免疫和药物代谢反应等方面与人类更为接近，是针对免疫相关治疗和干细胞移植治疗作出临床前有效性和安全性评价更有价值的模型动物。以恒河猴来源的体外诱导功能性β细胞实现自体移植治疗能够从真正意义上，对未来干细胞自体移植治疗方案在临床上的应用具有重要的指导意义。最新资料显示，由人诱导性多能干细胞定向诱导分化的功能性β细胞用于移植治疗非人灵长类恒河猴糖尿病模型具有良好疗效，但却仍受制于不同物种间免疫排斥的问题，移植物较快被体内清除，而无法为此种疗法做出最为精确的安全有效性评价，特别是体内长期的安全性有效性评价，为人自体移植提供直接的病理，毒理证据。由此，在体外诱导非人灵长类动物来源的功能性β细胞并以自体移植的形式进行治疗对于该种疗法的可行性与安全有效性评估具有重要意义。

因此，如何通过有效提高非人灵长类的诱导性多能干细胞向胰腺谱系分化的效率并最终形成胰腺前体细胞急需进一步研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在寻找促进非人灵长类的诱导性多能干细胞（monkeyiPSC）向胰腺前体细胞定向分化的方法。

为此，本发明的第一目的是提供Hippo-YAP通路调控剂在促进诱导性多能干细胞向胰腺前体细胞定向分化中的应用，Hippo-YAP通路调控剂用以激活YAP进而推动非人灵长类来源的诱导性多能干细胞向胰腺前体细胞特定分化。

Hippo信号通路是细胞内重要信号传导机制之一，该信号通路的抑制最终引起其下游效应分子YAP的激活，YAP在细胞核内积累并起始转录下游一系列基因的表达，进而影响细胞增殖、细胞骨架、细胞连接、细胞迁移等等。现已有多项资料报道，Hippo-YAP通路在早期胚胎发育特别是胰腺发育过程中发挥了至关重要的作用。例如，Hippo激活可使PDX1在Thr11位点发生磷酸化进而引起PDX1以泛素化形式降解；YAP激活在早期胰腺发育过程中能够促进胰腺祖细胞的增殖跟上皮转化，以及促进包括NKX6.1在内的多个胰腺前体标志基因表达。

本发明从Hippo-YAP信号通路上寻找合适的通路调控剂，抑制该信号通路，并最终稳定YAP细胞核中的积累并起始转录，用以促进诱导性多能干细胞定向分化为内胚层细胞，接着进一步向胰腺谱系特化，并最终分化为胰腺前体细胞。胰腺前体细胞（Pancreaticprogenitor, PP）是干细胞向胰岛β细胞分化的过程中，会经历的一个细胞阶段，这一阶段的细胞具备自我更新和增殖能力。分化获得的胰腺前体细胞在体外培养扩增，形成一个细胞系，就可以简化分化过程、降低分化难度，进而缩短分化时间，最终让胰腺分化过程更加可控和稳定。

作为上述技术方案的优选，所述的Hippo-YAP通路调控剂为S1P 或LPA 或S1P+LPA。

Hippo通路由于其核心激酶Lats1/2活性在细胞内主要是受到G蛋白偶联受体（GPCR）信号的调控，故而常常被认为是GPCR信号通路的下游分支。其中，小分子鞘氨醇1-磷酸(S1P)和血源性溶血磷脂酸(LPA)同为溶血磷脂类化合物，S1P与LPA都主要通过特异激活细胞表面G蛋白偶联受体（GPCR）然后引起细胞内信号级联传递随后调节信号通路。现已有大量研究资料报道，S1P与LPA都可通过偶联受体G12/13，Gq/11和Gi/o来抑制Hippo通路核心激酶Lats1/2，并且激活 RHO 和肌动蛋白actin，最终稳定YAP在细胞核中的积累并起始转录。此外，YAP往往参与在由LPA诱导引起的基因表达、细胞迁移和扩散当中。特别地，研究表明S1P能够逆转CDH2敲除小鼠背胰发育障碍表型并且能够稳定PDX1的表达。

经过发明人的实验摸索，本发明在定型内胚层细胞向胰腺前体细胞分化进程中，阶段性地使用S1P 或LPA 或S1P+LPA作为Hippo-YAP通路调控剂，从而建立起了高效的恒河猴（macaque）胰腺前体细胞分化方案。

作为上述技术方案的优选，S1P和LPA的工作终浓度：S1P为0.25 μM -2μM，LPA为5μM -20μM。

作为上述技术方案的优选，所述非人灵长类为恒河猴。

本发明的第二目的是提供促进非人灵长类的诱导性多能干细胞（monkey iPSC）向胰腺前体细胞定向分化的培养基，包含有上述的Hippo-YAP通路调控剂。

作为上述技术方案的优选，所述的Hippo-YAP通路调控剂为S1P 或LPA 或S1P+LPA。

作为上述技术方案的优选，S1P和LPA的工作终浓度：S1P为0.25 μM -2μM，LPA为5μM -20μM。

作为上述技术方案的优选，所述非人灵长类为恒河猴。

本发明的第三目的是提供促进非人灵长类的诱导性多能干细胞（monkey iPSC）向胰腺前体细胞定向分化的方法，包括如下步骤：

S1. 诱导多能干细胞分化为定型内胚层细胞；

S2. 诱导定型内胚层细胞向胰腺谱系特化，在诱导过程中加入Hippo-YAP通路调控剂；

S3. 由胰腺谱系细胞进一步分化为胰腺前体细胞。

更优选地，在S1中，按照如下具体步骤诱导多能干细胞分化为定型内胚层细胞：

1.配制并使用定型内胚层阶段培养基Ⅰ，将130W-150W恒河猴多能干细胞于37℃、5％二氧化碳培养箱培养一天。

2.配制定型内胚层阶段培养基Ⅱ，将上述步骤1培养后的细胞更换为定型内胚层阶段培养基Ⅱ，于37℃、5％二氧化碳培养箱培养三天，每天更换培养基。

所述定型内胚层阶段培养基Ⅰ的组成为：以MCDB131培养基（Life Technologies，Cat#10372019）和B27（Gibco，Cat#12587-010）以100：1比例混合作为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1%Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、4.5mMGlucose（Sigma，Cat#G7528）、100ng/ml Activin A（Peprotech，Cat#120-14）、0.25mM PVc、3μM Chir99021（SelleckChem，Cat#S1263）、50mM PI103（SelleckChem，Cat#S1038）、10μM Y27632（SelleckChem，Cat#S1049），所述浓度均为工作终浓度。

所述定型内胚层阶段培养基Ⅱ的组成为：以MCDB131培养基（Life Technologies，Cat#10372019）和B27（Gibco，Cat#12587-010）以100：1比例混合作为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1%Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、4.5mM Glucose（Sigma，Cat#G7528）、100ng/ml Activin A（Peprotech，Cat#120-14）、0.25mMPVc，所述浓度均为工作终浓度。

更优选地，在S2中，按照如下具体步骤诱导定型内胚层细胞向胰腺谱系特化：

3.配制胰腺谱系特化培养基Ⅰ，将步骤S1培养获得的细胞更换为胰腺谱系特化培养基Ⅰ，于37℃、5%二氧化碳培养箱培养一天。

4.配制胰腺谱系特化培养基Ⅱ，将上述步骤1培养后的细胞更换为胰腺谱系特化培养基Ⅱ，于37℃、5%二氧化碳培养箱培养一天。

5.配制胰腺谱系特化培养基Ⅲ，将上述步骤2培养后的细胞更换为胰腺谱系特化培养基Ⅲ，于37℃、5%二氧化碳培养箱培养四天。每天更换培养基。

所述胰腺谱系特化培养基Ⅰ的组成为：以MCDB131（Life Technologies，Cat#10372019）为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、1%Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、0.5%BSA（Sigma，Cat#A4612）、4.5mM Glucose（Sigma，Cat#G7528）、0.25mM PVc、10μM SB431542（SelleckChem，Cat#S1067）、100nMWntC59（SelleckChem，Cat#S7037）、Hippo-YAP通路调控剂，所述浓度均为工作终浓度。

所述胰腺谱系特化培养基Ⅱ的组成为：以MCDB131（Life Technologies，Cat#10372019）为基础培养基，还包括下述工作浓度成分：1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、1%Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、0.5%BSA、4.5mM Glucose（Sigma，Cat#G7528）、0.25mM PVc、10μM SB431542（Selleck，Cat#S1067）、100nM WntC59（Selleck，Cat#S7037）、50ng/ml FGF2（Ongene；Cat#TP750002）、Hippo-YAP通路调控剂，所述浓度均为工作终浓度。

所述胰腺谱系特化培养基Ⅲ的组成为：以高糖DMEM（Gibco，Cat#C11965500CP）与B27（Gibco，Cat#12587-010）以100：1比例混合作为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：0.1μM LDN（SelleckChem，Cat#S7507）、4μM RA(Sigma，Cat#R2625)、0.25μMSant-1（SelleckChem，Cat#S7092）、1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、100nM WntC59（SelleckChem，Cat#S7037），所述浓度均为工作终浓度。

更优选地，在S3中，按照如下具体步骤诱导胰腺谱系细胞进一步分化为胰腺前体细胞：

6.配制胰腺前体细胞培养基，将S2所获得的细胞更换为胰腺前体细胞培养基，于37℃、5%二氧化碳培养箱培养七天，每天更换培养基。

所述胰腺前体细胞培养基的组成为：以高糖DMEM（Gibco，Cat#C11965500CP）培养基与B27（Gibco，Cat#12587-010）以100：1比例混合作为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、1%Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、20mMNAM（STEMCELL，Cat#SC-07154）、0.25mM PVc、100ng/ml EGF（Peprotech，Cat#AF-100-15）、0.2μMTPB(Santacruz，Cat#SC-204424)、0.25μM Sant-1（SelleckChem，Cat#S7092），所述浓度均为工作终浓度。

通过实施上述技术方案，本发明具有如下的优点：

本发明在恒河猴诱导性多能干细胞在体外诱导向胰腺前体细胞分化过程中，首创型的加入了S1P 或LPA 或S1P+LPA的使用。经体外流式细胞仪检测实验、细胞免疫荧光实验、QPCR等实验证明，加入S1P 或LPA 或S1P+LPA后，从形态学上显著的减少了细胞间粘连现象且明显改善细胞存活，同时流式检测显示获得较为可观比例的同时表达关键转录因子PDX1与NKX6.1的胰腺前体细胞，诱导效率达到86%。用本方法能够在体外高效获得非人灵长类恒河猴来源的胰腺前体细胞，为进一步获得非人灵长类恒河猴功能性胰岛β细胞提供了材料来源，更为实现非人灵长类糖尿病动物模型自体移植治疗提供了现实基础。

附图说明

图1是本发明实施例中加入不同浓度梯度的S1P 或LPA 或S1P+LPA处理后流式分析细胞最终分化成胰腺前体细胞的效率变化。

图2-1与图2-2分别是本发明实施例中加入S1P+LPA处理后对细胞形态上影响的实验结果示意图。标尺为20μm和50μm。

图3是本发明实施例中加入S1P+LPA处理后荧光定量PCR分析恒河猴胰腺前体细胞marker基因PDX1、NKX6.1、SOX9、Prox1的mRNA表达变化的实验结果示意图。

图4是本发明实施例中加入S1P+LPA处理后免疫荧光染色分析胰腺前体细胞marker基因PDX1、NKX6.1、SOX9蛋白表达的结果示意图。标尺为50μm。

图5是本发明实施例中加入S1P+LPA处理后细胞流式分析诱导获得胰腺前体细胞的分化效率结果示意图。

所有上述实验结果中control组均为不加入Hippo-YAP通路调控剂S1P 或LPA 或S1P+LPA的对照组；实验组均为加入Hippo-YAP通路调控剂S1P 或LPA 或S1P+LPA的阳性组。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明中所涉及到的实验方法做进一步详细描述。

1.恒河猴来源的诱导性多能干细胞的培养方法

恒河猴多能干细胞培养在由MEF饲养层细胞包被的培养板上，所用猴IPS培养基的组成为：以KO-DMEM（Gibco，Cat#10829018）为基础培养基，还包括以下工作浓度成分：5%KnockOut Serum Replacement（Gibco，Cat#10828028）、1%Glutamax（Invitrogen，Cat#C11965500CP）、1% NEAA（Gibco，Cat#11140050）、1%双抗（Gibco，Cat#15140163）、1%β-巯基乙醇（amresco，Cat#M131）、100ng/ml bFGF（amsbio，Cat#SFB-504-CT）。培养条件为37℃、5%二氧化碳培养箱。当细胞汇合度培养至约85%可进行传代培养。即①用PBS（Invitrogen，Cat#14190）清洗一遍细胞，加入dispase（Roche，Cat#Rs-04942078001） 1U/ml 1ml放入培养箱消化10min。②将新备用的饲养层细胞用PBS（Invitrogen，Cat#14190）洗一遍而后加入猴IPS培养基（+Y27632 10μM）2ml后放入培养箱备用。③镜下观察细胞消化情况，若存在80%以上的克隆卷起、脱离，拍起所有克隆。④消化完毕后往消化细胞中每孔加入猴IPS培养基（+Y27632 10μM）1ml进行混匀稀释洗一遍原孔。⑤将细胞收集转移至15ml离心管，加入1ml培养基洗一遍原孔并一并转移至15ml离心管。⑥自然沉降5min左右，将大克隆沉至底部，弃上清。⑦再加入2ml培养基轻轻吹打几遍，再次自然沉降5min，弃上清。⑧按1：6至1：10比例接种到新备用的饲养层细胞中，混匀后放入培养箱培养。

2. 恒河猴来源的诱导性多能干细胞的起始分化铺板方法

将上述步骤1传代方法消化得到的多余细胞团块中，加入4-5ml accutase（Sigma，A46964-100ML），37℃消化3min至单细胞状态，300g离心3min，弃上清并加入mTeSR2（StemCell Technologies，Cat#05860）培养基（+Y27632 10μM）进行重悬计数，按照120W每孔接种至由Matrigel（BD systems，Cat#354230）包被的六孔板中，培养24小时后换液撤除Y27632（SelleckChem，Cat#S1049），起始分化。

3. 流式细胞检测方法

将诱导分化完毕的细胞用accutase（Sigma，A46964-100ML）消化成单细胞状态，加入固定渗透液（Fixation and Permeabilization Solution，BD；Cat#554722）过夜固定，隔天用相应的Wash Buffer（BD Perm/WashTMBuffer，Cat#554723）清洗一遍细胞后即可按照检测需求加入相应的一抗过夜孵育，本发明中所涉及的使用流式一抗具体如下：mouseanti-NKX6.1（DSHB，Cat#F55A12），goat anti-PDX1(RD system，Cat#AF2419)。一抗孵育结束后同样用Wash Buffer（BD Perm/WashTMBuffer，Cat#554723）清洗一遍细胞，加入相应种属的荧光二抗孵育2h，本发明中所涉及的使用流式二抗具体如下：goat anti-mousesecondary Antibody，Alexa Fluor 488 conjugate（Life Technology，Cat#A-21121）；donkey anti-mouse secondary Antibody，Alexa Fluor 647 conjugate（LifeTechnology，Cat#A-31571）；二抗孵育结束后用Wash Buffer（BD Perm/WashTMBuffer，Cat#554723）清洗一遍细胞并将细胞转移至流式管中，采用流式细胞仪（BD Calibur）进行检测，用FlowJo软件进行流式结果分析。

4. 细胞免疫荧光实验方法

细胞终止培养，①PBS（Invitrogen，Cat#14190）洗一遍，用4%多聚甲醛（Biosharp，Cat#BL539A）固定14-45min。②固定结束后用PBS（Invitrogen，Cat#14190）洗3遍加入封闭液37℃封闭1h。封闭液：PBST（PBS+0.1%-0.5%TritonX-100）+2%-3%驴血清（JacksonImmuno，Cat#017-000-121）。③一抗孵育：用封闭液稀释相应一抗，4℃过夜孵育。本发明中所涉及的使用免疫荧光一抗具体如下：mouse anti-NKX6.1（DSHB，Cat#F55A12），goatanti-PDX1(RD system，Cat#AF2419)，rabbit anti-SOX9（abcam，Cat#ab185230），④一抗孵育结束后用PBS（Invitrogen，Cat#14190）洗3遍换成相应二抗避光室温孵育1h。二抗配制：PBS（Invitrogen，Cat#14190）+2%-3%驴血清（Jackson Immuno，Cat#017-000-121）+二抗。本发明中所涉及的使用免疫荧光二抗具体如下：goat anti-mouse secondary Antibody，Alexa Fluor 488 conjugate（Life Technology，Cat#A-21121）；donkey anti-mousesecondary Antibody，Alexa Fluor 647 conjugate（Life Technology，Cat#A-31571）；donkey anti-rabbit secondary Antibody，Alexa Fluor 546（Thermo，Cat#A10040）；⑤二抗孵育结束后换成DAPI(Invitrogen，Cat#D3571)染色2-3min，PBS（Invitrogen，Cat#14190）清洗3遍后即可在荧光显微镜下观察。

5. 实时荧光定量PCR实验方法

本发明中所涉及到的Q-PCR各项操作流程均出自于试剂盒说明书步骤。细胞RNA提取全权按照Dtrect-zol RNA Miniprep ZTMO RESEARCH 200 preps kit（简石生物，Cat#TR205-200）说明书操作步骤进行；RNA逆转录全权按照Transcript One-Step GDNAremovaland cDNA synthesis supermix（全式金，Cat#AT311-03）试剂盒说明书操作步骤进行；实时定量PCR步骤全权按照KAPA SYBR FAST Universal qPCR Kit（KAPA biosystems ，Cat#KK4601）试剂盒说明书操作步骤进行。在实时定量PCR仪（ABI，7500）上检测。数据分析采用ΔΔCt法并归一化到未分化的胚胎干细胞。本发明中所涉及的引物序列具体如下：

检测基因PDX1的引物为：Sense：AAAGCTCACGCGTGGAAAG；Anti：CGGCCGTGAGATGTACTTGTT；

检测基因NKX6.1的引物为：Sense：GTTGGGGATGACGGAGAGTC；Anti：TCTTCATCGTTCTCCGAGGC；

检测基因Prox1的引物为：Sense：ACATGCACTACAATAAAGCAAATGA；Anti：CTGCGATAATGGCATTGAA；

检测基因PDX1的引物为：Sense：AAAGCTCACGCGTGGAAAG；Anti：CGGCCGTGAGATGTACTTGTT；

检测基因SOX9的引物为：Sense：CTCCGGCATGAGCGAGG；Anti：TCTCGCTTCAGGTCAGCCTTG；

内参基因GAPDH的引物为：Sense：AATCCCATCACCATCTTCCAGGAG；Anti：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC；

以上对本发明涉及的具体实施方式作了详细说明，但本发明并不完全局限于上述实施方式，在本领域技术人员所具备的知识范围内，可在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。