RIPK1基因突变形式在诊断自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大中的应用

摘要

本发明公开了RIPK1基因突变形式在诊断自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大中的应用。本发明提供了一种突变蛋白，是将人RIPK1蛋白的第646位氨基酸残基由缬氨酸突变为谷氨酸得到的蛋白质。本发明还提供了一种突变基因，是将RIPK1基因进行突变得到的基因；所述RIPK1基因为人基因组中编码RIPK1蛋白的基因；所述突变为将编码RIPK1蛋白的第646位氨基酸残基的密码子由编码缬氨酸的密码子突变为编码谷氨酸的密码子。所述突变蛋白或所述突变基因可以作为靶标物开发用于诊断自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大的试剂或试剂盒，为自身炎症性疾病临床诊断和治疗提供了新的方向。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物医学领域，涉及RIPK1基因突变形式在诊断自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大中的应用。

背景技术

自身炎症性疾病(systemic autoinflammatory diseases,SAIDs)是由固有免疫异常所引起的一组罕见的多系统风湿免疫疾病，主要表现为不明原因的反复发热以及全身多系统自身炎症。过去二十年，由于人类对于基因组学的研究不断深入，以及测序技术的飞速发展，越来越多的基因被鉴定为自身炎症性疾病的致病基因，自身炎症性疾病的疾病谱也在不断扩展。数据库的建立、致病基因研究的深入对自身炎症性疾病患者的诊断和治疗也提供了宝贵的数据基础。

自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大(Autoinflammation with episodic feverand lymphadenopathy，AIEFL)是2019年新定义的一组自身炎症性疾病，被收录于人类孟德尔遗传数据库(https://omim.org/)，OMIM编号为618852。2019年，两组团队在Nature发表背对背研究，详细的描述了AIEFL的临床特征以及致病基因RIPK1的功能验证，并报道了D324N、D324H、D324Y等在蛋白质序列高度保守的324位点上致病杂合突变。AIEFL的遗传方式为常染色体显性遗传，并伴有自发的发热和淋巴结病。由于RIPK1基因所编码的蛋白质RIPK1是凋亡以及坏死性凋亡等细胞程序性死亡的关键调控分子，因此RIPK1的保守序列的突变可能会引起先天免疫的异常激活，引起自身炎症性疾病的发生。基因RIPK1的突变位点在遗传性自身炎症性疾病基因突变Infevers数据库(https://infevers.umai-montpellier.fr/web/)仍在不断增加报道，对于其认识的加深可为临床确定和诊治自身炎症性疾病提供依据。

发明内容

本发明的目的是提供自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大相关基因RIPK1的突变形式的应用。

第一方面，本发明提供了用于检测特异突变的物质在制备试剂盒中的应用；

所述特异突变为：人基因组中的RIPK1基因中发生的突变，该突变引起形成转录本的cDNA发生变化，从而使翻译得到的蛋白质由序列表的序列2所示的蛋白质突变为序列表的序列4所示的蛋白质；

所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：

(c1)自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大患者的筛查或辅助筛查；

(c2)自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大胚胎的筛查或辅助筛查；

(c3)诊断或辅助诊断自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大的患者。

具体的，上述形成转录本的cDNA发生的变化为：由序列表的序列1所示的DNA分子突变为序列表的序列3所示的DNA分子。

第二个方面，本发明还提供了一种试剂盒，包括用于检测特异突变的物质；

所述特异突变为：人基因组中的RIPK1基因中发生的突变，该突变引起形成转录本的cDNA发生变化，从而使翻译得到的蛋白质由序列表的序列2所示的蛋白质突变为序列表的序列4所示的蛋白质；

所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：

(c1)自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大患者的筛查或辅助筛查；

(c2)自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大胚胎的筛查或辅助筛查；

(c3)诊断或辅助诊断自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大的患者。

具体的，形成转录本的cDNA发生的变化为：由序列表的序列1所示的DNA分子突变为序列表的序列3所示的DNA分子。

前文中，用于检测特异突变的物质为特异引物对，由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列表的序列6所示的单链DNA分子组成。

上述筛查对象来源于自身炎症性疾病患者或者具有间歇性发热以及发热时淋巴结肿大的临床特征的患者。

第三个方面，本发明还提供了一种突变蛋白，是将RIPK1蛋白的第646位氨基酸残基由缬氨酸突变为谷氨酸得到的蛋白质。

具体的，所述突变蛋白如序列表的序列4所示。

第四个方面，本发明还提供了一种突变基因，是将RIPK1基因进行突变得到的基因；所述RIPK1基因为人基因组中编码RIPK1蛋白的基因；所述突变为将编码RIPK1蛋白的第646位氨基酸残基的密码子由编码缬氨酸的密码子突变为编码谷氨酸的密码子。

具体的，所述突变基因如序列表的序列3所示。

第五个方面，本发明还提供了如下应用：

前文中的突变蛋白或前文中的突变基因作为靶标物在开发用于诊断或辅助诊断自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大的患者的试剂或试剂盒中的应用。

前文中的突变蛋白或前文中的突变基因作为靶标物在开发用于治疗自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大的患者的试剂或试剂盒中的应用。

本发明通过对先证者进行全外显子组高通量测序，发现了自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大致病基因新的突变形式，该突变可以作为自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大临床诊断的分子标志物和新型药物研发的靶标。本发明的发现为解析自身炎症性疾病的致病机制提供了依据，也为自身炎症性疾病临床诊断和治疗提供了新的方向。

附图说明

图1为先证者的C反应蛋白在发热期和发热间期的变化。

图2为全基因组测序中RIPK1基因突变结果。

图3为先证者及其家系成员的靶标位点测序结果。

图4为先证者转录组测序GSEA分析结果。

图5为蛋白质保守序列频率图。

图6为酶联免疫吸附测定先证者和健康人经过不同刺激后IL-1β含量。

图7为蛋白质印记测定先证者和健康人经过不同刺激后炎症通路的蛋白表达。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

人RIPK1蛋白及其编码基因见GENBANK ACCESSION NO.NM_003804.6。

实施例1、RIPK1基因的突变形式的发现

一、先证者信息

男性，31岁，反复发热5年。患者5年前开始无诱因

经临床诊断，该患者为自身炎症性疾病患者，且具有间歇性发热以及发热时淋巴结肿大的临床特征(先证者信息中的下划线标注部分，均为自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大的典型表型)，因此高度怀疑其为RIPK1基因相关自身炎症性疾病的患者。

二、对先证者进行全基因组测序

1.标本采集：在知情同意的前提下，采集EDTA抗凝血。

2.DNA提取：使用血液基因组柱式中量提取试剂盒(天根)提取外周血中基因组DNA,操作按照试剂盒说明书进行。所提取DNA样本用Qubit 2.0型荧光计及0.8％的琼脂糖凝胶电泳对所提供的DNA样本进行质检，合格后继续后续步骤。

3.文库构建：采用IDT公司

4.测序：通过华大智造公司的DNBSEQ-T7测序仪进行高通量测序(PE150)，目标序列测序覆盖度不低于99％。

5.生物信息学分析：

(1)质控：使用fastp软件对原始数据进行质控，去除接头、低质量reads等。

(2)得到变异：使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件将测序序列与Ensemble参考基因组GRCh37/hg19比对；然后使用GATK软件分析出SNP、Indel；最后根据测序深度、突变质量对检测到的SNP、Indel进行过滤和筛选，得到高质量可靠的突变。

(3)变异注释及预测：使用自主开发的变异注释软件对检测到的高质量变异进行各大数据库(如dbSNP,千人基因组，ExAC，ESP等频率数据库及OMIM,HGMD,ClinVar等)的关联注释。借助Provean、SIFT、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV、M-Cap、Revel、Mutationtaster等蛋白结构预测软件，MaxEntScan剪切位点预测软件等对其危害性进行分析，筛选出对蛋白结构可能有有害影响的变异。

结果如下：

先证者的RIPK1基因发生了如下突变：NM_003804:c.1937(exon11)T>A(p.Val646Glu)，突变类型为杂合型(见图2)。即，先证者在RIPK1基因的第11外显子中发生了T→A的单核苷酸突变，从而引起编码的蛋白质中第646位的缬氨酸突变为谷氨酸。即，先证者的一条染色体中形成正常的RIPK1基因转录本(cDNA如序列表的序列1所示，表达序列表的序列2所示的蛋白质)，另一条染色体中形成突变型RIPK1基因转录本(cDNA如序列表的序列3所示，表达序列表的序列4所示的蛋白质)。

自身炎症性疾病分为单基因自身炎症性疾病和多基因多因素自身炎症性疾病。多基因多因素自身炎症性疾病包括成人still病、白塞病等，病因尚不明确，并非由某种特定致病基因所致。先证者的临床表现与上述多基因多因素自身炎症性疾病不符，并存在RIPK1基因突变，因此可排除多基因多因素自身炎症性疾病。另一方面，单基因自身炎症性疾病的诊断需要结合临床表现和基因检测结果进行确诊。先证者临床表型符合自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大的表型表现，并且除RIPK1基因c.1937T>A(p.Val646Glu)杂合突变外未发现其余可以解释患者临床表现的基因突变，该RIPK1基因突变也可以充分解释先证者的临床表型，因此可以排除其余单基因自身炎症性疾病，最终确诊先证者为RIPK1基因相关自身炎症性疾病。

因此，综合步骤一和步骤二，可以判断该患者为RIPK1基因相关自身炎症性疾病的患者。

三、对先证者的家系成员进行靶标位点测序

根据RIPK1基因所验证位点chr6:3113494c.1937(exon11)T>A

序列设计引物如下。

RIPK1_F(序列表的序列5)：GGCCAGATGTAAGCGGAGAA

RIPK1_R(序列表的序列6)：GGCTGACGTAAATCAAGCTGC

供试者：先证者、先证者的父亲、先证者的母亲。

1、取供试者的外周血，提取基因组DNA。采用Nanodrop 2000对提取的基因组DNA进行质检，质检标注：DNA浓度≥20ng/μL。

2、将步骤1得到的基因组DNA作为模板，采用RIPK1_F和RIPK1_R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并测序。

基因序列分析：RIPK1基因所验证位点的PCR扩增产物，用ABI 3730XL测序仪测序，测序引物采用原PCR引物。基因序列分析采用DNASTAR软件进行序列分析和比对。

先证者的突变位点及其周边的测序结果见图3A。先证者的父亲的突变位点及其周边的测序结果见图3B。先证者的母亲的突变位点及其周边的测序结果见图3C。

结果表明：先证者的父亲两条染色体上的RIPK1基因并未发生所述突变(先证者的父亲无自身炎症性疾病相关临床表现)；先证者母亲一条染色体RIPK1基因发生所述突变，另一条染色体RIPK1基因未发生所述突变(先证者的母亲有自身炎症性疾病相关临床表现间断发热)；先证者一条染色体RIPK1基因发生所述突变，另一条染色体RIPK1基因未发生所述突变。

上述突变为正常的RIPK1基因转录本(cDNA如序列表的序列1所示，表达序列表的序列2所示的蛋白质)形成突变型RIPK1基因转录本(cDNA如序列表的序列3所示，表达序列表的序列4所示的蛋白质)。

先证者的突变属于致病基因新发现的变异位点，其变异来源于母亲，母亲也有自身炎症性疾病的典型表现间断发热，可验证突变的致病性。

实施例2、患者转录组测序的实施

一、从患者外周血中提取RNA

1、在15ml离心管中一次分别加入先证者外周血和磷酸缓冲盐溶液吹打稀释混匀。

2、另取15ml离心管向底部添加4ml人淋巴细胞分离液，倾斜离心管至30-45度角，吸取8ml稀释的血液缓慢加入人淋巴细胞分离液液面上方，保持两液面界面清晰。

3、将15ml离心管转移到高速冷冻离心机，设置提速加速度3，降速加速度3，离心力1800rpm，离心20分钟。

4、离心完成后吸取PBMCs细胞层，转移到15ml离心管，在离心管中加满磷酸缓冲盐溶液，盖上盖子颠倒混匀。15ml离心管转移到高速冷冻离心机清洗细胞。

5、离心完成后，从离心机中取出富集细胞沉淀的离心管，弃上清，加入磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，再次离心，弃去上清后加入TRlzol Reagent留取RNA。

二、RNAseq的实施

1、实验流程

对总样品的RNA进行分离和纯化，然后用NanoDrop ND-1000(NanoDrop,Wilmington,DE,USA)对总RNA的量与纯度进行质控并通过Bioanalyzer 2100(Agilent,CA,USA)对RNA的完整性进行检测；浓度>50ng/μL，RIN值>7.0，total RNA>1μg满足下游实验。使用oligo(dT)磁珠(Dynabeads Oligo(dT),cat.25-61005,Thermo Fisher,USA)通过两轮纯化对其中的带有PolyA(多聚腺苷酸)的mRNA进行特异性捕获。将捕获到的mRNA在高温条件下利用镁离子打断试剂盒(NEBNextR Magnesium RNA Fragmentation Module,cat.E6150S,USA)进行片段化，94℃5-7分钟。将片段化的RNA通过逆转录酶(InvitrogenSuperScriptTM II Reverse Transcriptase,cat.1896649,CA,USA)的作用下合成cDNA。然后使用E.coli DNA polymerase I(NEB,cat.m0209,USA)与RNase H(NEB,cat.m0297,USA)进行二链合成，将这些DNA与RNA的复合双链转化成DNA双链，同时在二链中掺入dUTPSolution(Thermo Fisher,cat.R0133,CA,USA)，将双链DNA的末端补齐为平末端。再在其两端各加上一个A碱基，使其能够与末端带有T碱基的接头进行连接，并利用磁珠对其片段大小进行筛选和纯化。以UDG酶(NEB,cat.m0280,MA,US)消化二链，再通过PCR—预变性95℃保持3分钟，98℃变性总计8个循环每次15秒,退火到60℃保持15秒,72℃下延伸30秒，最后延伸72℃保留5分钟，使其形成片段大小为300bp±50bp的文库(链特异性文库)。最后，使用illumina NovaseqTM 6000(LC Bio Technology CO.,Ltd.Hangzhou,China)按照标准操作对其进行双端测序，测序模式为PE150。

2、分析流程

获得测序下机数据后，对下机数据进行过滤，获得高质量的测序数据(CleanData)，然后将高质量的测序数据比对到本项目物种的参考基因组上，并进行基因表达定量，使用GSEA分析基于所有基因的表达量信息，以Signal2Noise为标准对基因进行排序(默认降序排列)，分析特定基因集在所有基因的排名，然后对该基因集所在的通路或Term进行打分，分值称为ES(enrichment score)值。基于基因集进行permutation test，计算出显著性p值，最后对标准化的ES值(NES值)进行多种检验矫正，得到FDR值。通常认为|NES|>1，NOM.pval<0.05，FDR.qval<0.25的基因集合是有意义的,对15-500大小的基因集进行GSEA分析。

取GSEA-GO分析结果中P值最小和FDR值最小的前30个基因集进行绘图展示，横坐标为基因集的NES值，颜色代表P值或FDR值，分析结果见图4，显示出先证者相对于健康对照有I型干扰素通路、干扰素γ通路及多种炎症通路激活，验证了患者的炎症表型。

实施例3、蛋白质保守序列频率图绘制

使用在线工具NCBI protein数据库下载RIPK1蛋白质311种脊椎动物对应的同源氨基酸序列，对其进行多序列比对分析，并进行蛋白质保守频率的分析。

分析步骤如下：

1、在NCBI网站的protein数据库检索RIPK1，并在Homo sapiens(human)的列表中点击Orthologs。

2、选择同源序列：筛选与人类氨基酸长度相似的氨基酸序列，选择了包括人类在内的311种脊椎动物，点击Protein alignment，进行在线比对分析。

3、将比对后的序列下载后在WebLogo 3(http://weblogo.threeplusone.com)中打开，调整相应参数绘制蛋白质保守序列频率图。

蛋白质保守序列频率图见图5。发现先证者基因突变位点在这三百一十一种脊椎动物中属于保守序列，提示了位点改变可能会致病。

因此，RIPK1基因的突变位点(p.Val646Glu)或含有该突变位点的突变基因或突变蛋白可作为辅助筛查是否患有自身炎症伴阵发发热和淋巴结肿大的靶标。

RIPK1基因的突变位点(p.Val646Glu)为序列2第646位的缬氨酸突变为谷氨酸。

实施例4、先证者外周血单个核细胞炎症因子和蛋白检测

1、在15ml离心管中一次分别加入先证者与健康对照外周血和磷酸缓冲盐溶液吹打稀释混匀。

2、另取15ml离心管向底部添加4ml人淋巴细胞分离液，倾斜离心管至30-45度角，吸取8ml稀释的血液缓慢加入人淋巴细胞分离液液面上方，保持两液面界面清晰。

3、将15ml离心管转移到高速冷冻离心机，设置提速加速度3，降速加速度3，离心力1800rpm，离心20分钟。

4、离心完成后吸取外周血单个细胞层，转移到15ml离心管，在离心管中加满磷酸缓冲盐溶液，盖上盖子颠倒混匀。15ml离心管转移到高速冷冻离心机清洗细胞。

5、离心完成后，从离心机中取出富集细胞沉淀的离心管，弃上清，加入磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，再次离心，弃去上清后分别用培养基，或者刺激因子培养基重悬，最后形成三种条件培养的细胞，分别为对照组(使用培养基重悬，图中记作con)，TNF刺激组(含TNF刺激因子培养基重悬，最终TNF刺激浓度为100ng/ml，图中记作TNFa)和TNF与zVAD-fmk共同刺激组(其中TNF刺激浓度为100ng/ml，zVAD-fmk刺激浓度为10uM，图中记作TNFa+zVAD),放入37摄氏度含有5％CO2的孵箱中培养18小时。

6、培养18小时留取上清和蛋白待检测。

7、使用人白介素1β(IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒(依科赛，EH001-96)检测收集上清的IL-1β含量(图6)，最后发现相比于健康对照，先证者经过TNF刺激后，IL-1β显著升高，提示其炎症通路激活状态。

8、使用蛋白质印记实验对先证者进行炎症通路的蛋白表达探索，结果(图7)显示患者炎症通路存在异常激活。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。