利用滇龙胆愈伤生产龙胆苦苷的方法

摘要

利用滇龙胆愈伤生产龙胆苦苷的方法，涉及中药材组织培养。本发明的方法包括外植体的清洁与消毒、愈伤诱导、优质愈伤筛选、愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养步骤；步骤中愈伤诱导培养基为MS+2,4‑D 0.5‑0.8mg/L+NAA 0.1‑0.2mg/L+6‑BA 0.1‑0.2mg/L；愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养的培养基为MS+2,4‑D 0.5‑0.6mg/L+TDZ 1.0‑2.0mg/L+多效唑1.0‑2.0mg/L+硝酸银0.2‑0.3mg/L+滇龙胆根酶解液5‑15ml/L。本发明在愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养过程中，采用温差刺激，可有效刺激龙胆苦苷的积累，较常规培养方法的积累量提高1.2倍左右。经本发明培养所得的愈伤中龙胆苦苷含量可达到原植株药材的0.5倍左右，生产周期仅为20‑25天，而滇龙胆药材的种植周期为3‑4年，极大的缩短了生产周期，一定程度的降低了生产成本。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材组织培养，尤其涉及滇龙胆愈伤生产龙胆苦苷的方法。

背景技术

龙胆苦苷（Gentiopcroside）又名龙胆苦甙，是龙胆药材的有效成分之一，其含量是最重要的质量指标，现代医药研究表明龙胆苦苷具有抗炎镇痛、保肝利胆、健脾胃等作用。

龙胆苦苷广泛存在于滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.）、条叶龙胆（G.manshurica Kitag．）、三花龙胆（G.triflora Pall.）、龙胆（G. scabra Bge.）、秦艽（G.macrophμlla Pall.）、麻花秦艽（G.straminea Maxim.）等植物中。

目前龙胆苦苷主要是通过人工栽培或采挖龙胆或秦艽药材，并提取纯化获得。在利用生物技术生产龙胆苦苷方面，目前仅有王海涛发表的（《麻花秦艽和大叶秦艽细胞培养研究》[D]，西宁：青海大学，2014）有相关研究报道，在齐香君发表的（《秦艽细胞悬浮培养研究》[J]，中草药，2010，41（3）：472-475）和马继雄发表的（《祁连龙胆愈伤组织和再生植株的生长及其两种药效成分分析》[J]，山东大学学报，2006，41（6）：157-160）进行了细胞悬浮培养中细胞或愈伤龙胆苦苷的检测。

而对于利用滇龙胆生产龙胆苦苷的生物技术研究还未有报道。

发明内容

本发明的目的是提出一种利用滇龙胆愈伤生产龙胆苦苷的方法，填补了生物技术生产龙胆苦苷的空缺。

利用滇龙胆愈伤生产龙胆苦苷的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤1，外植体的清洁与消毒；

步骤2，愈伤诱导；

步骤3，优质愈伤筛选；

步骤4，愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养；

步骤2所述的愈伤诱导培养基为MS+2,4-D 0.5-0.8mg/L+NAA 0.1-0.2mg/L +6-BA0.1-0.2mg/L；

步骤4所述的愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养的培养基为MS+2,4-D 0.5-0.6mg/L+TDZ 1.0-2.0mg/L+多效唑1.0-2.0mg/L+硝酸银 0.2-0.3mg/L+滇龙胆根酶解液5-15ml/L；

所述滇龙胆根酶解液由切碎的成年滇龙胆新鲜根及根茎中加入水、半纤维素酶和果胶酶酶解后离心取上清液获得，pH为3.0；其中，每升水中加入切碎的滇龙胆新鲜根及根茎50-60g、半纤维素酶30-50g、果胶酶50-60g。

所述的愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养的培养环境为在温度25±2℃，光强3000-4000lx下培养14-16小时，后转移至温度4±2℃，全黑暗下培养8-10小时，连续培养20-25天。

所述愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养基pH调到4.8-5.0。

所述步骤4中 MS培养基里蔗糖改为麦芽糖，麦芽糖含量为10-15g/L。

所述步骤3的优质愈伤为具有丛芽的愈伤组织。

步骤4所述的滇龙胆根酶解液，制备方法为：取成年滇龙胆新鲜根及根茎，洗净泥土后切碎，称取50g并加入1L水，加入30g半纤维素酶和50g果胶酶，pH调至3.0，在摇床上以120r/min，温度为45±2℃下酶解2h，获得的悬浮液经离心分离的澄清液即得。

本发明的筛选优质愈伤，为具丛芽愈伤，其滇龙胆苦苷含量比不具丛芽愈伤高近2倍，提高了滇龙胆苦苷积累的起点。在愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养基中，添加一定浓度的多效唑、硝酸银和滇龙胆根酶解液，可有效促使愈伤中的龙胆苦苷含量积累量较不添加诱导子增加4倍左右。本发明在愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养过程中，采用温差刺激，可有效刺激龙胆苦苷的积累，较常规培养方法的积累量提高1.2倍左右。经本发明培养所得的愈伤中龙胆苦苷含量可达到原植株药材的0.5倍左右，其生产周期仅为20-25天，而滇龙胆药材的种植周期为3-4年，极大的缩短了生产周期，一定程度的降低了生产成本。

附图说明

图1为滇龙胆优质愈伤的诱导图。

图2为滇龙胆愈伤的龙胆苦苷积累培养图。

具体实施方式

实施例1：利用滇龙胆愈伤生产龙胆苦苷的方法，包括以下步骤：

1、外植体的清洁与消毒：

选择滇龙胆具芽茎段为外植体，用肥皂水洗净表面泥土，然后滴加3滴吐温-80，震摇10min，自来水冲淋1h，转移至超净工作台，用75%酒精消毒15s，无菌水涮洗2次，饱和漂白粉溶液消毒25min，无菌水涮洗2次，0.05%升汞溶液消毒9min，无菌水涮洗6次。

2、愈伤诱导：

将清洗好的外植体转移至超净工作台，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，平铺接种在MS+2,4-D 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L +6-BA 0.1mg/L的愈伤诱导培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000-3000lx的光暗交替环境下培养30天。

3、优质愈伤筛选：

诱导出的愈伤，选出具有芽的愈伤作为优质愈伤。

4、滇龙胆根酶解液配置：

选择成年滇龙胆新鲜根及根茎，用肥皂水洗净表面泥土，然后用清水漂洗干净后切碎，称取50g，加入1L纯化水，同时加入30g半纤维素酶和50g果胶酶，将混合液pH调至3.0，在摇床上以120r/min，温度为45±2℃下酶解2h，获得的悬浮液经离心分离的澄清液，然后将澄清液置于超净工作台内，进行过滤灭菌。

5、愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养：

将筛选出的优质愈伤，切成约1cm

本实施例中，MS培养基中蔗糖改为麦芽糖，麦芽糖含量为10-15g/L。

照《中国药典》2020版龙胆药材标准中的含量测定项下测定愈伤中龙胆苦苷含量。

实施例2：利用滇龙胆愈伤生产龙胆苦苷的方法，包括以下步骤：

1、外植体的清洁与消毒：

选择滇龙胆具芽茎段为外植体，用肥皂水洗净表面泥土，后滴加3滴吐温-80，震摇15min，自来水冲淋1h，转移至超净工作台，用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水涮洗3次，0.05%升汞溶液消毒11min，无菌水涮洗7次。

2、愈伤诱导：

将清洗好的外植体转移至超净工作台，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，平铺接种在MS+2,4-D 0.8mg/L+NAA 0.2mg/L +6-BA 0.2mg/L的愈伤诱导培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000-3000lx的光暗交替环境下培养35天。

3、优质愈伤筛选：

诱导出的愈伤，选出具有芽的愈伤作为优质愈伤。

4、滇龙胆根酶解液配置：

选择成年滇龙胆新鲜根及根茎，用肥皂水洗净表面泥土，然后用清水漂洗干净后切碎，称取50g，加入1L纯化水，同时加入30g半纤维素酶和50g果胶酶，将混合液pH调至3.0，在摇床上以120r/min，温度为45±2℃下酶解2h，获得的悬浮液经离心分离的澄清液，然后将澄清液置于超净工作台内，进行过滤灭菌。

5、愈伤增殖与龙胆苦苷积累培养：

将筛选出的优质愈伤，切成约1cm

本实施例中，MS培养基中蔗糖改为麦芽糖，麦芽糖含量为10-15g/L。

照《中国药典》2020版龙胆药材标准中的含量测定项下测定愈伤中龙胆苦苷含量。

对比例1：选择滇龙胆具芽茎段，照中国专利《一种滇龙胆航天育种组培育苗新方法》（专利申请号：CN202010034476）公开的技术内容进行丛生芽诱导，将诱导出的无菌苗。并照王海涛发表的（《麻花秦艽和大叶秦艽细胞培养研究》[D]，西宁：青海大学，2014）最佳愈伤诱导培养基MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L诱导愈伤。并照其麻花秦艽最佳细胞悬浮培养基MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+酵母膏100mg/L+蔗糖30g/L+果糖5g/L（添加琼脂进行固体培养），在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替环境下培养25天。培养结束照《中国药典》2020版龙胆药材标准中的含量测定项下测定愈伤中龙胆苦苷含量。

对比例2：选择滇龙胆具芽茎段，照专利《一种滇龙胆航天育种组培育苗新方法》（专利申请号：CN202010034476）公开的技术内容进行丛生芽诱导，将诱导出的无菌苗照王海涛发表的（《麻花秦艽和大叶秦艽细胞培养研究》[D]，西宁：青海大学，2014）最佳愈伤诱导培养基MS+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L诱导愈伤。照其麻花秦艽最佳细胞悬浮培养基B5+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+CH 100mg/L+硝酸银1.0mg/L+蔗糖35g/L+果糖5g/L（添加琼脂成固体培养基），在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000-3000lx的光暗交替环境下培养25天。培养结束照《中国药典》2020版龙胆药材标准中的含量测定项下测定愈伤中龙胆苦苷含量。

对比例3：选择滇龙胆幼嫩叶片，照齐香君发表的（《秦艽细胞悬浮培养研究》[J]，中草药，2010，41（3）：472~475）最佳愈伤诱导培养基进行愈伤诱导。照文献中的最佳细胞悬浮培养基（加琼脂成固体培养基）进行愈伤继代培养，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替环境下培养25天。培养结束照《中国药典》2020版龙胆药材标准中的含量测定项下测定愈伤中龙胆苦苷含量。

对比例4：选择滇龙胆未成熟种子，照马继雄发表的（《祁连龙胆愈伤组织和再生植株的生长及其两种药效成分分析》[J]，山东大学学报，2006，41（6）：157~160）最佳愈伤诱导培养基进行愈伤诱导。照文献中的最佳愈伤增殖培养基进行愈伤继代培养，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替环境下培养25天。培养结束照《中国药典》2020版龙胆药材标准中的含量测定项下测定愈伤中龙胆苦苷含量。

实施例1、实施例2、对比例1-4龙胆苦苷含量及愈伤生物量增长率进行测定，结果列于下表1中。

备注：愈伤生物增长率的测定方式为培养后的愈伤质量除以培养前的愈伤质量。

由上表可以看出，采用现有技术利用滇龙胆愈伤生产龙胆苦苷时，仅对比例1和对比例2龙胆苦苷积累量相对较为理想，但其存在愈伤生物量增长率较低，对于生产而言，愈伤生物量增长率愈低，生产效率就会愈低，从而导致成本上涨，而对比例3和对比例4愈伤生物量增长率相对较高，但愈伤中龙胆苦苷含量低，其并不能直接用于龙胆苦苷的生产。而本发明中的实施例1和实施例2，其龙胆苦苷含量和愈伤生物量增长率均高于现有技术。

部分试验记录如下：

1、初代诱导愈伤含量测定

本发明中，初代诱导愈伤时，部分会发出丛生芽，而部分不会发芽，全部为愈伤，后将其分成两个样品，经龙胆苦苷含量测定，发现具丛生芽愈伤含量较不具丛生芽愈伤含量高出近2倍。

随后将具丛生芽愈伤切成亦具芽的愈伤小块，进行增殖，而不具丛生芽的愈伤切成小块，进行增殖，两种愈伤重复增殖3次。测定并比较两种愈伤含量，发现具丛芽的愈伤仍然较不具丛芽的愈伤的龙胆苦苷含量高出近2倍。

2、能稳定生长丛芽的增殖培养基筛选

用诱导出的具丛芽的愈伤，接种到不同植物生长调节剂组合的增殖培养基中，具体设计如下表2。

增殖培养基筛选结果如下表3。

由表3可以看出，2,4-D的有无以及浓度是滇龙胆愈伤生长的关键，当2,4-D浓度为0.5-1.0mg/L时，增殖系数为最大，但当NAA存在且浓度愈大，愈伤增长反而降低。TDZ存在极其浓度为是否继续是丛生芽愈伤的关键，当TDZ浓度为1.0-2.0mg/L时，愈伤丛生芽率为最高，而ZT几乎不能影响愈伤生长。

3、诱导子对愈伤生长和龙胆苦苷积累的影响

（1）诱导子敏感性试验

以MS+2,4-D 0.5mg/L+TDZ 1.0mg/L为基础培养基，接种优质愈伤，添加不同种类及浓度的诱导子，试验设计内容如下表4，敏感性试验结果如下表5。

由表5可以看出，MeJA、多效唑、硝酸银以及滇龙胆根酶解液均能有效刺激滇龙胆愈伤积累龙胆苦苷，但MeJA不论多大浓度均会导致滇龙胆愈伤褐化，而高浓度的硝酸银会导致滇龙胆愈伤的大量死亡，仅低浓度不会对愈伤造成影响，多效唑随着浓度愈高，刺激龙胆苦苷积累愈加明显。

（2）多因素正交试验

以MS+2,4-D 0.5mg/L+TDZ 1.0mg/L为基础培养基，接种优质愈伤，用多效唑、硝酸银和滇龙胆根酶解液进行正交试验，试验设计内容如下表6，敏感性诱导子组合试验结果如表7。

由表7可以看出，Z9组合对滇龙胆愈伤中龙胆苦苷的积累效果为最佳，是不添加诱导子，即Z1的4.2倍，但诱导子对愈伤生物量的增长有明显影响，其中以硝酸银最为明显，而适宜浓度的硝酸银又能很大程度的抑制玻化的发生。

4、培养条件对愈伤增殖和龙胆苦苷积累的影响

在MS+2,4-D 0.5mg/L+TDZ 2.0mg/L+多效唑1.0mg/L+硝酸银 0.2mg/L+滇龙胆根酶解液10ml/L培养基中，进行昼夜温差胁迫试验，发现温差有明显刺激龙胆苦苷含量的积累，但低温时间过长，愈伤生长增长速率大大降低，而适宜的温差对愈伤的增长速率影响在可接受范围内。其最适宜温差条件为25±2℃下培养14-16h，后转移至4±2℃下培养8-10h。