一种抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的解聚酶及其应用

摘要

本发明适用于生物技术领域，提供了一种抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的解聚酶Depo61，为对K2型肺炎克雷伯氏菌噬菌体P‑kp3第61位开放阅读框，进行原核表达和纯化产物，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明制备得到的可以解聚酶Depo61有效抑制K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜的形成，并且能高效清除已形成的K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜，还可配置成喷洒液等液体试剂，为养殖器具、医疗器械及植入医疗设备等塑料、玻璃、金属等器具提供高效安全的消毒或清洁制剂，有显著的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的解聚酶及其应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是一种常见的人畜共患病原菌，临床和畜禽养殖业大量抗生素的不合规使用，导致肺炎克雷伯菌的耐药情况愈发严重，多重耐药肺炎克雷伯氏菌已成为医院获得性感染的最主要病原体之一，引起世界卫生组织的重点关注，肺炎克雷伯菌感染已经严重影响了人类的健康和公共卫生安全，并且严重威胁了家畜养殖业及畜牧生产的发展。

大多数肺炎克雷伯菌细胞表面被一层致密的荚膜多糖层包裹，荚膜多糖作为细菌的天然屏障，是一种重要的毒力因子，能够协助细菌菌体阻断抗生素渗透，并且在促进病原体定植和逃避宿主免疫方面起到重要作用，荚膜多糖的存在，使肺炎克雷伯对公众健康更具威胁。不仅如此，一些肺炎克雷伯菌能够形成生物被膜，生物被膜是指细菌黏附于接触表面，分泌胞外多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等包裹细菌细胞所形成的膜状结构，生物被膜形成后，对抗生素和宿主免疫有着较强的抵抗力，对抗菌剂存在固有耐受性，难以彻底清除。另外，生物被膜形成也是医院内细菌感染的主要致病因素，例如尿道感染和通过植入医疗设备引起的心内膜炎、腹膜炎等，超过65％的装置相关细菌感染涉及生物被膜，而肺炎克雷伯菌生物被膜也是最常见的细菌生物被膜。涉及生物被膜形成的细菌感染的治疗干预极具挑战性，因此，迫切需要开发控制生物被膜相关感染的替代策略。

噬菌体衍生蛋白——解聚酶是由噬菌体编码、可特异性降解细菌表面多糖的蛋白，解聚酶能够特异性降解细菌荚多糖，减弱细菌对不利环境的抗逆能力，使细菌更易被机体的免疫系统清除。目前有研究表明，解聚酶凭借对多糖成分的降解作用，能够有效地抑制细菌生物被膜的形成，并去除细菌的生物被膜结构。然而，目前大多数肺炎克雷伯菌噬菌体解聚酶仅能抑制细菌生物被膜的形成，对生物被膜的清除效果不显著，研究能够抑制、清除生物被膜的新型噬菌体解聚酶具有重要意义。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的解聚酶，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

本发明公开一种K2型肺炎克雷伯氏菌噬菌体P-kp3，所述的菌株已于2022年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏名为vB_KpnP_Ou2，保藏编号为CCTCCNO：M 20221636。

本发明实施例是这样实现的，一种抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的解聚酶Depo61，为对K2型肺炎克雷伯氏菌噬菌体P-kp3第61位开放阅读框，进行原核表达和纯化产物，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明实施例还提供了一种depo61基因，编码上述解聚酶Depo61，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明实施例还提供了一种上述抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的解聚酶Depo61的制备方法，包括以下步骤：

通过PCR、双酶切、连接分子克隆手段，将来自K2型肺炎克雷伯氏菌噬菌体P-kp3第61位开放阅读框的depo61基因连接至pET28a质粒内，得到pET28a-Depo61质粒，将pET28a-Depo61质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，通过卡那霉素抗生素平板筛选获得重组大肠杆菌BL21-pET28a-Depo61；

将重组大肠杆菌BL21-pET28a-Depo61接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养至对数生长期，然后在培养液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，振荡培养，诱导蛋白表达；

将诱导表达的BL21-pET28a-Depo61菌液离心，然后用蛋白纯化缓冲液悬浮菌体，并进行超声破碎，将上清液加入平衡后的Ni-NTA亲和层析柱，待上清液与Ni柱充分结合后，使用缓冲液洗涤Ni柱以去除杂蛋白，最后收集洗脱液，并经超滤得到纯化的解聚酶Depo61。

本发明实施例还提供了一种上述解聚酶Depo61在制备抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的药物中的应用。

本发明实施例还提供了一种上述解聚酶Depo61在制备清除K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的药物中的应用。

本发明实施例还提供了一种上述解聚酶Depo61在制备抗生素替代制剂上的应用。

本发明实施例还提供了一种上述解聚酶Depo61在制备医疗器械(还可以是养殖器皿、植入医疗设备等塑料、玻璃、金属等器具)消毒剂上的应用。

本发明实施例提供的一种抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的解聚酶Depo61，可以有效抑制K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜的形成，并且能高效清除已形成的K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜，还可配置成喷洒液等液体试剂，为养殖器具、医疗器械及植入医疗设备等塑料、玻璃、金属等器具提供高效安全的消毒或清洁制剂，有显著的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例提供的解聚酶Depo61的SDS-PAGE电泳图；

图2为本发明实施例提供的解聚酶Depo61对K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜形成的抑制作用试验结果；

图3为本发明实施例提供的解聚酶Depo61抑制K2型肺炎克雷伯氏菌形成生物被膜的扫描电子显微镜结果；

图4为本发明实施例提供的解聚酶Depo61对K2型肺炎克雷伯氏菌已形成的生物被膜清除效果试验结果；

图5为本发明实施例提供的解聚酶Depo61对K2型肺炎克雷伯氏菌细菌生物被膜清除效果的扫描电镜结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例1

一种抑制K2型肺炎克雷伯菌生物被膜的解聚酶Depo61的制备方法，包括以下步骤：

1)通过PCR、双酶切、连接等分子克隆手段，将来自肺炎克雷伯氏菌噬菌体的尾丝蛋白基因(depo61基因，其核苷酸序列为SEQ No.1所示)连接至pET28a质粒内，将pET28a-Depo61质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，通过卡那霉素抗生素平板筛选获得重组大肠杆菌BL21-pET28a-Depo61；

2)将重组大肠杆菌BL21-pET28a-Depo61接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期(OD

3)将诱导表达的BL21-pET28a-Depo61菌液离心，然后用适量的蛋白纯化缓冲液(称取NaCl 8.766g，Na2HPO48.953g，加入去离子水定容至500mL)悬浮菌体，并进行超声破碎；

4)将上清液样品加入平衡后的Ni-NTA亲和层析柱，待上清液与Ni柱充分结合后，使用含20mM咪唑与含50mM咪唑的缓冲液洗涤Ni柱以去除杂蛋白，最后收集含500mM咪唑的洗脱液，并经超滤得到纯化的解聚酶Depo61，经过测序鉴定后可知，Depo61的氨基酸序列为SEQ No.2所示；

5)使用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的解聚酶进行浓度测定，分装并保存于-80℃冰箱；

对纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和浓度测定，纯化蛋白电泳图如图1所示(1泳道为Marker，2泳道为上清蛋白，3泳道为500mM咪唑洗脱液，4泳道为纯化蛋白)，表达的解聚酶分子量约63.47kDa。

实施例2

利用纯化的噬菌体衍生蛋白——解聚酶Depo61抑制K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜的形成：

取50μL过夜培养的肺炎克雷伯氏菌kp3稀释于5mL的LB培养基中，然后在96孔细胞培养板中每孔接种150μL稀释后的菌液，接种后，每孔加入50μL纯化的解聚酶Depo61，使终浓度为50μg/mL，37℃培养箱静止培养48h后，用移液枪弃去培养基并用无菌PBS缓冲液清洗两次以去除游离细菌及蛋白，然后每孔加入200μL甲醇，固定30min，弃去固定液后自然风干，然后每孔加入200μL0.1％的结晶紫溶液进行生物被膜染色，30min后弃去染色液，用PBS缓冲液清洗两次，自然风干后每孔加入200μL33％的冰醋酸溶液，室温放置2h；

使用酶标仪测定其在630nm波长处的吸光度，该吸收值在一定范围内与被膜的产量成正比关系，根据OD

如图2所示，噬菌体解聚酶Depo61对K2型肺炎克雷伯氏菌kp3所形成生物被膜的抑制率为61％。

实施例3

利用纯化的噬菌体衍生蛋白——解聚酶Depo61抑制K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜的形成：

在无菌6孔细胞培养板中置入无菌圆形载玻片，取50μL过夜培养的肺炎克雷伯氏菌kp3稀释于5mL的LB培养基中，然后在96孔细胞培养板中每孔接种150μL稀释后的菌液，保证圆形载玻片被完全覆盖，在接种后的6孔细胞培养板中每孔加入50μL纯化的蛋白Depo61，使终浓度为50μg/mL，37℃培养箱静止培养48h后，用移液枪弃去培养基并用无菌PBS缓冲液清洗两次以去除游离细菌及蛋白，然后每孔加入200μL 4％戊二醛固定，4h后弃去固定液自然风干，然后每孔依次加入200μL不同浓度的乙醇(10％，30％，50％，70％，90％和100％)脱水，每次30min，干燥过夜；

通过扫描电子显微镜观察解聚酶Depo61抑制K2型肺炎克雷伯氏菌形成生物被膜的效果如图3所示。

实施例4

利用纯化的噬菌体衍生蛋白——解聚酶Depo61清除K2型肺炎克雷伯氏菌已形成的生物被膜：

取50μL过夜培养的肺炎克雷伯氏菌kp3稀释于5mL的LB培养基中，然后在96孔细胞培养板中每孔接种150uL稀释后的菌液，37℃培养箱静止培养48h后，用移液枪弃去培养基并在每孔加入200μL纯化的蛋白Depo61稀释液，使终浓度为200μg/mL，将培养板再次置于37℃培养箱中培养48h后，弃去培养基并用无菌PBS缓冲液清洗两次去除游离细菌及蛋白，然后每孔加入200μL甲醇，固定30min，弃去固定液后自然风干，然后每孔加入200μL0.1％的结晶紫溶液进行生物被膜染色，30min后弃去染色液，用PBS缓冲液清洗两次，自然风干后每孔加入200μL33％的冰醋酸溶液，室温放置2h；

使用酶标仪测定其在630nm波长处的吸光度，该吸收值在一定范围内与被膜的产量成正比关系，根据OD

如图4所示，解聚酶Depo61对K2型肺炎克雷伯氏菌kp3所形成生物被膜的清除率分别为68％。

实施例5

利用纯化的噬菌体衍生蛋白——解聚酶Depo61清除K2型肺炎克雷伯氏菌已形成的生物被膜：

在无菌6孔细胞培养板中置入无菌圆形载玻片，取50μL过夜培养的肺炎克雷伯氏菌kp3稀释于5mL的LB培养基中，然后在96孔细胞培养板中每孔接种150μL稀释后的菌液，保证圆形载玻片被完全覆盖，37℃培养箱静止培养48h后，用移液枪弃去培养基并在每孔加入200μL纯化的蛋白Depo61稀释液，使终浓度为200μg/mL，将培养板再次置于37℃培养箱中培养后，弃去培养基并用无菌PBS缓冲液清洗两次以去除游离细菌及蛋白，然后每孔加入200μL 4％戊二醛固定，4h后弃去固定液自然风干，然后每孔依次加入200μL不同浓度的乙醇(10％，30％，50％，70％，90％和100％)脱水，每次30min，干燥过夜；

通过扫描电子显微镜观察解聚酶Depo61清除K2型肺炎克雷伯氏菌已形成的生物被膜的效果如图5所示。

由图2、图3、图4、图5可以看出，本发明实施例制备得到的解聚酶Depo61可以有效抑制K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜的形成，并且能高效清除已形成的K2型肺炎克雷伯氏菌生物被膜。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。