蛋白激酶抑制剂用于制备抗汉滩病毒药物的应用

摘要

本发明公开了蛋白激酶抑制剂用于制备抗汉坦病毒药物的应用，所述蛋白激酶抑制剂的结构式如式(Ⅰ)所示。本发明研究发现加入式(Ⅰ)所示蛋白激酶抑制剂后细胞内HTNV病毒载量明显减少；核酸表达水平明显降低，式(Ⅰ)所示蛋白激酶抑制剂可以有效抑制汉滩病毒的复制及增殖。

说明书

技术领域

本发明属于抗病毒药物研发领域，具体涉及激酶抑制剂ZM 39923HCl在用于制备抗汉滩病毒药物中的应用。

背景技术

汉坦病毒感染类疾病可主要引起急性肾功能衰竭(肾炎)、肾综合征出血热或急性非心源性肺水肿综合征。其中肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renalsyndrome,HFRS)是一种全球性传播的自然疫源性疾病，主要通过黑线姬鼠等啮齿动物传播，临床表现主要包含急性肾功能损害、发热、出血和休克等。汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)是引起重症HFRS的主要病原体，属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)，汉坦病毒科(Hantaviridae)，正汉坦病毒属(Orthohantavirus)，是一种具有包膜的单负链RNA病毒(-ssRNA)，平均直径为120nm的类球形病毒颗粒，其基因组包含有L(large)，编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)；M(medium)，编码包膜糖蛋白前体(GPC)；S(small)，编码病毒核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)。目前还没有FDA批准的特异性治疗HFRS药物或疫苗，现目前临床治疗HFRS的主要方法是对症支持治疗。因此，研究开发具有抗汉滩病毒活性且安全性较好的药物具有重要的临床意义。

发明内容

基于发明人研究发现，本发明一方面提供了蛋白激酶抑制剂用于制备抗汉滩病毒药物的应用，所述蛋白激酶抑制剂的结构式如式(Ⅰ)所示，

本发明还提供了蛋白激酶抑制剂用于制备治疗汉坦病毒感染类疾病药物的应用，所述蛋白激酶抑制剂结构式如式(Ⅰ)所示。

本发明证实了激酶抑制剂ZM 39923 HCl可有效抑制汉滩病毒的复制，降低感染细胞中的病毒载量，抑制了病毒的增殖；此外，化合物在发挥抗病毒作用的浓度下对细胞活力影响较小。

附图说明

图1为本发明实施例2中加入不同浓度(1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)的ZM39923HCl的HTNV感染细胞中结构蛋白NP的Western blot检测结果，图中NC:细胞组；PC：细胞+汉滩病毒组；

图2为本发明实施例2中加入不同浓度的ZM 39923 HCl的HTNV感染细胞NP蛋白免疫荧光检测结果；

图3为本发明实施例2中加入不同浓度的ZM 39923 HCl的HTNV感染细胞病毒S基因表达水平检测结果；

图4为本发明实施例3中加入不同浓度的ZM 39923 HCl对A549细胞活力水平检测结果。

具体实施方式

除非有特殊说明，本文中的术语或方法根据相关领域普通技术人员的认识理解或采用已有相关方法实现。

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例中所用实验材料、试剂均为市售产品。

实施例1：抑制HTNV的激酶抑制剂筛选

发明人试图研究蛋白激酶抑制剂是否对汉滩病毒具有抑制作用，但基于蛋白激酶抑制剂小分子化合物种类多，化学结构差异较大，即使化学结构比较相似的蛋白激酶抑制剂，由于取代基团不同等原因，对激酶的选择性和抑制活性也显著不同，并不能从简单的构效关系推测其抗病毒的作用以及对具体病毒的抑制作用。经发明人多次研究，意外得到HTNV抑制率效果异常突出的激酶抑制剂：ZM 39923 HCl(表1中的化合物6)。部分代表性筛选方案如下：

将人非小细胞肺癌细胞A549细胞(购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司)消化后接种在96孔板中，每孔1×104个细胞，在5％CO2、37℃培养箱中培养过夜，待细胞密度达到60％时进行HTNV病毒(国际标准株76-118，由中国疾病预防控制中心惠赠)感染与代表性的9个蛋白激酶抑制剂小分子化合物处理，具体化合物见表1。

各化合物分别以工作浓度为10μM加入到病毒稀释液中，病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1，两者同时作用于细胞，处理4h后去除上清，加入含有2％FBS的DMEM培养液继续培养，每个化合物设置三个复孔，在感染后96小时(96hourspost-infection,96hpi)时进行免疫荧光实验。

在HTNV感染A549细胞的免疫荧光实验中，将NP蛋白表达量作为筛选具有抗HTNV活性化合物的指标，NP蛋白表达与化合物的病毒抑制效果呈现负相关，即化合物能够显著抑制HTNV复制时NP蛋白表达较少，因此，可以通过NP蛋白的表达来评价化合物抗HTNV效果，结果如表1所示。

表1激酶抑制剂及其抗HTNV活性的检测结果

实施例2：ZM 39923 HCl细胞水平抑制HTNV复制的鉴定

(一)Western blot检测

将A549细胞消化后传代至T25细胞培养瓶，待细胞密度达到70％时按MOI＝1感染HTNV，同时按不同化合物浓度加入细胞培养上清，混合均匀后置37℃条件下CO2细胞培养箱中培养，2h后换液为含有对应浓度ZM 39923 HCl溶于2％FBS的DMEM培养液中，继续培养4d后收集细胞；

将获得的细胞样品加入上样缓冲液Western blot sample buffer，煮沸7min，待冷却后以12％SDS-PAGE进行电泳，浓缩胶部分以80V恒压电泳进行，时间约为30min；随后样品进入分离胶，以120V恒压电泳进行，时间约为60min，当样品前端抵达玻璃板下沿时断开电泳，电泳完成；随后以100V恒压80min电转至PVDF膜上，转膜完毕后，取出PVDF膜，尽快放于3％BSA(使用TBST为溶剂配置)中，使用摇床室温封闭2-3h；而后，加入HTNV-NP特异性单克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST缓冲液将多余抗体洗去，再加入红外标记的抗小鼠二抗，室温避光条件下孵育60min，随后使用TBST洗涤三次，每次10min，使用Odyssey红外扫描仪扫描并分析结果。

结果如图1所示，与阳性对照(PC)结果相比较，加入ZM 39923 HCl后细胞内病毒NP蛋白表达明显减少。

(二)免疫荧光检测

1)固定：在生物安全柜内，取去除上清培养基的96孔板，每孔轻柔加入200μL PBS洗一遍，随后加入4℃预冷的4％(wt/vol)的多聚甲醛(PFA)100μL，室温固定20min；

2)打孔：配置0.5％Triton X-100，溶剂使用PBS，取出固定完毕的96孔板，去除上清液体，使用200μL PBS漂洗3次，加入100μL 0.5％Triton X-100，室温打孔20min；

3)封闭：配置封闭液(3％BSA)，称量3g BSA粉末加入到100mL PBS中，混合均匀备用，取出打孔完毕的96孔板，去除上清液体，使用200μL PBS洗涤孔底2次，尽可能去除打孔液，随后加入100μL封闭液，置于37℃恒温箱中处理1h；

4)一抗孵育：取出封闭完毕的96孔板，去除上清液体，加入一抗(鼠抗HTNV NP mAb1A8，1:100稀释)40μL，4℃过夜；

5)二抗孵育：取出一抗孵育过夜的96孔板，回收一抗，使用200μL PBS漂洗2次，加入二抗(Cy3标记的山羊抗小鼠IgG，1:400稀释)50μL，37℃恒温箱中处理1h；

6)染核：取出二抗孵育的96孔板，去除上清液体，使用200μL PBS漂洗3次，尽可能去除背景，加入DAPI(1:10000稀释)100μL染核，室温10min，使用PBS漂洗1次，加入70％甘油100μL，置于荧光显微镜下观察红色荧光的分布和强度。

结果如图2所示，加入ZM 39923 HCl后，每孔内的红色荧光强度明显降低，表明汉滩病毒复制得到显著抑制。

(三)qRT-PCR检测

1)提取细胞总RNA：取出待提取细胞总RNA的6孔板，去除细胞培养基上清液体，按照Axygen总RNA制备试剂盒的说明书流程提取细胞total RNA，最后加入DEPC水，离心得到细胞总RNA样品，随后，将样品点到Take3微量检测板上，使用多功能酶标仪测定浓度；

2)cDNA合成：根据多功能酶标仪测定浓度结果，计算反转录2000ng所需RNA体积，根据说明书配置反转录反应液，反应完成即得到所需合成cDNA；

3)qPCR反应：在冰上操作进行反应液体系的配制：qPCR SYBR Green预混液10μL，Forward和Reverse引物各1μL，模板DNA 1μL，DEPC水7μL。

结果如图3所示，与HTNV感染的为阳性对照组相比较，经由ZM 39923 HCl处理的感染细胞内HTNV的核酸表达水平明显较低。

实施例3：ZM 39923 HCl细胞毒性检测

1)96孔培养板接种A549细胞(104个细胞/孔)，100μL培养基中培养，以8×11进行布板，细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；

2)按实验设计方案将不同浓度的ZM 39923HCl(100μM、50μM、25μM、10μM、5μM、2.5μM和1μM)溶解于含血清DMEM培养基中，取出细胞贴壁均匀的96孔培养板，去除上清换为含化合物稀释好的每孔100μL培养基；第12列未种细胞，每孔加入100μL培养基作为空白对照组；第一列接种细胞，每孔加入100μL培养基作为细胞对照组；

3)将96孔细胞培养板在细胞孵箱中处理48h，使用电动移液器吸取CCK-8溶液调整量程按照每孔10μL加入(注意在加液过程中轻柔操作，避免引入泡沫，否则会影响仪器读值结果)；

4)将96孔培养板在培养箱中孵育2h，随后取出轻轻晃动，以确保孔内颜色分布均匀，在450nm位置处通过酶标仪测定吸光度。

5)按照公式计算细胞活力：

细胞存活率(％)＝[(Cs-Cb)/(Cc-Cb)]×100

Cs＝实验组吸光度(含有A549细胞，DMEM，CCK-8和ZM 39923 HCl)；

Cb＝空白组吸光度(含有DMEM和CCK-8)；

Cc＝对照组吸光度(含有A549细胞，DMEM和CCK-8)；

结果如图4所示，得到梯度浓度ZM 39923 HCl对细胞活力的影响，经过计算得到其半数细胞毒性浓度(CC50)为99.88±1.19μM，说明该化合物具有较好的抗汉滩病毒活性的同时，对宿主细胞的活力影响较小。

本发明通过多种实验从汉滩病毒的蛋白和核酸的表达水平证实了ZM 39923 HCl具有显著抑制汉滩病毒复制的作用，降低感染细胞中的病毒载量；此外，ZM 39923 HCl在发挥抗病毒作用的浓度下对细胞活力影响较小。因此，ZM 39923 HCl也可用于制备治疗汉滩病毒感染类疾病药物。