基于聚焦阵列蛋白芯片筛选用于贲门腺癌诊断的生物标志物及其应用

摘要

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了用于贲门腺癌诊断的生物标志物及检测试剂盒。本发明提供的用于贲门腺癌诊断的生物标志物为TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体中的至少一种，该标志物在贲门腺癌患者血清中的表达水平高于正常人，差异具有统计学意义。本发明还提供了一种用于贲门腺癌诊断的试剂盒，该试剂盒含有用于检测上述生物标志物的试剂，该试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。本发明通过检测人血清中上述生物标志物的表达水平，可以有效区分贲门腺癌患者和健康人，可用于贲门腺癌的辅助诊断。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了基于聚焦阵列蛋白芯片筛选用于贲门腺癌诊断的生物标志物及其应用。

背景技术

贲门腺癌(Gastric cardiac adenocarcinoma，GCA)，西方国家多称食管胃交界部腺癌，是指肿瘤中心位于食管胃交界部上方1cm至下方2cm范围内的腺癌。贲门腺癌起病隐匿，早期症状不明显，就诊的患者多为中晚期，所以贲门腺癌患者的预后极差。贲门腺癌的预后与患者确诊时疾病的进程密切相关，早诊早治对提高贲门腺癌患者的生存至关重要。因此，找到新的贲门腺癌诊断预测相关的血清标志物，指导临床医生进行早期诊断、早期治疗，对提高贲门腺癌患者的生存率、降低患者死亡率、改善患者生存质量至关重要。但目前发现的有关贲门腺癌的血清指标物极少，被临床接受应用的则更少。

在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞内表达异常的蛋白可刺激机体免疫系统产生抗体，这些抗体称之为肿瘤自身抗体。因人体免疫系统有生物信号放大效应，肿瘤患者只要存在微量的肿瘤抗原，通过持续的诱导，就可以在血清中检测到相应的抗体，且抗体可以在外周血中长期、稳定的存在。有研究证明自身抗体的产生可能先于疾病症状，持续数月或数年。为了检测和/或监测癌症的进展，肿瘤研究学者已经证明了自身抗体检测在早期癌症检测中的潜在用途，特别是蛋白质和抗体微阵列的最新进展极大地促进了癌症患者血清中新的抗体生物标记物的发现。

目前关于能够用于贲门腺癌诊断的自身抗体的研究相对较少，为了提高贲门腺癌早期诊断的效率，提高贲门腺癌患者的生存率，亟需筛选更多的能够用于贲门腺癌诊断的血清学自身抗体标志物。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的基于聚焦阵列蛋白芯片筛选用于贲门腺癌诊断的生物标志物及其应用。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种用于贲门腺癌诊断的生物标志物。所述生物标志物为TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体中的至少一种。

TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体在贲门腺癌患者血清中的表达水平均高于正常人，且差异具有统计学意义。

根据上述的生物标志物，优选地，TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体均为受试者血清、血浆、组织间隙液或尿液中存在的自身抗体。

根据上述的生物标志物，优选地，TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体为受试者接受肿瘤治疗之前血清、血浆、组织间隙液或尿液中的自身抗体。更加优选地，所述肿瘤治疗为化疗、放疗或肿瘤手术切除。

根据上述的生物标志物，优选地，所述受试者为哺乳动物，更加优选地，所述受试者为灵长类哺乳动物；最优选地，所述受试者为人。

本发明第二方面提供了用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂在制备用于贲门腺癌诊断的产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中所述生物标志物的试剂。

根据上述的应用，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的应用，优选地，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原或抗体。更加优选地，所述试剂为检测所述生物标志物的抗原，所述抗原为TP53蛋白、BLOC1S4蛋白、MAGEA1蛋白、CTAG1A蛋白、IGHM蛋白中的至少一种。

根据上述的应用，优选地，所述生物标志物为TP53自身抗体和BLOC1S4自身抗体的组合时，所述产品进行贲门腺癌诊断预测贲门腺癌的概率计算公式为：

P＝e

其中，P表示概率，TP53表示TP53自身抗体的表达量，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体的表达量。

根据上述的应用，优选地，所述生物标志物为TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体的组合时，所述产品进行贲门腺癌诊断预测贲门腺癌的概率计算公式为：

P＝e

其中，P表示概率，TP53表示TP53自身抗体的表达量，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体的表达量，MAGEA1表示MAGEA1自身抗体的表达量。

根据上述的应用，优选地，所述生物标志物为TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体的组合时，所述产品进行贲门腺癌诊断预测贲门腺癌的概率计算公式为：

P＝e

x＝0.619-0.790×CTAG1A-0.753×TP53-0.528×MAGEA1-0.201×BLOC1S4，

其中，P表示概率，TP53表示TP53自身抗体的表达量，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体的表达量，MAGEA1表示MAGEA1自身抗体的表达量，CTAG1A表示CTAG1A自身抗体的表达水平。

根据上述的应用，优选地，所述生物标志物为TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体的组合时，所述产品进行贲门腺癌诊断预测贲门腺癌的概率计算公式为：

P＝e

x＝0.717-0.823×CTAG1A-0.756×TP53-0.827×IGHM-0.172×BLOC1S4-0.512×MAGEA1；

其中，P表示概率，TP53表示TP53自身抗体的表达量，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体的表达量，MAGEA1表示MAGEA1自身抗体的表达量，CTAG1A表示CTAG1A自身抗体的表达水平，IGHM表示IGHM自身抗体的表达水平。

根据上述的应用，优选地，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。

本发明第三方面提供了一种用于贲门腺癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测上述第一方面所述生物标志物的试剂。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒通过酶联免疫吸附、蛋白芯片、免疫印迹或微流控免疫检测样本中的所述生物标志物。

根据上述的试剂盒，优选地，所述生物标志物为TP53自身抗体和BLOC1S4自身抗体的组合时，所述试剂盒进行贲门腺癌诊断预测贲门腺癌的概率计算公式为：

P＝e

其中，P表示概率，TP53表示TP53自身抗体的表达量，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体的表达量。

根据上述的试剂盒，优选地，所述生物标志物为TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体的组合时，所述试剂盒进行贲门腺癌诊断预测贲门腺癌的概率计算公式为：

P＝e

其中，P表示概率，TP53表示TP53自身抗体的表达量，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体的表达量，MAGEA1表示MAGEA1自身抗体的表达量。

根据上述的试剂盒，优选地，所述生物标志物为TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体的组合时，所述试剂盒进行贲门腺癌诊断预测贲门腺癌的概率计算公式为：

P＝e

其中，P表示概率，TP53表示TP53自身抗体的表达量，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体的表达量，MAGEA1表示MAGEA1自身抗体的表达量，CTAG1A表示CTAG1A自身抗体的表达水平。

根据上述的试剂盒，优选地，所述生物标志物为TP53自身抗体、BLOC1 S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体的组合时，所述试剂盒进行贲门腺癌诊断预测贲门腺癌的概率计算公式为：

P＝e

x＝0.717-0.823×CTAG1A-0.756×TP53-0.827×IGHM-0.172×BLOC1S4-0.512×MAGEA1；

其中，P表示概率，TP53表示TP53自身抗体的表达量，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体的表达量，MAGEA1表示MAGEA1自身抗体的表达量，CTAG1A表示CTAG1A自身抗体的表达水平，IGHM表示IGHM自身抗体的表达水平。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。更加优选地，所述ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原；所述抗原为TP53蛋白、BLOC1S4蛋白、MAGEA1蛋白、CTAG1A蛋白、IGHM蛋白中的至少一种。

根据上述的试剂盒，优选地，所述样本为血清、血浆、组织间隙液或尿液。

根据上述的试剂盒，优选地，所述ELISA检测试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。

本发明中肿瘤抗原TP53蛋白、BLOC1S4蛋白、MAGEA1蛋白、CTAG1A蛋白、IGHM蛋白的基本信息为：

TP53编码包含转录激活、DNA结合和寡聚域的肿瘤抑制蛋白。编码蛋白响应不同的细胞应激，调控靶基因的表达，从而诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢改变。TP53的突变与多种人类癌症有关。BLOC1S4是一种无内含子的基因，其编码的蛋白质可能在与黑素体、血小板致密颗粒和溶酶体相关的细胞器生物发生中发挥作用。该编码蛋白可能在细胞内的囊泡运输中发挥作用。MAGEA1是MAGEA基因家族的成员。这个家族的成员编码蛋白质，彼此之间有50-80％的序列同源性。MAGEA基因的启动子和第一外显子表现出相当大的可变性，这表明该基因家族的存在使得相同的功能在不同的转录控制下得以表达。

MAGEA基因聚集在染色体Xq28，它们通常与一些遗传性疾病有关。CTAG1A是一个蛋白编码基因，该基因编码的蛋白质是一种在各种癌症中发现的肿瘤细胞抗原，这使其成为癌症疫苗的良好候选。IGHM即Immunoglobulin Heavy Constant Mu(IGHM),是一种蛋白质编码基因,IGHM基因编码mu重链的C区，定义了IgM的同型。Naive B细胞表达跨膜形式的IgM和IgD。在抗体应答过程中，激活的B细胞可以通过被称为同型切换的体细胞重组过程转换到下游重链C区单个基因的表达。此外，通过对重链C区序列的选择性RNA加工，可以产生作为抗体的分泌型Ig。虽然所有Ig同型的膜形态都是单体，但分泌的IgM在血浆中会形成五聚体，偶尔也会形成六聚体。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次发现TP53、BLOC1S4、MAGEA1、CTAG1A、IGHM自身抗体在贲门腺癌患者血清中的表达水平均显著高于正常人，且差异具有统计学意义，通过检测人血清中TP53、BLOC1S4、MAGEA1、CTAG1A、IGHM自身抗体的表达水平，可以有效检测贲门腺癌；经验证，本发明单独采用TP53、BLOC1S4、MAGEA1、CTAG1A、IGHM自身抗体中任意一个标志物进行贲门腺癌诊断时，其ROC曲线的AUC值均在0.55以上；多个标志物联合使用时，ROC曲线的AUC值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于贲门腺癌诊断的标志物可用于贲门腺癌的辅助诊断。

(2)本发明将TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体这五种标志物作为一个组合用于贲门腺癌诊断检测时，其ROC曲线的AUC为0.718(95％CI:0.683-0.753)，检测灵敏度高达54.0％(即贲门腺癌患者中应用这五种标志物进行诊断时被正确的诊断为贲门腺癌的比率为54.0％)，特异度达到了81.1％(即健康对照中应用这五种标志物进行诊断时确定为健康者的比率为81.1％)，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了贲门腺癌的检出率，有利于无症状贲门腺癌高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了贲门腺癌患者的死亡率，为贲门腺癌患者和家庭带来极大的福祉。

(3)本发明的试剂盒通过间接ELISA的方法检测人血清中TP53、BLOC1S4、MAGEA1、CTAG1A、IGHM自身抗体的表达水平，可以较准确地将贲门腺癌患者和健康对照诊断区分开来，为临床医生对贲门腺癌的诊断提供了新的参考依据。

(4)本发明的试剂盒的检测样本为血清，可避免侵入性诊断，通过微创方式取血清检测即可获得贲门腺癌的患病风险，需血量少，被检测人员痛苦小、依从性高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。

附图说明

图1为五种自身抗体在贲门腺癌组和正常对照组中的表达水平结果图；其中，NC表示正常对照组，GCA表示贲门腺癌组；

图2为五种自身抗体单项指标诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线图；

图3为不同自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线图；

图4为验证组中五种自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线图。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：采用人类聚焦陈列蛋白质组芯片筛选用于贲门腺癌诊断的标志物

1、实验样本：

收集来自省部共建食管癌防治国家重点实验室标本库的426例贲门腺癌患者血清(贲门腺癌组)和360例正常人血清(正常对照组)；其中，426例贲门腺癌患者血清来源于经病理确诊且未经任何治疗的贲门腺癌患者；360例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无自身免疫性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，426例贲门腺癌患者和360例健康受试者在性别之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

血清采集：采集研究对象在空腹状态时的外周血液5ml放于无抗凝剂的采血管中，室温静置1h后置于离心机中，设定为4℃，3000rpm离心10min。然后将采血管上层的血清吸出并分装至1.5ml的EP管中，在EP管的顶部和侧面均标记样本编号，放于-80℃冰箱进行冷冻保存，记录采血日期以及储存位置。在使用之前，取出血清放于4℃冰箱解冻并分装，避免反复冻融血清。

2、人类聚焦陈列蛋白质组芯片检测：

Focused array人类蛋白质定制芯片共包含340个人源重组蛋白质，是根据HuProtTM人类全蛋白质组芯片血清筛选结果所挑选出的贲门癌特异性相关标志物。该芯片适用于贲门腺癌标志物筛选实验，用以进一步验证所发现的潜在的可用于临床早期诊断或其它表征的标志物。每例样本分别独立地与芯片反应，血清中的特异性抗体(IgG、IgM)与固定于芯片上的蛋白进行结合，清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质，再用Cy5-Anti-humanIgM(激发波长635nm，呈现红色)和Cy3-Anti-human IgG(激发波长532nm，呈现绿色)进行检测，通过荧光扫描仪读取信号，信号的强弱与抗体的亲和力和数量呈正相关。

(1)实验方法：

1)将血清样本自-80℃取出并置4℃复融；

2)复温：将芯片从-80℃冰箱取出，置于4℃冰箱复温30min，室温复温15min；

3)封闭：固定芯片围栏，向blocks中加入封闭液(3ml 10％BSA，加入7ml 1×PBS溶液)，置于侧摆摇床，室温封闭3hr；

4)样本孵育：弃尽封闭液，迅速向blocks中加入样本孵育液(血清样本用孵育液稀释30倍，孵育液成分组成为：1ml 10％BSA，加入9ml 1×PBST溶液)，置于侧摆摇床，4℃过夜孵育；

5)清洗：弃尽孵育液，迅速加入清洗液，再弃尽清洗液(1×PBST溶液)，如此循环数次，拆除围栏，置于水平摇床，清洗液室温清洗3次，10min/次；

6)二抗孵育：将芯片置于侧摆摇床，稀释后的二抗孵育液(二抗为荧光标记的抗人IgM、IgG抗体，将二抗用孵育液按1：1000比例进行稀释得到二抗孵育液，孵育液成分组成为：1ml10％BSA，加入9ml 1×PBST溶液)二抗用孵育液稀释1000倍)室温孵育1hr(从此步骤开始，注意避光操作)；

7)清洗：将芯片置于芯片清洗盒，加入清洗液，放置水平摇床上，室温清洗3次，10min/次，完成后用超纯水清洗2次，10min/次；

8)干燥：待清洗完成后，将芯片放置于芯片干燥机进行离心干燥；

9)扫描：按照扫描仪的使用说明对干燥后的芯片进行规范性荧光扫描并记录荧光信号(荧光信号的强弱与相应抗体的亲和力以及数量具有正相关关系)；

10)数据提取：通过GenePix Pro v6.0软件获取原始数据。

(2)数据处理：

F532Median是指在532nm通道下的信号点前景值的中位数，B532Median是指在532nm通道下的信号点背景值的中位数。为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理，即定义信噪比(signal-noiseratio，SNR)＝F532Median/B532Median，按照SNR的计算公式进行计算，分别得到426例贲门腺癌血清样本、360例正常血清样本的SNR值，然后对血清样本的SNR值进行中位值线性归一化处理。对于任意一个自身抗体，计算贲门腺癌组与正常对照组的差异倍数(差异倍数＝贲门腺癌组中位值线性归一化后的SNR均值/正常对照组中位值线性归一化后的SNR均值)，用以表示贲门腺癌组高于正常对照组的程度，进一步设置筛选条件：差异倍数>1.2、特异度≥60％、AUC≥0.55，从中筛选出符合条件的抗肿瘤相关抗原自身抗体。

(3)实验结果：

经过筛选，最终筛选出了5种自身抗体，分别为TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体；其中，TP53自身抗体的差异倍数为509.7，灵敏度为28.2％，特异度为90.0％；BLOC1S4自身抗体的差异倍数为1.3，灵敏度为58.2％，特异度为60.3％；MAGEA1自身抗体的差异倍数为1.7，灵敏度为43.9％，特异度为72.8％；CTAG1A自身抗体的差异倍数为9.9，灵敏度为20.7％，特异度为96.4％；IGHM自身抗体的差异倍数为2.1，灵敏度为27.2％，特异度为85.6％。而且，这5种自身抗体在贲门腺癌组血清中的表达水平均高于健康对照组，且差异具有统计学意义。

实施例2：ELISA检测TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体的血清表达水平

采用间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)进一步在大样本人群血清中检测实施例1筛选出的四种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平。

1、实验样本：

本研究纳入的426例贲门腺癌患者(贲门腺癌组)和360例正常对照血清(正常对照组)样本均来源于省部共建食管癌防治国家重点实验室标本库。426例贲门腺癌患者血清来源于经病理确诊且未经任何治疗的贲门腺癌患者，其中有28例贲门腺癌患者处于早期阶段(I期)；360例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据；本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

血清采集的具体操作与实施例1相同，具体不再赘述。

2、实验材料及试剂：

(1)5种肿瘤相关抗原蛋白：TP53重组蛋白、BLOC1S4重组蛋白、MAGEA1重组蛋白、CTAG1A重组蛋白、IGHM重组蛋白购买于Abcam公司；

(2)96孔酶标板(8行×12列)；

(3)包被液：含0.15％碳酸钠(Na2CO3)和0.29％碳酸氢钠(NaHCO3)的水溶液；

(4)封闭液：含2％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；

(5)血清样本稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记小鼠抗人免疫球蛋白抗体(以下简称HRP标记小鼠抗人IgG抗体)；

(7)抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(8)洗涤液：含0.2％(v/v)吐温20的PBST缓冲液；

(9)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为20％四甲基联苯胺二盐酸的水溶液，显色液B：3.7％Na2HPO4·12H2O，0.92％柠檬酸，0.75％过氧化氢脲素的水溶液)；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，现用现配；

(10)终止液：10％的硫酸。

3、实验方法：

(1)制备5种肿瘤相关抗原包被的酶标板：

分别制备肿瘤抗原TP53包被的酶标板、肿瘤抗原BLOC1S4包被的酶标板、肿瘤抗原MAGEA1包被的酶标板、肿瘤抗原CTAG1A包被的酶标板、肿瘤抗原IGHM包被的酶标板，五种酶标板的制备方法相同。

以制备肿瘤抗原TP53包被的酶标板为例，其具体操作步骤如下：

1)制备肿瘤抗原TP53蛋白溶液：将TP53蛋白采用包被液配制成浓度为0.125μg/mL的TP53蛋白溶液。

2)包被酶标板：将步骤1)制备的TP53蛋白溶液加入到96孔酶标板的每个反应孔中，加样量为50μL/孔，在4℃下包被过夜，然后将剩余的包被液甩出并拍干。

3)封闭：向包被后的96孔酶标板的反应孔中加入封闭液，加样量为100μL/孔，在37℃水浴中封闭2h，然后去除封闭液，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)3次并拍干，得到肿瘤相关抗原TP53包被的酶标板。

4)另外4种肿瘤相关抗原包被的酶标板制备的操作步骤与肿瘤相关抗原TP53包被的酶标板基本相同，其包被的浓度也相同。其不同之处在于：步骤1)采用的肿瘤相关抗原不同。

(2)血清样本中5种抗肿瘤相关抗原的自身抗体表达水平的检测：

同一血清样本，分别采用上述制备的5种肿瘤抗原包被的酶标板通过ELISA方法检测血清样本中TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体的表达水平。

以检测TP53自身抗体表达水平为例，其具体操作步骤如下：

1)血清样本孵育：将待检测的血清样本用血清样本稀释液按体积比1:100的比例进行稀释。将稀释后的血清样本加入上述步骤(1)制备的已包被TP53蛋白的96孔酶标板第1～11列的反应孔中，加样量为50μl/孔；在已包被TP53蛋白的96孔酶标板的第12列的第1-5反应孔加入按照1:100稀释的质控血清，加样量为50μl/孔，质控血清是作为质控，以进行不同酶标板之间的标化；在已包被TP53蛋白的96孔酶标板第12列的第6-8反应孔加入不含血清的抗体稀释液(加样量为50μl/孔)作为空白对照；然后将96孔酶标置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液(加样量为300μl/孔)洗涤5次并拍干。

2)二抗孵育：将HRP标记小鼠抗人IgG抗体用抗体稀释液按1:5000(v/v)的比例进行稀释，然后将稀释后的HRP标记小鼠抗人IgG抗体加入96孔酶标板对应的反应孔中，加样量为50μl/孔，置于37℃水浴孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤(加样量为300μl/孔)5次并拍干。

3)显色及终止反应：将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为50μl/孔，室温避光显色反应5-15min，然后向每个反应孔中再加入25μl终止液，终止显色反应；使用酶标仪分别读取其在450nm和620nm波长处的吸光度OD450、OD620，其中，620nm波长的吸光度OD620为背景值，以OD450与OD620的差值作为检测的吸光度值最终结果。

检测血清样本中BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体表达水平的具体操作步骤与上述检测TP53自身抗体基本相同，其不同之处在于：步骤1)中，检测时采用的酶标板分别为BLOC1S4、MAGEA1、CTAG1A、IGHM蛋白包被的酶标板。

4、数据处理：

对贲门腺癌组和正常对照组血清样本的吸光度值进行Kolmogorov-Smirnova检验，结果发现，研究对象血清样本中5种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平不符合正态分布(P<0.05)，因此采用第25百分位数(P25)、中位数(P50)以及第75百分位数(P75)来描述5种抗肿瘤相关抗原的自身抗体的表达水平分布；然后采用非参数检验(Mann-WhitneyU)比较贲门腺癌组和正常对照组中自身抗体的表达水平是否有差异。

5、实验结果：

贲门腺癌组和正常对照组血清样本中5种抗肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平分布如图1所示。由图1可知，TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体在贲门腺癌和正常组之间均具有差异，而且差异具有统计学意义(P<0.05)。由此说明，这5中肿瘤抗原的自身抗体对于贲门腺癌的发生有预警作用。同时也说明5种抗肿瘤相关抗原的自身抗体可以用于贲门腺癌的辅助诊断。

实施例3：5种抗肿瘤抗原自身抗体用于贲门腺癌诊断的能力评估

根据实施例2采用ELISA检测426例贲门腺癌患者和360例正常对照血清样本中TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体的表达水平结果，采用GraphPadPrism8.0分别绘制单一自身抗体、多种自身抗体组合诊断区分贲门腺癌和正常对照的ROC曲线，分析5种自身抗体用于贲门腺癌诊断的价值。

1、单一的自身抗体诊断区分贲门腺癌患者和正常人的能力：

基于426例贲门腺癌患者和360例正常对照血清样本中TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体、IGHM自身抗体的表达水平，绘制每一种自身抗体的ROC曲线，通过ROC曲线来评估每一种自身抗体单独诊断区分贲门腺癌患者和正常人的能力。

TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体，IGHM自身抗体诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线如图2所示。根据ROC曲线，以约登指数最大的OD值为截断值，同时计算相应的AUC以及95％置信区间、灵敏度和特异度。

由图2可知，5种抗肿瘤相关抗原自身抗体单独用于诊断区分贲门腺癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.55以上；其中，TP53自身抗体的AUC最大(0.599)，灵敏度和特异度分别为28.2％和90.0％。由此说明，5种抗肿瘤相关抗原自体均可以用于贲门腺癌的辅助诊断。

2、两种抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分贲门腺癌患者和正常人的能力：

以426例贲门腺癌患者和360例正常对照血清样本中TP53自身抗体和BLOC1S4自身抗体的表达量作为自变量，是否为贲门腺癌事件作为因变量，对TP53自身抗体和BLOC1S4自身抗体在贲门腺癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分贲门腺癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：P＝e

x＝0.305-0.298×BLOC1S4-0.737×TP53)，该诊断模型中：P表示预测概率，BLOC1S4表示BLOC1S4自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)，TP53表示TP53自身抗体在受试者血清中的表达量(表达量以实施例2记载的ELISA方法检测到的吸光度值结果计量)。再将各血清样本中BLOC1S4自身抗体和TP53自身抗体的表达量代入该诊断模型，即可得到各个血清样本的预测概率(即P值)。根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图3中A所示。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的P值为诊断区分贲门腺癌患者和正常人的最佳截断值，并计算灵敏度和特异度。

由图3中A可知，BLOC1S4自身抗体和TP53自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.649，最佳截断值为0.227，对应的灵敏度为37.1％，特异度为85.6％。

3、三种抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分贲门腺癌患者和正常人的能力：

以426例贲门腺癌患者和360例正常对照血清样本中TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体和MAGEA1自身抗体的表达量作为自变量，是否为贲门腺癌事件作为因变量，对TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体和MAGEA1自身抗体在贲门腺癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分贲门腺癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：P＝e

由图3中B可知，TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体和MAGEA1自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.672，最佳截断值为0.282，对应的灵敏度为53.5％，特异度为74.7％。

4、四种抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分贲门腺癌患者和正常人的能力：

以426例贲门腺癌患者和360例正常对照血清样本中TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体和CTAG1A自身抗体的表达量作为自变量，是否为贲门腺癌事件作为因变量，对TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体和CTAG1A自身抗体在贲门腺癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分贲门腺癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：P＝e

由图3中C可知，TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体和CTAG1A自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.706，最佳截断值为0.333，对应的灵敏度为51.6％，特异度为81.7％。

5、五种抗肿瘤相关抗原的自身抗体诊断区分贲门腺癌患者和正常人的能力：

以426例贲门腺癌患者和360例正常对照血清样本中TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体和IGHM自身抗体的表达量作为自变量，是否为贲门腺癌事件作为因变量，对TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体和IGHM自身抗体在贲门腺癌组和正常对照组血清样本中的表达量进行Logistic回归分析，构建诊断区分贲门腺癌患者和正常对照的诊断模型，该诊断模型为：P＝e

由图3中D可知，TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体和IGHM自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.718，最佳截断值为0.351，对应的灵敏度为54.0％，特异度为81.1％。

为了便于对比，将上述单个自身抗体或多个自身抗体组合诊断区分贲门腺癌和正常对照的ROC曲线AUC、灵敏度、特异度、约登指数进行统计，结果如表1所示。

表1 5种抗肿瘤相关抗原自身抗体诊断区分贲门腺癌患者和正常人的评价结果

由表1可知，与单一抗肿瘤相关抗原自身抗体相比，两种、三种、四种和五种自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC均能达到0.64以上，明显高于单一抗肿瘤相关抗原自身抗体；当五种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人时，其ROC曲线的AUC达到了最大为0.718；而且，当五种抗肿瘤相关抗原自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人时，其诊断的灵敏度达到最大为54.0％，此时，诊断的特异度达到81.1％，由此说明，五种抗肿瘤相关抗原自身抗体联合诊断效果最佳。

实施例4：采用验证集验证五种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断贲门腺癌的价值：

本研究纳入的298例贲门腺癌患者(贲门腺癌组)和252例正常对照血清(正常对照组)样本作为验证集来验证五种抗肿瘤相关抗原的自身抗体组合诊断贲门腺癌的价值。

298例贲门腺癌患者(贲门腺癌组)和252例正常对照血清(正常对照组)均来源于省部共建食管癌防治国家重点实验室标本库。298例贲门腺癌患者血清来源于经病理确诊且未经任何治疗的贲门腺癌患者，其中有28例贲门腺癌患者处于早期阶段(I期)；252例正常人血清来源于健康受试者，健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据；而且，298例贲门腺癌患者和252例健康受试者在性别和年龄之间的差异没有统计学意义。本研究获得郑州大学伦理委员会批准，所有的研究对象均已签署知情同意书。

采用本发明实施例2记载的ELISA方法检测验证集中每个样本中五种自身抗体的表达水平。然后将验证集中298例贲门腺癌患者(贲门腺癌组)和252例正常对照血清样本中的TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体和IGHM自身抗体的表达量带入上述构建的诊断模型P＝e

x＝0.717-0.823×CTAG1A-0.756×TP53-0.827×IGHM-0.172×BLOC1S4-0.512×MAGEA1中，即可得到各个血清样本的预测概率，根据预测概率绘制ROC曲线(如图4所示)，验证五种自身抗体组合诊断贲门腺癌的价值，并计算对应的灵敏度和特异度。

由图4可知，验证集中TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体和IGHM自身抗体五种自身抗体组合诊断区分贲门腺癌患者和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.725。

这也再次证明TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体和IGHM自身抗体的组合能够用于贲门腺癌的诊断。而且，采用诊断模型进行贲门腺癌诊断时，将受试者的TP53自身抗体、BLOC1S4自身抗体、MAGEA1自身抗体、CTAG1A自身抗体和IGHM自身抗体检测结果带入上述诊断模型P＝e

本发明中血清自身抗体组合作为一种稳定、微创、实时监测的生物标志物，提高了贲门腺癌诊断的准确性，具有深远的临床意义和推广性。同时，该方法简单快速、经济实用且便于临床开展。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域普通技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。