人HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒

摘要

本发明涉及人HHIPL1mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒。本发明率先设计出能够特异性检测HHIPL1mRNA表达水平的引物对以及能够特异性敲低HHIPL1mRNA表达的siRNA，并首次证实HHIPL1mRNA在非小细胞肺癌中的异常上调，促进癌细胞增殖与转移，且与不良预后密切相关。在此基础之上，本发明提出了HHIPL1mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估以及靶向治疗中用途，以及本发明所设计的够特异性检测HHIPL1mRNA表达水平的引物对与特异性敲低HHIPL1mRNA表达的siRNA在HHIPL1mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估以及靶向治疗中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及人HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒，属于生物医学技术领域。

背景技术

肺癌是导致癌症相关死亡的首要病因。近年来，尽管肺癌治疗技术得到了显著的提高，但患者5年总体生存率仍然无法令人满意，仅为20％左右。肺癌根据组织病理学类型，主要分为小细胞肺癌(15％)和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC，85％)，其中最常见的两种NSCLC为肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)与肺鳞状细胞癌(Lung squamous cell carcinoma，LUSC)。大多数肺癌患者在确诊时已经处于中晚期阶段，这为NSCLC的治疗带来了极大的挑战。因此，发现新的诊断标志物，并明确其在NSCLC增殖与转移进程中的作用及预后评估中的价值，对于推动NSCLC临床诊疗策略的发展具有重要意义。

逆转录-定量聚合酶链式反应(Reverse Transcription-quantitativePolymerase Chain Reaction,RT-qPCR)是一种体外特异性扩增目的DNA片段的技术,其中逆转录环节以目标mRNA为模板合成互补cDNA片段，定量PCR环节是以cDNA片段为模板合成上、下游引物之间的片段，合成目的片段的量与镶嵌在DNA双链中的荧光信号成正比。因此，设计出能够识别目的片段的特异性引物序列是目的mRNA定量准确的重要保证。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了人HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒。

本发明的技术方案如下：

人HHIPL1 mRNA在制备非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗产品中的应用。

根据本发明优选的，所述应用中HHIPL1 mRNA为非小细胞肺癌诊断与预后评估的生物标志物。

根据本发明优选的，所述应用中HHIPL1 mRNA为非小细胞肺癌靶向治疗的作用靶点。

根据本发明优选的，所述诊断产品用于非小细胞肺癌的诊断；所述预后评估产品用于评估非小细胞肺癌患者总生存期。

根据本发明优选的，所述HHIPL1 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌诊断和预后评估产品包括特异性识别HHIPL1mRNA逆转录产物cDNA的物质。

进一步优选的，所述特异性识别HHIPL1 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增HHIPL1 mRNA的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增HHIPL1 mRNA的引物对为SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌靶向治疗产品包括特异性敲低HHIPL1mRNA表达的物质。

进一步优选的，所述特异性敲低HHIPL1 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL1mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性干扰HHIPL1 mRNA表达的siRNA靶向识别序列如SEQ IDNO.4所示。

根据本发明优选的，所述非小细胞肺癌诊断和预后评估产品的检测样本选自细胞、组织、血浆以及血清。

一种非小细胞肺癌诊断和预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性识别HHIPL1mRNA逆转录产物cDNA的物质。

根据本发明优选的，所述特异性识别HHIPL1 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增HHIPL1 mRNA逆转录产物cDNA的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增HHIPL1 mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ IDNO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR的检测试剂。

一种非小细胞肺癌靶向治疗药物，所述药物包括特异性敲低HHIPL1 mRNA表达的物质。

根据本发明优选的，所述特异性敲低HHIPL1 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL1 mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性敲低HHIPL1 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL1mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性干扰HHIPL1 mRNA表达的siRNA靶向识别序列如SEQ IDNO.4所示。

有益效果：

本发明研究发现HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌肿瘤组织中异常上调且与患者不良预后密切相关，敲低HHIPL1 mRNA表达能够显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移与侵袭，在此基础上，本发明设计出能够特异性识别HHIPL1 mRNA的引物对以及特异性敲低HHIPL1 mRNA表达的siRNA，提出了HHIPL1 mRNA在诊断、预后评估以及靶向治疗中的用途。

附图说明

图1是应用本发明所述引物对检测10对非小细胞肺癌肿瘤组织与临近正常肺组织中HHIPL1 mRNA表达水平；以10例正常肺组织中HHIPL1 mRNA表达水平为参照，以ACTB为内参，按照2

图2是本发明分析TCGA数据库中NSCLC RNA测序数据，以110例临近正常肺组织中HHIPL1 mRNA log

图3是本发明应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析HHIPL1 mRNA表达水平对NSCLC患者预后的影响，应用Log-rank检验HHIPL1 mRNA高表达与低表达的NSCLC患者之间预后差异是否具有统计学意义的示意图。

图4是应用本发明试剂盒所述siRNA特异性敲低A549细胞中HHIPL1 mRNA表达水平(左)，以及应用CCK-8实验和Transwell实验检测HHIPL1 mRNA表达下调对A549细胞增殖、迁移与侵袭能力影响的示意图(右)。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例中所设计的非小细胞肺癌病人手术标本收集与检测是经过山东大学第二医院医学伦理委员会批准，所有病例都得到了患者的知情同意。

人源非小细胞肺癌细胞系A549细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

实施例1

收集10对手术切除的非小细胞肺癌肿瘤组织与临近正常组织标本，提取总RNA，应用实时荧光定量PCR检测样本中HHIPL1 mRNA表达水平，所用引物为本发明中特异性识别HHIPL1 mRNA逆转录产物cDNA的引物序列SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3，结果显示，非小细胞肺癌癌组织中HHIPL1 mRNA表达水平相比于临近正常肺组织显著上调，说明HHIPL1 mRNA可以作为非小细胞肺癌标志物，并应用于非小细胞肺癌的诊断，具体分析结果如图1所示。

所述10例患者术前均未接受放化疗，且术后病理结果证实为非小细胞肺癌。

具体实施过程如下：

(1)收集组织样本：收集10对手术切除的非小细胞肺癌标本，肿瘤组织均取自中心非坏死部位，邻近正常肺组织取自距离肿瘤边缘大于5cm的区域，液氮速冻，-80℃保存；

(2)提取组织总RNA：使用RNA-Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)试剂盒并按照说明书内所述步骤提取总RNA，所提RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测，RNA的浓度和纯度应用NanoDrop2000检测。

(3)RT-qPCR：使用lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)去除基因组DNA，并通过逆转录合成cDNA；应用本发明中特异性识别HHIPL1 mRNA的引物对(SEQID NO.2与SEQ ID NO.3)与Power SYBR

其中，引物对的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-gccagaacaagttcgaggaggt-3’(SEQ ID NO.2)；

下游引物：5’-ggtaggcgaaaatcggcagcaa-3’(SEQ ID NO.3)。

去除基因组DNA的体系：RNA(250ng/μL)2μL，5×gDNA Buffer 2μL，RNase-FreeddH

逆转录PCR体系：lnR-RT Primer Mix 2μL，lnR RT Enzyme Mix 1μL，10×lnR RTBuffer2μL，RNase-Free ddH

实时荧光定量PCR体系：Power SYBR

上述试剂均来自lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)与Power SYBR

实施例2

应用TCGA数据库，分析非小细胞肺癌标本测序数据，结果显示非小细胞肺癌肿瘤组织中HHIPL1 mRNA表达水平相比于临近正常肺组织显著上调，进一步证实了实施例1中的研究结果，具体分析结果如图2所示。

具体实施过程如下：

在TCGA数据库中下载NSCLC标本测序所得HHIPL1 count值，其中临近正常肺组织110例，NSCLC肿瘤组织1017例，计算每个样本的log

实施例3

应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析HHIPL1 mRNA表达水平对非小细胞肺癌患者预后影响，结果显示HHIPL1 mRNA高表达的非小细胞肺癌患者的总生存期相比于HHIPL1mRNA低表达的非小细胞肺癌患者明显缩短，说明HHIPL1 mRNA能够用于评估非小细胞肺癌患者总生存期，具体分析结果如图3所示。

具体实施过程如下：

在Kaplan-Meier Plotter网站中下载NSCLC患者的预后信息及其对应的HHIPL1mRNA相对表达水平，按照HHIPL1 mRNA相对表达水平将NSCLC患者分为高、低表达两组，应用Kaplan-Meier法分析两组患者总生存期(Overall Survival)的差异，共1144例NSCLC患者，其中HHIPL1 mRNA高表达组包含395例，中位生存期57个月；HHIPL1 mRNA低表达组包含749例，中位生存期89个月，组间生存差异的统计学意义通过Log-rank检验确定。

实施例4

设计能够特异性干扰HHIPL1 mRNA表达水平的siRNA(siRNA-HHIPL1)，其靶向序列如SEQ ID NO.4所示，应用siRNA-HHIPL1敲低非小细胞肺癌细胞系A549细胞中HHIPL1 mRNA表达水平，应用CCK-8实验检测HHIPL1 mRNA表达下调对A549细胞增殖能力的影响，应用Transwell实验检测敲低HHIPL1 mRNA表达对A549细胞迁移与侵袭的影响，具体结果如图4所示。

具体实施过程如下：

(1)使用RNAi Designer网站设计能够特异性敲低HHIPL1 mRNA表达水平的siRNA-HHIPL1，并由北京擎科生物公司合成该siRNA。

其中，所述siRNA靶向HHIPL1 mRNA的核苷酸序列为：5’-gcctcatcaacaactacta-3’(SEQ ID NO.4)。

(2)使用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Life technologies，13778-150)将特异性干扰HHIPL1表达的siRNA-HHIPL1和阴性对照siRNA-NC分别转染至A549细胞中，转染后48小时，使用RNA-Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)提取上述细胞总RNA，使用lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)去除基因组DNA，并进行逆转录合成cDNA，使用Power SYBR

(3)CCK-8实验：使用Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Life technologies，13778-150)转染试剂将siRNA-HHIPL1和siRNA-NC分别转染到A549细胞中，24小时后使用胰蛋白酶消化并收集细胞，离心后重悬细胞沉淀并调整浓度至20,000个/mL培养基，将细胞种入96孔板中(100μL/孔)，每组设置6个复孔，铺板后2-4小时，以及之后每隔24小时向每孔加入10μL CCK-8试剂(TargetMol,C0005)并在37℃孵箱中孵育1小时，简单震荡后使用酶标仪测量450nm的吸光度值。

(4)Transwell实验：将细胞悬液重新离心，使用无血清培养基重悬细胞沉淀并调整浓度至100,000个细胞/mL培养基，将普通或预先铺设基质胶的Transwell小室(Corning，3422)(分别用于迁移或侵袭实验)放入24孔板中(含600μL完全培养基/孔)，吸取200μL上述细胞悬液加入到小室内，37℃孵箱培养48小时，使用4％多聚甲醛室温下固定细胞15分钟，甲醇处理细胞25分钟，然后使用0.1％结晶紫染色过夜，使用棉签去除小室内面未穿孔的细胞，显微镜下观察穿孔细胞并计数。

以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 人HHIPL1 mRNA在非小细胞肺癌诊断、预后评估和靶向治疗中的应用及试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7371

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cccttccctg ccgccgcgag cgccccggga ggggaccggg gctgccgtcc ctccgcctct 60

tcccccgcgg ggcgtagcga tggcccgggc cagggccggg gcgctgctgg cgctttgggt 120

gctcggggcc gccgcgcatc cgcagtgcct ggacttcagg ccgcccttcc ggccgacgca 180

gccgctgcgc ctctgcgcgc agtactcgga cttcggctgc tgcgatgagg ggcgcgacgc 240

cgagctgacc cgccgcttct gggccctggc gagccgcgtg gacgccgccg agtgggccgc 300

gtgcgccggc tacgcgaggg acctgctgtg ccaggaatgc tcgccgtatg cagcccacct 360

ctatgacgcc gaggacccat tcacgcccct gcgcacggtg cccgggctct gccaggatta 420

ctgcctggac atgtggcata agtgccgggg gctgttccgt cacctgtcaa ctgaccagga 480

gctctgggcg ctggagggca accttgccag gttctgccgc tacctgtccc tggatgacac 540

ggactactgc ttcccttacc tgctggtcaa caagaacctc aactcaaacc tgggccacgt 600

ggtagccgat gccaagggct gcctgcagct gtgcctggag gaggtggcca acgggctgcg 660

caaccccgtg gccatggtcc atgccaggga tggcacccac cgcttcttcg tggccgagca 720

ggtggggctg gtgtgggcct acctgcccga ccgctcgagg ctggggaagc ctttcctgaa 780

catcagccgg gtggtgctca cctcgccctg ggagggtgac gagcgtggct tcctgggcat 840

tgccttccac cccagcttcc agcacaaccg caggctctac gtctactact cagtgggtat 900

ccgcagcagt gagtggatcc gcatcagcga gttcagagtc tccgaggatg acgagaacgc 960

cgtggaccac agctctgaga ggataatcct ggaggtcaaa gaaccagcct caaaccacaa 1020

cgggggccag ctgcttttcg gggatgacgg gtacctctac atcttcactg gagatggcgg 1080

gatggccgga gacccctttg ggacatttgg aaatgcccaa aacaagtcgg cgctgctggg 1140

caaggtgctg cgcatcgacg tggaccgtaa ggagcgcggc ctgccctacg gcatcccgcc 1200

cgacaacccg ttcgtgggcg accccgcggc gcagcccgag gtctacgccc tgggcgtgcg 1260

caacatgtgg cgctgctcct tcgaccgtgg cgacccctcc tcgggcactg gccgcgggcg 1320

cctcttctgc ggcgacgtgg gccagaacaa gttcgaggag gtggacgtgg tggagcgcgg 1380

cggcaactat ggctggcgcg cgcgcgaagg gttcgagtgc tacgaccgca gcctgtgcgc 1440

caacacctct ctcaatgact tgctgccgat tttcgcctac ccgcacacgg ttggcaagtc 1500

ggtcacaggg ggctacgtgt accggggctg cgagtacccc aacctgaacg gcctctacat 1560

ttttggggat ttcatgagcg ggcgtctgat gtccctccaa gagaacccag ggacaggcca 1620

gtggcagtac agtgagatct gcatgggcca cggccagacc tgtgagttcc caggcctcat 1680

caacaactac tacccgtaca tcatctcctt cggggaggac gaggccgggg agctgtactt 1740

catgtcgaca ggggagccga gtgccacagc tccacgcgga gttgtctaca aaataattga 1800

cgcatccagg cgggcaccac ctggcaaatg tcagatccag cctgctcagg tgaagatcag 1860

aagccgtctc atcccctttg tgcccaaaga aaagttcatc ccgaagacac ggagcacccc 1920

gcggcctaca gcgcgggcgc ccacgcgggc gccccgccga gggcgcccca cggccgctcc 1980

ccccgcgcca accccgcggc cagcgcggcc cacccagcag ccagggagcc ggaggggcgg 2040

cgggcggcgg cgggggcggc tgaactcggc gagccgggcg ttccgggatg gcgaggtgcg 2100

cctggtgcgg cccgcgggcc tgagctctgg cagcgggcgc gtggaggtgt tcgtgggcgg 2160

acgctggggc accgtgtgcg acgactcctg gaacatcagc ggcgccgccg tcgtgtgtcg 2220

ccagctgggg tttgcctacg ccgtgcgcgc cgtcaagaga gccgagttcg gccagggcgg 2280

ctcgctgccc attctgctgg acgatgtgcg ctgcgcgggc tgggagcgga acctgctgga 2340

gtgccagcac aacggcgtgg gcacccacaa ctgcgagcac gacgaggatg cgggcgtcgt 2400

gtgcagccac cagaaccccg acctgtaggc aacacgccgc tgccccaggc catcccgccg 2460

gcgggggagc ctggcagggg ccgctccgcc ctgtgtgcgc ccagcgggtg cacacgtgtt 2520

ctagagtgaa gggggtgcgg gtgtgtgctg tcctggggac atgtgtgagg cgctgcagtg 2580

catgtgtgtc ctctgcagac ccaaggcagg agtgtgtgtt gggggcggtg tgggctctgg 2640

aagtgcatgg tccatcatgg gcgggaggag ttcctttctt acctccaagc gtttcagaca 2700

ccagcaggaa cagcagccgg gctgtgggac cctgaggagg gagggcagcc aggcttcgag 2760

gacggacatg gcccctggct gtgctaacag aggcacagct tgcagactga gggcggtggg 2820

gagaaccagg cttgtcctgc ccacagctgg aatggaaggt gcaagaacag ccggagggtg 2880

gcctgaggaa tgtggcccgg acagcatggc ctggtgcccg catccccccc accccctggc 2940

agtcagaggc gctggagaga accggaaggc atccagtggg gaagggaaag ccttctggaa 3000

ggtgggagca gggtgagctg caggcctggg gccccactgg aggggcaggc tgcgtggagg 3060

agccagcacc tgctcaggga ggatggctgt gaggactgga tgacctccaa ggccgtatgc 3120

tggagaagcc actcagcagc atactcagtc cttgtgggtg ctcctgggat gggaccagcc 3180

tcctccaacc ctgaggcctg attctctctt gctcttgggg cagaagccac ccacactagc 3240

tgggcagagc tttcaccctg gccctccagt gagtcggtgg gcctccacta ctttcaaagc 3300

tgtgtttggg ccctggggcc acctctgtcc tttccatccc catccctgct cagtgtaaac 3360

ccaggagacc tgattcctcc agccctacct cggggctgac caggctgggg gtccagtgaa 3420

actactgaca ctttttcacc cagggctatg ccaataatgt ggctgtttac acaccacttt 3480

cctgcctcct ctctgacctg cacctgtgtg ggagccgggg tgggaaccag gagaaagggg 3540

tgaggcctcc cgcttcccac ctgcatcaca ggtggaagct ccttcactcc agggatgctc 3600

ggccctggct ctgtgccagg ccgcagaggg gcacttagta tgactgcgct cagcctcgga 3660

tgggagcacg ggtggggggt gggtaagcag atgagtcacc aggcagtgaa gacaggatgt 3720

ggcccatgtc gggggttgga agaggtctgg gtggggcacc caaacccaac ctatgggggg 3780

gctttgggag ggggtgatgc tgtgccaagt tctgggagct ggcaccaggg gtggctgggc 3840

aggccttggg gcaggcatga gtctggcagg gtctcctagc tgctagtata gggtctccta 3900

gccactagta taggatcctg ggctgcagca gaaagcttta ggtcactgtc ttggactcct 3960

catactctgt gctttacaga atgggaaact gaggcacaca gaggttagat atcttagggc 4020

accaagccag ggaagggaga agtcaagttt gaatacagca gcttagttta gagtccccgc 4080

accctaacca ctgccctccc cagctacact atgcctgcag agagcggtgt gctggggctc 4140

ctgcctggtg tgggagtgcc agcctggctg ggaagcagct gatggagatc cctgggggct 4200

cctcttgcct ggcaggtgcc cccgctgctg gcctcatgct cctctcgggc ctccagtggc 4260

ccaggggagg ttgagtgggc atcttcctgg gatgcagggg agttctgagc tctgacgccg 4320

ggcgtgttag gagatagcag gccgttaatg accatcccag ccgaattcct cactgtgcag 4380

atgaggaagt gagctcaggg aggctgagtg tcccaggcct gttgccagat gaggccacgc 4440

tgagactgga gccagggaag gtgcagcaag ccttgaggcc ctcaagaatg cagccgagcc 4500

agggccctgc ttgcctggcc ccagaagctg ttttgctcag agctggatta ggagggttgg 4560

caaagggagc tctgggtgcg gcctcaggcc ctccagtact tctctgggca gttcgggctt 4620

tggccttcag tcttccaggc caggcgctct tcctccccag cctccaactc atcacctctc 4680

aggccccaaa ccaggcctgg gctaggctgc agcctgcctc ctggggactc actccacagt 4740

ccccaggtca gtggtcccca acctttttgg catcatggac tggtttcatg taagacaatt 4800

tttccatgga tgggggttgg ggggatggtt ttgggatgaa atgtcccacc tcagatcatc 4860

aggcattaga ttctcataag gagttcacag cctagatccc tcgcatgcac agttcatagt 4920

aggtttcatg ttcctatgcg gatctaatgc cactgctgat ctggcaggag gcagagctca 4980

ggtgggaatg cttgctcccc acactaccct gccccactgc cactcacctc ctgctgtgtg 5040

gcccggttcc taacaggcca cccatcagta ctggtccgtg gcccagggtt tggagacctc 5100

tgccctaggt agtaataaga gtggacagct gttatatgta aatacttgtt ccccgatgct 5160

ggaaagaaat agcactaaaa cataaattta attctttcag caaggcaatt ttactttctg 5220

cagaaagggt gctcatcgca gatggaacaa tagtgagagg acacctgaac aaaggaggga 5280

agcaattgtt agcccttatg cagtttgtcc ctgctactgt gtcctatgtc cattggcaga 5340

agccagaccg cacaatctaa actaaaaccc gattggctgt ttaaaatttt tctaaatagg 5400

taaaagtaat ggaaggataa aggaaaagag gaagttgctt acgaaaggac ttagaaaagt 5460

aataatattc ccaaataagg aaggggtata ggctgtgagc tgggacatgc ctgtgagcac 5520

gtccagcaca gatatcttgg ttaaagtata aggacataga acgtactatg tgcctgtgag 5580

cacgtctaac agttacatag aatagggctt gacaaagagt tattagcata aagcaaggag 5640

gtttgaagga agttcgtctt taaaagaaac cattatttct aacacttacg atttattctt 5700

taacaagaag ggaaactttc aagaggaact tttactttct acaacagctg acctctgctg 5760

agcgcttact acatgccaag cactgctctg aaagtttaac ataccattca ctcatgtaat 5820

cctcatatta atgcacattt actcacgtgg aagccgagtt ccagggcatt tgtcacttac 5880

caaatgtcac atagccaaaa tttgaatttg agcccaggta gtccagctct gggaccctgc 5940

tgtgggcctt cctgctgggc cacctcaagg gcattgaaag ccagccccac cccactggga 6000

cacaagttca gagaagggca gagctggctg cctgtccagt gcttctttca ctccaccacc 6060

tacagctggc cgctgaggga gcattcacat gtgactctgt ccccagggac tccgatcttg 6120

ccttaaagtc ctccagggcc tctgaggatg ggggcacagc cttcaccctc accccctcta 6180

atccaacctc tagtcaatag ccaggatcag attctcagag aggggctgcc ctgcccagtg 6240

ccacacagct tagtgctgga gcctcagggt caatgctgca ggggtggccc agtgtccagg 6300

actgtgttca agacatcagt cagaggtcac aacatcccag gccctagact gagcctaggg 6360

gtcaccatgt tgatacctta gaaatgtttg ggaggttcaa ggaagctgga aactgggttc 6420

cagtcctggc tctgtgcctc tctgagtctc attgcaaaat agaggtcacc agaaggatta 6480

ctggatgaaa aatgaggtag cattgcagac gtgcatggca cgtacactct aggttgcttc 6540

ctagacagaa agctcagttc gaggctggtg gcatccatgc tggcagcagc caactgtctg 6600

cgacagagtg aggaggggca tgccacgtga aggaccagca tcagaatgac atgggaagaa 6660

actctcacaa tagcagaaga aagagctcct tcagcctaac atgtagaact caagtcttct 6720

tgtcgcgctt ctgtcccctc gcccctcctc ccccactgag aactagcttt tactgagcag 6780

ttattacatg ccagctacct cgggtgtgtc agctcattta atcttgacaa cagctccacg 6840

agacaccctc aatatcactg tccctgtttt ccagatgagg ggacagattc ctagggtgtt 6900

atgtaagtgg tccccggggc tttagaggca ggtttgcacc aaggcccatt ctcccagagc 6960

cggatccttc tccttccctg ggatacagca cctccaccct gccaggccac ccatgtaaag 7020

gcagccaatt cagagccacc tcttatgcct gcatctcccc aacaattcct gctgggaaac 7080

cactcctcgt atggtgtcat ctacaccagt gggtttcaag cttgagaaga atcaagttct 7140

acagggctgc ttaaaacaca ggttgctggg tcctgtctct cagagttttt gactcagtct 7200

tggttgagaa ttttcagttc tagaagctcc tgggtaatgc taatcctcct gttctagggg 7260

ccatagtcat tgtccatact ggtgctatcc aatagaaaca taatgtgagc caaataggta 7320

atttaaaatc tgcttgtagc catgttaaaa aagtaaaaca ggtaaaatta a 7371

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccagaacaa gttcgaggag gt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtaggcgaa aatcggcagc aa 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctcatcaa caactacta 19