一种产虾夷扇贝毒素的海杆菌及虾夷扇贝毒素的制备方法

摘要

本发明公开了一种产虾夷扇贝毒素的海杆菌及该菌在制备虾夷扇贝毒素中的应用，该海杆菌ZZD‑4是从网状原角藻培养物中分离得到，进行鉴定后，确定其为海杆菌Marinobacter sp，并将其于2021年11月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter,CGMCC)，保藏地址为：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该假单胞菌HTY‑1的保藏号为CGMCC NO.23769。海杆菌ZZD‑4稳定地高效地分泌虾夷扇贝毒素，且培养条件简单，发酵成本低，毒素产量高，该毒素的制备方法经济高效，有助于实现虾夷扇贝毒素的大批量生产。

说明书

技术领域

本发明涉及毒素制备技术领域，尤其涉及一种产虾夷扇贝毒素的海杆菌及虾夷扇贝毒素的制备方法。

背景技术

虾夷扇贝毒素(Yessotoxins，YTXs)是一类脂溶性疏基聚醚类化合物，最早从日本的虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)中被分离出来。该类毒素主要造成心肌、肝脏、脾脏，以及神经细胞损伤；还可以激活人等很多生物的成神经细胞瘤细胞系、Hela细胞系以及Capase家族蛋白等细胞系，同时诱使成纤维细胞出现凋亡，也被认为是肿瘤促进剂。尽管YTXs不像传统的DSP组分(OA组)一样引起腹泻效应，但腹腔注射毒性较高，其半致死剂量(LC

这类毒素在化学结构上由于具有相同的骨架，结构较为相似，到目前为止，从双壳类及海洋甲藻中发现的YTXs约有100来种，以下为主要的几种YTXs的化学结构。

虽然YTXs的中毒风险似乎没有那么高，但是仍需通过进一步研究这类毒素的吸收转化途径及机制，才能对其真正的危害做出准确评估，因此，需要YTXs毒素标准品，此外，该毒素的检测等方面也需要YTXs毒素标准品。但是，目前国内市面缺少YTXs毒素标准品，国外虽已有部分YTXs毒素标准品出售，但售价昂贵。因此，目前对于YTXs毒素存在非常大的缺口。由于YTXs的获取方式较为单一，产量低，远远不能满足需要。因此，需要开发更广阔高效的获取毒素的方法，开发YTX类毒素样品有着重要意义。

目前，YTXs主要是由甲藻中膝沟藻科(Gonyaulacaceae)的网状原角藻(Protoceratium reticulatum)、多边舌甲藻(Lingulodinium polyedrum)以及具刺膝沟藻(Gonyaulax spinifera)产生。现有技术主要是通过收集网状原甲藻来提取和分离纯化YTXs；但是这种方法需要大量培养海藻，不仅工作量较大，具有很大的不确定性，并且其培养周期长，需要配套的藻类培养设备，生产成本较高，不适合大批量生产。

因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种产虾夷扇贝毒素的海杆菌ZZD-4及该菌在制备虾夷扇贝毒素中的应用，还提供了虾夷扇贝毒素的制备方法，该海杆菌的培养条件简单，毒素产量高，制备方法经济高效，有助于实现虾夷扇贝毒素的大批量生产。

为解决上述问题，本申请提供以下的技术方案：

第一方面，本申请提供一种产虾夷扇贝毒素的海杆菌，其被命名为海杆菌ZZD-4(Marinobacter sp.ZZD-4)，保藏编号为CGMCC N0.23769。

该海杆菌ZZD-4是从网状原角藻培养物中分离得到，进行鉴定后，确定其为海杆菌Marinobacter sp，并将其于2021年11月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏地址为：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该假单胞菌HTY-1的保藏号为CGMCC NO.23769。

经过实验检测后，确定该海杆菌生产homo-YTX(后续简称h-YTX)，主要分布于其发酵上清液中。

第二方面，本申请还提供上述产虾夷扇贝毒素的海杆菌在制备虾夷扇贝毒素中的应用。由于海杆菌ZZD-4稳定地分泌虾夷扇贝毒素，且该菌的培养条件简单，发酵成本低，可通过提取其发酵液中的毒素进行虾夷扇贝毒素的大批量生产。

第三方面，本申请还提供一种利用上述海杆菌制备虾夷扇贝毒素的方法，其包括以下步骤：

S1、将该海杆菌ZZD-4接种到液体培养基中进行培养，离心分离并分别收集发酵上清液。

该步骤中可提前对海杆菌ZZD-4进行活化，制备种子液，再将种子液接种到液体培养基中进行发酵培养，有助于提高菌体生物量以及毒素的产量。

种子液的制备方法为：

挑取固体培养基上的ZZD-4的细菌菌落，将其接种于装有无菌培养基的100mL锥形瓶中，装液量：为容积的一半，28℃培养1-2d，镜检确认菌体生长良好，无杂菌污染，即得到种子液，可用于接种到发酵用的液体培养基中。其中，所述无菌培养基可采用常规的海洋2216E液体培养基，也可采用优化的后续的发酵培养基。

可选地，S1步骤中的液体培养基为海洋2216E液体培养基，其包括以下浓度的各成分：酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，磷酸铁0.1g/L；溶剂为陈海水，pH为7.2～7.6。

优选地，S1步骤中的液体培养基采用发酵培养基，其包括以下浓度的各组分：酵母提取物4～6g/L，蛋白胨5～7g/L，磷酸二氢钾0.1～0.3g/L，氯化钠0.4～0.6g/L；溶剂为陈海水，pH为7.2～7.6。

最优选地，所述发酵培养基包括以下浓度的各组分：酵母提取物5g/L，蛋白胨6g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.5g/L；溶剂为陈海水，pH为7.2～7.6。

优选地，S1步骤中，海杆菌ZZD-4的接种比例为1:100，装液量为容器的一半容量，发酵条件为：28℃培养3-4d，转速为120～200rpm。

优选地，所述方法中，S1步骤中的离心条件为：3000-5000rpm，15-25min。

S2、将得到的发酵上清液低压旋转蒸发至水完全蒸发，将发酵液盐结晶用甲醇进行萃取，萃取至少2次，每次萃取之后超声处理10～20min,得到毒素粗提物；

优选地，超声处理的条件为：处理10min，采用冰浴，40Hz，工作2s间歇1s，得到毒素粗提物。

优选地，所述低压旋转蒸发的条件为：真空度≤0.05Mpa，温度50～55℃，转速为50～60rpm。

S3、用甲醇上述毒素粗提物定容，在将其通过固相萃取柱进行净化处理。优选地，所述方法中，所述固相萃取柱为HLB固相萃取柱。

优选地，所述方法中，S3步骤后还包括以下步骤：

S4、将上一步得到的净化液通过色谱纯化，得到纯化的虾夷扇贝毒素。

优选地，所述色谱分析的条件为：色谱柱采用C18柱，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，进样量为1uL，流动相中采用乙腈溶液和乙酸铵甲酸水溶液进行梯度洗脱。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一株海杆菌ZZD-4，该海杆菌的培养条件简单，毒素产量高，其产出的虾夷扇贝毒素为h-YTX，产率较高达到19μg/L；其制备方法经济高效，有助于实现虾夷扇贝毒素的大批量生产。

2、本发明中所用的海杆菌ZZD-4，其发酵生产h-YTX发酵周期短，仅培养3d就达到毒素产量最高值，能效转化率高；制备方法中所用试剂与材料均为微生物发酵常用试剂，成本低廉且安全无害，具有较高的经济价值。因此，本发明提供的虾夷扇贝毒素的制备方法具有较高的应用前景，操作简单，对技术人员的技术要求不高，熟悉无菌操作即可实现生产。

附图说明

图1为h-YTX的标准曲线；

图2为h-YTX标准品的色图谱；

图3为本发明的方法制备得到的h-YTX的色图谱。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例一海杆菌ZZD-4的分离和鉴定

1、菌株分离

(1)藻液的处理：配制海洋2216E固体培养基，其配方如下：酵母提取物1g，蛋白胨5g，磷酸铁0.1g，琼脂20g，陈海水1L，pH 7.2～7.6。取生长到对数期的网状原角藻培养物，用超声破碎仪超声10min，用无菌水稀释至10

(2)菌株的分离纯化：待平板菌落长成，挑取不同形状、不同颜色的单菌落分别接入2216E固体培养基培养，经2-3次纯化后于25℃保藏备用。

2、菌株的鉴定

(1)形态学鉴定

生长24d后，菌落呈现淡黄色，菌落边缘整齐。

(2)分子生物学鉴定

利用细菌16SrRNA基因通用引物B8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，B1510：5’-GGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，以提取的菌株基因组DNA为模板扩增16S rDNA序列。扩增的长度约为1500bp，PCR所用引物由上海铂尚生物技术有限公司合成，PCR反应体系(30μl)见表1。

表1PCR反应体系

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min 30s，55℃退火1min 30s，72℃延伸1min 30s，循环30次；72℃充分延伸10min。

将PCR扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司青岛分公司进行测序，得到该菌株的16S rDNA片段，长度为1029bp，序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

将该16SrDNA基因序列提交NCBI进行在线比对，发现：该基因序列与Marinobactersp.相似度为99.01％。基于菌株的形态学特征和分子生物学鉴定结果确定上述分离菌株为海杆菌Marinobacter sp.，将其命名为ZZD-4。

实施例二虾夷扇贝毒素的提取和鉴定

1、菌株的培养

将分离纯化后的菌株的单菌落接种于装有海洋2216E液体培养基的100mL锥形瓶中，瓶中的装液量为50mL，28℃培养3d，转速为160rpm。将得到的发酵液进行离心(条件为4000rpm，20min)，分别对上清液和菌丝进行毒素的提取。

所述海洋2216E液体培养基的配方为：酵母提取物1g，蛋白胨5g，磷酸铁0.1g，陈海水1L，pH 7.2～7.6。

2、毒素的提取

(1)将上一步得到的发酵上清液低压旋蒸(条件为：真空度≤0.05Mpa，温度55℃，转速为50rpm)至水完全蒸发，将发酵液盐结晶和菌丝沉淀分别用少量的甲醇萃取，萃取2次，每次萃取之后超声处理10min,采用冰浴，40Hz，工作2s间歇1s，得到毒素粗提物。

(2)再分别用甲醇将发酵上清和菌丝中的毒素粗提物进行定容，取3mL上清液通过HLB固相萃取柱(6mL，500mg)进行净化。

(3)将得到的净化液通过LC-TOFMS分析，并与毒素标准品进行比对，即可确定产生毒素的菌株。

LC-TOFMS分析的实验条件如下：

A、液相色谱条件：

色谱柱采用C18柱(内径2.1mm，柱长100mm，粒径3μm)，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，进样量为1uL，采用的流动相如下表2。

表2液相色谱流动相

B、质谱条件：

离子源为ESI离子源，气流量为反吹气1(Arb)鞘气35(Arb)辅助气10(Arb)；扫描模式为负离子；喷雾电压：3000V；采用的离子参数如下表。

表3质谱的离子参数

结果发现，h-YTX标准品检测图谱为图2，本实验得到的样品检测图谱为图3，比较这两张色谱图，都是在相同的出峰时间3.75的位置附近出现相同的特征峰，因此，可得到结论：上述从海杆菌ZZD-4提取到的样品为h-YTX；本实验分离到的海杆菌ZZD-4，产生h-YTX，且该毒素主要存在其发酵液上清中。

实施例三菌株发酵方法以及虾夷扇贝毒素的制备方法的优化

1、实验方法：

(1)种子液的准备：配制海洋2216E液体培养基，取生长在固体培养基上的ZZD-4菌落，接种于装有无菌培养基的100mL锥形瓶中，装液量为50mL，28℃培养1-2d，镜检确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种发酵液。

(2)发酵优化培养：设置实验组和对照组，实验组采用优化的发酵培养基，对照组采用海洋2216E液体培养基，分别将种子液以1:100的接种比例接种于装有无菌培养基的5L锥形瓶中，装液量：2.5L，28℃培养3-4d，转速为160rpm，得到含有HC-YTX的发酵液。

发酵培养基的配方为：酵母提取物5g，蛋白胨6g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠0.5g，陈海水1L，pH调至7.5。

(3)将优化培养液通过离心(4000rpm，20min)得到发酵上清液，按照实施例2中的毒素提取方法进行提取和纯化，并计算两种不同培养基生产的菌体的生物量以及得到毒素的产量。

2、实验结果及分析

表1.对照组的毒素检测结果

表2.实验组的毒素检测结果

由表1的结果可知，利用本申请的海杆菌ZZD-4发酵制备的HC-YTX总产量较高，可达到7.9μg/L。将表1和表2的结果进行比较可知，利用优化的发酵培养基制备的发酵液中的h-YTX产量得到大幅度的提高，达到对照组(使用海洋2216E液体培养基)的毒素产量的2.4倍。从结果也可看出，该毒素较为稳定，但是仍存在些微降解现象，发酵时间大于3d时，毒素产量有所降低。

实施例四菌株发酵培养基的优化

1、实验方法：

(1)种子液的准备：同实施例三。

(2)发酵优化培养：设置多个试验组，各个试验组采用营养条件不同的培养基，发酵过程同实施例三。

各试验组的发酵培养基的配方分别如下：

①试验组1发酵培养基：酵母提取物5g，蛋白胨6g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠0.5g，陈海水1L，pH调至7.5。

②试验组2发酵培养基：酵母提取物4g，蛋白胨6g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠0.5g，陈海水1L，pH调至7.5。

③试验组3发酵培养基：酵母提取物6g，蛋白胨6g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠0.5g，陈海水1L，pH调至7.5。

④试验组4发酵培养基：酵母提取物5g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠0.5g，陈海水1L，pH调至7.5。

⑤试验组5发酵培养基：酵母提取物5g，蛋白胨7g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠0.5g，陈海水1L，pH调至7.5。

(3)将各组的培养液通过离心(4000rpm，20min)得到发酵上清液，按照实施例二中的毒素提取方法进行提取和纯化，并计算不同培养基生产的菌体的生物量以及得到毒素的产量。

2、实验结果及分析

表3.各试验组的毒素检测结果

由表3的结果可知，试验组1～3得到的毒素产量差异不大，都在19～19.4μg/L的范围内，因此，本发明的产虾夷扇贝毒素的海杆菌ZZD-4的发酵培养基的优选配方范围为：酵母提取物4～6g/L，蛋白胨5～7g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.5g/L。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛普瑞邦生物工程有限公司

<120> 一种产虾夷扇贝毒素的海杆菌及虾夷扇贝毒素的制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1029

<212> DNA

<213> 海杆菌ZZD-4的16S rDNA(16S rDNA of Marinobacter sp. ZZD-4)

<400> 1

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