一种基于粪便菌群检测在评估素食孕妇营养代谢水平中的应用

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于粪便菌群检测在评估素食孕妇营养代谢水平中的应用，本发明首次筛选出了与素食孕妇营养代谢水平密切相关的肠道菌群，并基于筛选出的肠道菌群的丰度以评估素食孕妇营养代谢水平，具有较高的准确性，有助于对孕妇营养代谢水平进行精细化评估，以获得更为准确的孕妇营养状态信息，进而给出合理性的指导意见，对于孕妇孕期的营养监测、指导具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于粪便菌群检测在评估素食孕妇营养代谢水平中的应用。

背景技术

在怀孕期间，母体肠道菌群与母体和婴儿的代谢状态有关。然而目前尚无关于怀孕期间针对素食饮食母亲营养监测技术。现有医院诊疗技术多关注孕妇贫血、维生素A、D缺乏情况等简单指标，对个体状况难以有进一步的精细化评估。

中国孕妇膳食指南(2016)推荐意见指出：一般人群膳食指南基本原则包括食物多样、谷类为主，吃动平衡，健康体质量,多吃蔬果、奶类、大豆,适量吃鱼、禽、蛋、瘦肉，少盐少油，控糖限酒。

孕妇的合理膳食原则应在以上膳食指南原则基础上补充以下五个方面内容：

1.补充叶酸，常吃含铁丰富的食物，选用碘盐；整个孕期应口服叶酸补充剂400μg/d，每日摄入绿叶蔬菜；孕中晚期应每日增加20～50g红肉，每周吃1～2次动物内脏或动物血；孕妇除每日食用碘盐外，还应常吃海产食物，如海带、紫菜等。

2.孕吐严重者，可少量多餐，保证摄入含必要量碳水化合物的食物；孕早期无明显早孕反应者应继续，保持孕前平衡膳食；孕吐较明显或食欲不佳的孕妇，不必过分强调平衡膳食；孕期每天必需摄取至少130g碳水化合物，首选易消化的粮谷类食物；进食少或孕吐严重者需寻求医师帮助。

3.孕中晚期适量增加奶、鱼、禽、蛋、瘦肉的摄入；孕中晚期奶类及其制品总摄入量达到300～500g/d；孕中晚期每天增加鱼、禽、蛋、瘦肉共计150～250g；每周最好食用2-3次深海鱼类。

4.适量身体活动，维持孕期适宜体重；孕期适宜增重有助于获得良好妊娠结局,应重视体质量监测和管理；孕早期体质量变化不大，可每月测量1次，孕中晚期应每周测量1次体质量；健康孕妇每天应进行不少于30分钟的中等强度身体活动。

5.禁烟酒,愉快孕育新生命,积极准备母乳喂养。

然而，由于不同家庭饮食习惯或个体差异可能难以满足指南所有内容，尤其对于长期素食的孕妇，其饮食结构是否合理、能否满足胎儿及母亲营养需求难以用指南进行评估。饮食差异会介由母体肠道菌群造成个体深层代谢水平差异，因此对孕期母体的营养状态评估至关重要。

综合的、动态的手段来进行营养的评价，包括膳食调查，即孕期的饮食习惯；体格检查，包括体重、皮脂的厚度、腰围、臀围等进行测量；实验室检查，包括血生化的水平、血常规的水平，血液的维生素和微量元素，基于上述指标要进行综合和动态的判断孕期营养状态。然而这些都是对一般人群的宏观表象进行的调研，忽略了素食孕妇因营养结构不同的差异而导致的个体的营养差异。

因此，如何对孕妇营养代谢水平进行精细化评估，以获得更为准确的孕妇营养状态具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中缺乏专门针对素食孕妇营养状态评估的问题，本案旨在提供一种基于粪便菌群检测在评估素食孕妇营养代谢水平中的应用，通过对素食孕妇的粪便菌群的相对丰度进行检测，进而实现对素食孕妇营养代谢状态进行个体化、精细化评估，能够更为准确反映素食孕妇的营养代谢水平。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种基于粪便菌群检测在评估素食孕妇营养代谢水平中的应用，粪便菌群检测包括检测与素食孕妇营养状态相关的粪便菌群的相对丰度；所述粪便菌群包括：Collinsella、Holdemania、Unclassified S247、Eubacterium、Roseburia、Unclassified Lachnospiraceae、Clostridium和Acidaminococcus。

本发明首次筛选出了与素食孕妇营养代谢水平高度相关的8种粪便菌属，通过素食孕妇粪便中的上述菌属的丰度进行检测，进而评估素食孕妇的营养代谢水平，对于素食孕妇的饮食指导具有重要意义。

第二方面，本发明提供一种基于粪便菌群丰度评估素食饮食孕妇营养代谢水平的模型，所述模型由与素食孕妇营养状态相关的粪便菌群的相对丰度构建得到，所述粪便菌群包括：Collinsella、Holdemania、Unclassified S247、Eubacterium、Roseburia、Unclassified Lachnospiraceae、Clostridium和Acidaminococcus。

优选地，所述模型得分公式如下：

模型得分＝3.3082－17.0407×Collinsella相对丰度值－47.7252×Holdemania相对丰度值－64042.2145×Unclassified S247相对丰度值－294.1574×Eubacterium相对丰度值－35.7225×Roseburia相对丰度值－4042.2451×UnclassifiedLachnospiraceae相对丰度值-82.1704×Clostridium相对丰度值－94.5717×Acidaminococcus相对丰度值。

优选地，当模型得分高于0.759或低于0.532，则提示素食孕妇营养水平有待调节。

由本发明提供的基于粪便菌群丰度评估素食饮食孕妇营养代谢水平的模型，对素食孕妇的营养代谢水平的评估准确度不低于77％，对于素食孕妇的饮食指导具有重要意义。

第三方面，本发明提供上述基于粪便菌群丰度评估素食饮食孕妇营养代谢水平的模型的构建方法，包括如下步骤：

采集素食孕妇和杂食孕妇的粪便样本，并对其营养代谢水平进行综合评分；

构建孕妇粪便菌群的基因文库，并经测序获取粪便菌群OTU聚类和物种注释，得到粪便菌群的相对丰度；

通过对比杂食孕妇与素食孕妇粪便菌群的相对丰度以及营养代谢水平的综合评分，筛选出与素食孕妇营养代谢水平相关联的粪便菌群；

基于筛选出与素食孕妇营养代谢水平相关联的粪便菌群，构建用于评估素食饮食孕妇营养代谢水平的模型。

优选地，通过对比杂食孕妇与素食孕妇粪便菌群丰度以及营养代谢水平综合评分，筛选出与素食孕妇营养代谢水平相关联的粪便菌群的步骤如下：

通过随机森林算法分别将杂食孕妇和素食孕妇两组人群的粪便菌群的相对丰度与相应的营养代谢水平综合评分进行回归，并根据各个菌属对模型预测准确性的相对贡献进行重要性排名，利用十折交叉验证法评估模型中菌属数量与模型误差的关系，并按重要性排名对菌属进行选择，从而筛选出与素食孕妇营养代谢水平相关联的粪便菌群。

优选地，筛选出的与素食孕妇营养代谢水平高度关联的肠道菌群的菌属包括Collinsella、Holdemania、Unclassified S247、Eubacterium、Roseburia、UnclassifiedLachnospiraceae、Clostridium和Acidaminococcus。

第四方面，本发明提供上述基于肠道菌群丰度评估素食饮食孕妇营养代谢水平的模型在制备素食孕妇营养状态评估试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明首次筛选出了与素食孕妇营养代谢水平高度相关的粪便菌群，以菌群丰度特征为基础，通过对素食饮食孕妇进行特定的肠道微生物群组合丰度检测，以评估素食孕妇的营养状态，具有较高的准确性，有助于对孕妇整体营养状态进行精细化评估，以获得更为准确的孕妇营养状态，进而给出合理性的指导意见，对于孕妇孕期的营养监测、指导具有重要意义。

附图说明

图1为本案招募对象的流程及排除标准；

图2为素食饮食孕妇与杂食饮食孕妇肠道菌群差异图；

图3为Lefse分析筛选差异菌属；

图4为差异菌属统计信息；

图5为基于肠道菌群丰度评估素食饮食孕妇营养代谢状态的模型的ROC曲线；

图6为基于肠道菌群丰度评估素食饮食孕妇营养代谢状态的模型对测试集分析的ROC曲线；

图7为素食孕妇和杂食孕妇营养代谢与肠道菌群相关性图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明基于粪便菌群检测在评估素食孕期妇女营养中的应用，包括如下实验步骤：

(1)样本及数据采集

本发明实验样本及数据采集的流程图如图1所示，招募25-35周岁、孕期3-4个月的孕妇，进行进食频率问卷并提供其粪便样本。该研究获得广州医科大学附属第五医院的批准，所有参与者均提供了知情的书面同意。本研究招募了40名孕妇作为研究的训练集，其中12名根据问卷调查被确定为喜好素食者，28名为杂食者。对孕妇在基线(以妊娠12周为基线)时的体重指数(BMI)、入组检查时的总能量摄入以及妊娠期糖尿病的未来发展情况进行匹配。每位女性都完成了维多利亚癌症委员会食物频率调查问卷(DQES V2.0版)，指导只包括从怀孕开始的饮食信息。研究人员对孕妇提供的膳食信息进行了宏量营养素和脂肪酸含量分析。孕妇还提供了自己的粪便样本，在粪便DNA分离之前，将其冷藏至-80℃保存。此外，收集禁食血样，收集所有参与者的人体测量数据以及医疗和产科病史。孕妇营养评分依据生长曲线标准，健康孕妇通常符合生长曲线标准，然而素食孕妇不符合该生长曲线标准，但并不一定意味着素食孕妇营养不良，因此，本发明从粪便菌群的角度分析并将其纳入素食孕妇的营养代谢评价指标。

(2)数据分析

建立孕妇粪便菌群基因文库，通过16S rRNA测序，获得肠道菌群OTU聚类和物种注释，得到肠道菌群样本中的物种多样性和物种丰富度，比较杂食孕妇和长期素食孕妇的菌群差异，通过Lefse分析筛选差异菌属，结果如图1和图2所示，展示了不同组中丰度有显著差异的物种，即具有统计学差异的生物标志物。柱状图的长度代表显著差异物种的影响大小。将素食者与其他杂食者进行比较，通过Lefse分析筛选差异菌属。

(3)实验结果

基于上述数据分析结果，通过随机森林(运用R语言randomForest 4.614package)分别将12名素食者和28名杂食者样本作为训练集，进行孕妇营养代谢水平分析，如图5所示。两组人群的菌属的相对丰度与相应的营养代谢水平的综合得分进行回归分析，并根据各个菌属对模型预测准确性的相对贡献按重要性进行排名，并利用十折交叉验证法评估模型中菌属数量与模型误差的关系，并按重要性排名对菌属进行选择，最终保留的8个菌属用于构建本发明随机森林回归模型，共确定了8个与食物喜好及营养状态高度相关的菌属(如图2、图3和图4所示)：Collinsella、Holdemania、Unclassified S247、Eubacterium、Roseburia、Unclassified Lachnospiraceae、Clostridium和Acidaminococcus。

(4)随机森林回归模型的构建

基于上述确定的8个最重要的与素食孕妇营养代谢水平密切关联的菌属，通过对这8个菌属的菌群相对丰度值与相应的营养水平的综合得分进行回归分析，构建素食孕妇营养代谢水平的评估模型，拟合模型AUC达到0.924。评估模型公式计算得分＝3.3082－17.0407×Collinsella相对丰度值－47.7252×Holdemania相对丰度值－64042.2145×Unclassified S247相对丰度值－294.1574×Eubacterium相对丰度值－35.7225×Roseburia相对丰度值－4042.2451×Unclassified Lachnospiraceae相对丰度值-82.1704×Clostridium相对丰度值－94.5717×Acidaminococcus相对丰度值；公式得分超过0.759或者低于0.532，则提示患者营养水平需要尽心额外关注与调节，具体调节见图7及表1解释说明。

(5)随机森林回归模型的验证

依照训练集收集规范，我们独立收集了杂食和素食的孕妇粪各20例粪便样本作为测试集，测试上述构建的随机森林回归模型的性能，并参照上述判定标准，对素食孕妇营养评估的ROC曲线如图6所示，本发明随机森林回归模型对素食孕妇营养水平评估的准确性可达0.77(曲线下面积AUC)。

(6)随机森林回归模型的应用

通过训练集和验证集的16S rRNA测序，获得肠道菌群聚类和物种注释，得到肠道菌群样本中的物种多样性和物种丰富度，进行网络分析，如图7所示，图7为生物合成功能预测分析结果，结果表明与脂肪酸、脂质、叶酸等生物合成途径相关的微生物群在素食者中更为明显。

上述结果显示与普通杂食相比，长期素食的孕妇与脂肪酸、脂质、叶酸等生物合成途径相关的微生物群更为显著。我们进一步根据分析结果总结如表1所示，表1展示了特定菌属与相关营养指标的相关性，借助模型预测素食孕妇的饮食是否营养均衡，再由临床医生通过对素食孕妇特定菌属相对丰度值判断是否需要调整饮食结构，譬如对验证集其中一位素食孕妇进行评估，发现其模型计算值低于0.532，判定为营养结构需要进行调整，根据菌群丰度的进一步分析，该孕妇Unclassified Lachnospiraceae这一菌属的丰度值与其他素食者相比偏低，对照表1，临床医生需要对该孕妇纤维类膳食结构进行相应调整。

综上，本发明通过肠道菌群的代谢通路分析对素食孕妇对不同饮食结构的代谢进行了细致化评估，表1可以为临床营养指导不同饮食习惯的孕妇进行相关营养的补充。通过对所得菌属进行生物合成功能预测分析，为素食孕期妇女的营养补充提供指导意见。

表1特定菌属与临床特征和膳食摄入量的相关性

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。