非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗原表位肽、针对该抗原表位肽的单抗克隆抗体及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟p72蛋白的抗原表位肽、针对该抗原表位肽的单抗克隆抗体及其应用。本发明通过将非洲猪瘟病毒p72基因克隆至原核表达载体pET‑30a中，构建出原核表达载体pET‑30a‑p72，表达并纯化得到p72重组蛋白。将p72重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合获得杂交瘤细胞，应用间接ELISA方法筛选获得抗p72重组蛋白的单克隆抗体，并鉴定了该抗体所对应的p72蛋白的抗原表位肽为非洲猪瘟病毒p72蛋白20～39肽段，其氨基酸序列为

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟p72蛋白的抗原表位肽、针对该抗原表位肽的单抗克隆抗体及其应用。

背景技术

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swinefever Virus, ASFV）引起的一种急性、热性、烈性传染病，致死率高达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前尚未有商品化疫苗可用，早发现、早诊断、早处置、提高生物安全管理水平是目前非洲猪瘟防控的主要措施。

ASFV是一种核质双链DNA病毒，呈二十面体结构，基因组长度为170～193kkb，有150～167个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，从外至内组成依次包括外囊膜蛋白、衣壳蛋白、内囊膜蛋白、内核芯壳蛋白及病毒的基因组。外囊膜蛋白由CD2v、p24、p12等构成，其中，CD2v蛋白介导红细胞吸附，可为ASFV的诊断提供重要依据。衣壳蛋白主要包括一个主蛋白p72，由B646L编码。p72蛋白是ASFV最主要的结构蛋白，约占病毒总质量的31～33%，变异小，具有很强抗原性和免疫原性，是诊断非洲猪瘟的理想标靶分子。

发明内容

本发明采用细胞融合技术，通过亚克隆筛选，成功获得了一株特异性针对p72蛋白的单克隆抗体，并进行了抗原表位鉴定，发现能识别ASFV p72蛋白的肽段（

本发明具体采用以下技术方案：

将非洲猪瘟病毒p72基因克隆至原核表达载体pET-30a中，构建出原核表达载体pET-30a-p72。将pET-30a-p72转化至感受态细胞BL21中，诱导表达p72重组蛋白并对其进行纯化以获得纯度较高的蛋白。将纯化的p72蛋白免疫Balb/c小鼠，待抗体效价达标时，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，从而获得杂交瘤细胞，应用间接ELISA方法筛选特异性针对非洲猪瘟病毒p72蛋白的阳性杂交瘤细胞株。

本发明将扩大培养的杂交瘤细胞注射Balb/c小鼠腹腔，收集腹水，纯化，得到ASFVp72蛋白单克隆抗体。对ASFV p72蛋白单克隆抗体进行抗体亚型的鉴定，分析该抗体重链为IgG2a，轻链为Kappa链。

本发明还通过截短表达非洲猪瘟病毒p72蛋白，确定筛选阳性杂交瘤细胞所针对的抗原表位肽为非洲猪瘟病毒p72蛋白20～39肽段，其氨基酸序列为

本发明的有益效果为：

本发明获得了1株可特异性针对ASFV p72蛋白的单克隆抗体，能够很好地识别ASFV p72 蛋白；亚型鉴定表明该单抗重链为IgG2a，轻链为Kappa链；通过截短表达的 p72蛋白表达，最终确定了该p72蛋白单克隆抗体能特异性识别ASFVp72蛋白20aa～39aa肽段，其氨基酸序列为

附图说明

图1 为实施例2 ASFV p72蛋白的原核表达SDS-PAGE电泳分析图，诱导组表达p72蛋白，大小与预期相符，未诱导组未表达蛋白。图中箭头所示为目标蛋白。

图2 为实施例2 ASFV p72蛋白纯化后SDS-PAGE电泳分析图，表明纯化的ASFV p72蛋白大小与预期相符，并且纯度较高。图中箭头所示为目标蛋白。

图3 为实施例5腹水纯化后ASFV p72蛋白单克隆抗体的SDS-PAGE电泳分析图，重链和轻链小大均合适，并且抗体纯度较高。

图4为实施例6中ASFV p72单克隆抗体亚型检测情况，说明该抗体重链为IgG2a，轻链为Kappa链。

图5为实施例7中ASFV p72单克隆抗体表位鉴定图，说明该单克隆抗体的最小表位为

图6为实施例8中ASFV p72单克隆抗体表位保守性分析结果，说明该单克隆抗体表位在不同毒株中均保守。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

实施例1 重组原核表达载体pET-30a-p72的构建

通过NCBI查找ASFV基因，合成ASFV p72（genbank号：CBW46748.1）基因序列并构建至原核表达载体pET-30a（

实施例2 重组p72蛋白的原核表达与纯化

将重组质粒pET-30a-p72转化感受态细胞BL21中，将转化的菌液均匀地涂布于含卡那霉素（100μg/ml）的LB固体培养基中，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆菌落接种于含卡那霉素（100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、220r/min培养12h，作为种子菌液。取上述种子菌液按1:100比例接种两瓶新鲜的含卡那霉素（100μg/ml）的LB液体培养液中，37℃、220r/min培养至OD

如图1所示，诱导组表达p72蛋白，大小与预期相符，对照组（即未诱导组）未表达p72蛋白。

如图2所示，纯化的ASFV p72蛋白大小与预期相符，并且纯度较高。

验证成功表达后，12000r/min离心2分钟离心收集诱导菌菌体，加入适量的0.01MPBS（pH7.4）进行超声，4℃、12000r/min离心5分钟，吸出上清，沉淀用等体积上清溶液PBS重悬，加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，100℃煮沸8min，SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性情况，结果发现p72重组蛋白以包涵体的形式存在。

实施例3 动物免疫

用BCA蛋白定量试剂盒将纯化的p72重组蛋白进行定量，后用PBS稀释至0.15mg/ml。将稀释好的p72重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，背部皮下分点注射免疫6只6～8周龄雌性Balb/c小鼠，200μl/只。两周后，用不完全弗氏佐剂乳化蛋白，进行加强免疫，免疫剂量和体积同一免。四周后，进行第三次免疫，方法同二免。第三次免疫后7天，剪去小鼠小部分尾部，收集尾部血液约100μl，分离血清，用间接ELISA检测小鼠血清抗体滴度，选取抗体滴度最高的小鼠进行细胞融合。

实施例4 ASFV p72蛋白单克隆抗体的制备

（1）杂交瘤细胞的融合和筛选

SP2/0 细胞的复苏与培养：

融合前10天左右复苏SP2/0 细胞。具体步骤为：将Sp2/0细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴锅中，剧烈摇动使细胞快速融化。将融化后的细胞移至含有10ml RPM1-1640培养基的15ml离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清，加10ml含10% FBS的RPM1-1640培养基吹打混匀，转至细胞培养瓶中贴壁培养。

饲养层细胞的制备：

细胞融合前一天，取6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，摘取眼球采血，收集血液，断颈处死，置于75%的酒精中浸泡5 min。将小鼠固定在解剖板上，腹部朝上。用剪刀在下腹部剪开腹腔，向腹腔轻轻注射5ml HAT培养基，数次弹击后吸出 HAT 培养液。重复该步骤一次，将抽出的细胞混匀，加入96孔的培养板中，100μL/孔，置于 37℃、5% CO

脾细胞的制备：

融合前一天，将含100μgp72重组蛋白的PBS腹腔注射抗体滴度最高的小鼠。脱颈处死小鼠，浸泡在75%的酒精中5min。将小鼠固定在解剖板上，腹部朝上，剪开腹腔，取出脾脏置于含有3ml完全RPM1-1640培养基的60mm直径的培养皿中，剥去脾脏表面脂肪和组织。将脾脏转移至细胞过滤筛中，使用注射器将3ml RPM1-1640注射脾脏不同位置，用剪刀将脾脏剪几处，然后用注射器的栓塞将脾脏挤压至只剩下纤维组织保留在筛子的表面，通过筛子的组织收集在下面的无菌培养皿中，将脾细胞悬液转移到15ml离心管中。室温离心，1000r/min离心5 min，弃上清，用5ml RPM1-1640培养基将细胞悬起，台盼兰活细胞计数。

细胞融合：

取生长良好的SP 2/0细胞，弃掉培养液，用RPM1-1640培养基洗两遍，再用15mlRPM1-1640培养基吹打混匀，转移至50ml离心管中。用RPM1-1640培养基将SP2/0细胞数目与脾脏细胞的数目调整至1:10到1:3之间，轻轻移入50mL离心管中，室温1000r/min离心5min，弃上清，收集细胞，轻弹离心管的底部，使细胞团块混匀。取37℃预热的PEG，用1ml吸管吸取，逐滴缓慢地加入离心管中，读秒计数滴加，1min加1ml PEG，边加边转动离心管，加完后盖上离心管，静置1～2min。吸取37℃预热的无血清RPM1-1640培养基25mL，5 min之内先慢后快加入离心管中，以降低PEG对细胞的毒性作用。室温1000r/min离心5 min，弃上清，用15ml HAT培养基将细胞重悬，移入培养皿中，加入到铺有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，置于37℃、5% CO

阳性杂交瘤细胞的筛选：

观察记录融合细胞的生长情况，培养3～4天时，孔内可见细胞克隆，第5天用HAT培养基进行半量换液，当孔内细胞长满孔底1/3时，采用间接ELISA方法检测融合细胞上清，筛选阳性孔。

间接ELISA方法的具体实施步骤如下：

将纯化的 p72 重组蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/ml，每孔包被100μl，2～8℃包被过夜。用 PBST 洗涤液洗涤 4 次，用 5%BSA 封闭液封闭酶标板，150μl/孔，37℃ 封闭 2小时。弃掉封闭液，在吸水纸上拍干，37℃干燥 2小时。吸取50μl细胞上清加入已包被p72蛋白的酶标板中，37℃ 孵育 30min，PBST 洗涤液洗涤 4 次，拍干。加入100μL用5%BSA按1:15000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育30min，PBST 洗涤液洗涤 4 次，拍干。加底物溶液50μl，37℃孵育 15min 后，加终止液，在酶标仪上读取 OD

实施例5 ASFV p72蛋白单克隆抗体腹水的制备与纯化

腹水的制备：

无菌条件下向8周龄的雌性Balb/c小鼠每只腹腔注射0.5ml灭菌液体石蜡。两周后，将扩大培养的实施例4中筛选的阳性杂交瘤细胞收集，将细胞数量调整至2×10

腹水的纯化：

将上述腹腔液体用结合液（20mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，pH7.4）按照1:10比例稀释之后，加入预加载1ml Protein G琼脂糖凝胶的重力柱进行纯化；纯化前分别用5ml 去离子水和10ml Binding buffer对填料进行洗涤和平衡，然后加入稀释后的腹水，收集流穿液进行分析；用洗脱液进行洗脱，按1ml一管收集10次，每管加入适量1M tris-HCL进行中和。纯化后，每管各取40μl，加入5×上样缓冲液10μl，100℃金属浴煮样8min； SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的大小和纯度；由图3可以看出，目的蛋白的重链和轻链小大与预期相符，为ASFV p72蛋白单克隆抗体。然后合并较为纯的洗脱的样品，-80℃保存，备用。

实施例6 ASFV p72蛋白单克隆抗体的亚型鉴定

按照Proteinech 单克隆抗体亚型鉴定试剂盒操作说明书对ASFV p72蛋白单克隆抗体进行抗体亚型的鉴定，结果表明该抗体重链为IgG2a，轻链为Kappa链，如图4所示。

实施例7 ASFV p72蛋白单克隆抗体识别表位的鉴定

抗原表位的初步鉴定：

如图5所示，首先将p72蛋白（1aa～647aa）分为3段（F1：1aa～500aa；F2：20aa～303aa； F3：430aa～647aa），合成其基因序列并构建原核表达质粒。将合成的质粒转化至感受态细胞BL21中，诱导表达并进行纯化。用蛋白免疫印迹法(Western blot)进行ASFV p72单克隆抗体的抗原表位鉴定，结果表明该单克隆抗体的表位位于20aa～303aa。

抗原表位的进一步确定：

将F2进一步分为3段（F4：20aa～150aa；F5：100aa～220aa；F6：170aa～303aa），合成其基因序列并构建原核表达质粒。如上述条件进行诱导表达、纯化及鉴定，结果该单克隆抗体的表位位于20aa～99aa。

抗原表位的进一步精确鉴定：

将20aa～99aa进一步分为3段（F7：20aa～59aa；F8：40aa～79aa；F9：60aa～99aa），合成其基因序列并构建原核表达质粒。如上述条件进行诱导表达、纯化及鉴定，结果表明该单克隆抗体的表位位于20aa～39aa。

对20aa～39aa进一步分为3段（F10：20aa～29aa；F11：25aa～34aa；F12：30aa～39aa），合成其基因表达序列并构建原核表达质粒。结果发现该单克隆抗体与F10、F11、F12均没有反应，确认该单克隆抗体的表位位于20aa～39aa。

上述F1～F12的基因序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:14所示。

实施例8 ASFV p72蛋白单克隆抗体识别表位的保守性分析

从GenBank数据库下载13条ASFV p72基因序列（China/2018/AnhuiXCGQMK128995；China_ASFV-SY18_2018KP055815；China_LN_2018MK333181；Russia_Georgia_2007FR682468；Portugal_OURT_88.3_1988MN318203；Spain_BA71_1971KP055815；Italy_26544_OG10_2010KM102979；Malawi_Tengani_1962 AY261364；Namibia_Warthog_1980AM712239；Uganda_R35_2015MH025920；Uganda_R8_2015MH025916；Kenya_1950AM712239；Malawi_Lil_1983AM712239），包括基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ的主要代表毒株。用MEGA-X软件对这13条p72氨基酸序列进行比对分析。结果发现不同ASFV毒株的20aa～39aa位氨基酸均保守，如图6所示。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。