一种草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022及其应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种草地贪夜蛾微孢子虫CT‑WB2022及其应用。本发明所述草地贪夜蛾微孢子虫CT‑WB2022。本发明在河北省行唐县玉米田间采集到草地贪夜蛾幼虫，经室内饲养2代，在生长出现异常状态的幼虫体内分离到一种草地贪夜蛾微孢子虫CT‑WB2022，已进行生物保藏，保藏编号CGMCCNo.24464。本发明所述草地贪夜蛾微孢子虫CT‑WB2022对草地贪夜蛾幼虫有较强的致病作用，可应用于草地贪夜蛾的生物防治。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022及其应用。

背景技术

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)属鳞翅目夜蛾科，原产于美洲的热带和亚热带地区，具有取食量大，繁殖能力强，危害范围广，扩散迁飞速度快，突发为害重等特点，是农作物上的重要害虫。

草地贪夜蛾的防治方法主要以化学防治为主，如用有机磷类化学药剂喷雾、等，但化学农药易产生残留，与保护环境的理念相违背，并且容易增加草地贪夜蛾对化学农药的抗性。生物防治由于具有对人畜健康无害，无环境污染，不产生抗药性，能有效抑制或消灭靶标生物等优点，已成为防治有害生物的重要手段。寻找能控制草地贪夜蛾种群数量的微生物，是减轻其危害的有效途径。

微孢子虫是(Microsporidia)是一类专性胞内寄生的单细胞真核生物，在寄主种群内具有水平和垂直两种传播方式，是许多昆虫种群数量控制的重要生物因素。作为一种生物防治资源，已有蝗虫微孢子虫在美国环境保护署注册，并且在防治蝗虫上作为生防产品大量生产应用的实例。此外，微孢子虫也对家蚕，柞蚕，粉纹夜蛾，玉米螟，甜菜夜蛾等多种鳞翅目昆虫具有致病力。伴随新宿主的出现，越来越多微孢子虫被发现。目前对草地贪夜蛾的生物防治资源主要有多角体病毒，寄生蜂，白僵菌，绿僵菌，Bt等，未有微孢子虫对草地贪夜蛾有致病力的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022及其应用，防治草地贪夜蛾，丰富生物防治资源。

本发明提供了一种草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022，保藏编号为CGMCC No.24464。

本发明还提供了一种杀虫剂，包括所述的草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022。

优选的，所述杀虫剂的剂型包括悬浮液。

优选的，所述悬浮液中草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022的孢子浓度为6.25×10

本发明还提供了所述杀虫剂的制备方法，包括如下步骤：

利用上述技术方案所述的草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022感染草地贪夜蛾幼虫，研磨得草地贪夜蛾匀浆后过滤，得草地贪夜蛾组织液；所述草地贪夜蛾组织液中含有所述杀虫剂。

优选的，所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022感染草地贪夜蛾幼虫的方式包括：将所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022的悬浮液喷于叶片饲喂或者拌于饲料饲喂草地贪夜蛾幼虫；所述悬浮液中草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022的孢子数为1.0×10

优选的，还包括：分离所述草地贪夜蛾组织液，得杀虫剂；所述分离包括差速离心和密度梯度离心。

本发明还提供了上述技术方案所述微孢子虫或杀虫剂在植物害虫防治中的应用。

优选的，所述植物包括玉米。

优选的，所述害虫包括草地贪夜蛾。

本发明提供了一种草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022，保藏编号CGMCC No.24464。本发明在河北省行唐县玉米田间采集到草地贪夜蛾幼虫，经室内饲养2代，在生长出现异常状态的幼虫体内分离到一种草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022，该微孢子虫对草地贪夜蛾幼虫有较强的致病作用。实施例结果表明，本发明草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022，对草地贪夜蛾1龄、2龄、3龄和4龄幼虫均具有较高杀虫活性，对1龄和2龄草地贪幼虫5天的LC

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022形态图；

图2为草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022系统发育树；

图3为初龄草地贪夜蛾幼虫感染草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022死亡症状图；

图4为其他龄期草地贪夜蛾感染草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022死亡症状图；

图51～4龄草地贪夜蛾幼虫感染不同浓度草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022死亡率结果；

图6为实施例3不同处理方式下玉米生长情况。

生物保藏信息

草地贪夜蛾微孢子虫(Microsporidia)CT-WB2022，于2022年03月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24464。

具体实施方式

本发明提供了一种草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022，保藏编号CGMCC No.24464。

本发明在河北省行唐县玉米田间采集到草地贪夜蛾幼虫，经室内饲养2代，在生长出现异常状态的幼虫体内分离到所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022。所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022的ITS基因序列优选如SEQ ID NO.1所示：5’-CGTTCCCAAGTGGTCTCCCTTCTTAGTACTGATTAAGCTCATACTGGTTTAACTTCGGAGTTCTGATGGGTTCCGGTGGGTTTCAGTAGATATGACCGTATCTGTTGAAATAAGTGTGTTGTTACAAGTATACCTACTTGATTTTATGAACATAAAAACTTCCCAAAACCACTTAGATTACATCTCTAAATATTAATTCTCTACACCTAGCCACACACACCTTTATAATCAATCAACTCATTTACCACATACATAAATTTAGCTAATAAACTTCCTTATATCACTCATTCTAAACCTCGTGAAGGTATTTTATATTTAGAACATAGACAAGATCATTATAATGTCAGCATACACTTTCATTATAATAATCCCATCTTTTTTTATTTATGATCCTGCTAATGGTTCTCCAACAGCAACCATGTTACGACTTATATCAGATCTAGTACTATCTATTCACTTTATAAATTTGTTCATAGATAATACCATCTTAGATAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGAACAGGGACTCATTCAATTCTACTTATTAAATAAAATTTACTAGCAATTCCATGTTCAAATATATCTTACATTATATTATCCCTTATAATATCAAATATTATTGTATTGCGCGTGCAACCCAGATTATCTTAGGGCATAACGGACCTGTTTT-3’。本发明所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022形状为卵圆形，表面光滑且折光性较强，成熟孢子大小为(3.20±0.24)μm×(1.79±0.18)μm。草地贪夜蛾低龄幼虫很容易被本发明所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022感染，幼虫死亡后腹部末端微微勾起，且有些幼虫腹部有发黑现象，身体柔软；大龄幼虫被本发明所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022感染后腹部肿胀，膨大，不能完成蜕皮或蜕皮不完全，尾部有病变，不能化蛹等；幼虫化蛹后，蛹宽度大，包被不完全，露白，蛹弯曲，发黑，畸形等，且有些幼虫化蛹后不能羽化；蛹羽化后的成虫不能完全脱离蛹壳，翅畸形等。通过形态以及ITS序列比对分析，构建系统发育树，证明该微孢子虫属于微孢子纲，微孢子虫目，微粒子科，微粒子属，且与家蚕微孢子虫具有较近的亲缘关系，相似性达到90％以上。

本发明实施例中，所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022对草地贪夜蛾幼虫有较强的致病作用。对1龄和2龄草地贪幼虫5天的LC

根据本发明所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022的生理生化特性，所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022在植物害虫防治中的应用也应在本发明保护范围之内。本发明所述植物优选包括玉米；所述害虫优选包括草地贪夜蛾。

本发明还提供了一种杀虫剂，包括所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022。本发明所述杀虫剂的剂型优选包括悬浮液；所述悬浮液中草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022的孢子浓度优选为6.25×10

本发明还提供了所述杀虫剂的制备方法，包括如下步骤：

利用所述的草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022感染草地贪夜蛾幼虫，研磨得草地贪夜蛾匀浆后过滤，得草地贪夜蛾组织液，分离后得所述杀虫剂。

在本发明中，所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022感染草地贪夜蛾幼虫的方式优选包括：将所述草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022的悬浮液喷于叶片饲喂或者拌于饲料饲喂草地贪夜蛾幼虫；所述悬浮液中草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022的孢子数为1.0×10

在本发明中，所述研磨优选使用研钵。本发明对研磨的力度和时间没有严格要求，保证研磨液均匀一致，没有大的颗粒物即可。本发明研磨得草地贪夜蛾匀浆后，对草地贪夜蛾匀浆进行过滤。本发明所述过滤优选使用四层纱布，收集滤液，得草地贪夜蛾组织液。

本发明分离草地贪夜蛾组织液，得到所述杀虫剂。本发明所述的分离方式优选包括依次进行的差速离心和密度梯度离心。本发明所述差速离心的方式优选为：以500r/min的转速离心2min后，取上清，再以2500r/min的转速离心10min，弃上清，弃上清后加入灭菌水重悬微孢子虫，重复离心取上清-离心弃上清-加入灭菌水重悬的步骤3～4次，得到粗提液；

得到粗提液后，本发明优选对粗提液进行密度梯度离心，得到杀虫剂母液。本发明所述密度梯度离心优选包括Percoll不连续密度梯度离心法。本发明得到杀虫剂母液后，优选用血球计数板计算微孢子虫的数量，根据需要进行稀释处理，得需要浓度的杀虫剂。

本发明用从草地贪夜蛾体内分离得到的微孢子虫回接侵染草地贪夜蛾，制备得到杀虫剂，对1～4龄草地贪夜蛾幼虫有较强致病力，并且随着杀虫剂中微孢子虫孢子浓度的增加，对幼虫致病力逐渐升高，丰富了防治草地贪夜蛾的生物防治资源。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.1微孢子虫的分离纯化

2021年8月，在河北省行唐县玉米田间采集到草地贪夜蛾幼虫，经室内饲养2代，参考姜义仁等(姜义仁,邓真华,王伯阳等.柞蚕微孢子虫孢子分离纯化方法[J].应用昆虫学报,2011,48(2):5.)方法将生长出现异常状态的草地贪夜蛾幼虫置于研钵内研磨成匀浆，用四层纱布过滤，收集滤液至50mL离心管内，滤液采用差速离心的方法(以500r/min的转速离心2min后，取上清，再以2500r/min的转速离心10min，弃上清，弃上清后加入灭菌水重悬微孢子虫，重复离心取上清-离心弃上清-加入灭菌水重悬的步骤3～4次)进行粗分离，粗提液用Percoll密度梯度离心法纯化，得到含有寄生虫的孢子液。

1.2寄生虫的鉴定

1.2.1形态学鉴定

将步骤1.1分离纯化得到的寄生虫命名为CT-WB2022，稀释分离液至适当倍数后在400倍光学显微镜下观察，拍照，观察形态结构，结果如图1所示。根据图1可以看出，在光学显微镜下，该寄生虫形状为卵圆形，表面光滑且折光性较强，成熟孢子大小为(3.20±0.24)μm×(1.79±0.18)μm。

将寄生虫CT-WB2022与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)进行形态对比，结果如下表1。

表1寄生虫CT-WB2022与家蚕微孢子虫形态对比结果

根据表1记载的内容可以看出，步骤1.1分离纯化得到的寄生虫与家蚕微孢子虫形状相似，均为卵圆形，但是步骤1.1分离纯化得到的寄生虫个体较小。

1.2.2分子生物学鉴定

取500μL步骤1.1分离纯化得到的孢子液于1.5mL离心管内，6000r离心5min，去上清，沉淀用500μL裂解液重悬，吸打混匀2～3min，然后65℃保温2h；加Proteinease K(20mg/mL)约25μL，手摇20～30s，50℃保温4h；然后按照CTAB DNA提取试剂盒提取微孢子虫DNA，置于-20℃保存。

采用微孢子虫的通用引物F3772(SEQ ID NO.2：5’-AAAACAGGTCCGTTATGC-3’)和R4433(SEQ ID NO.3：5’-CGTTCCCAAGTGGTCTCC-3’)，PCR扩增微孢子虫ITS基因，程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环，72℃延伸10min，扩增得到的ITS基因序列如SEQ ID NO.1所示。以DL2000 DNA Marker为分子量标准，PCR反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离回收纯化，与pMD 19-T载体连接并转化感受态细胞，选取阳性克隆质粒，菌液进行鉴定，进行DNA测序，并从NCBI GenBank中收集的相关微孢子虫ITS基因序列(登录号为JN882299.1、JF443682.1、JF443715.1、JF443668.1、MF150282.1、JF443684.1、JF443716.1、MF150285.1、JF443672.1、JF443706.1、EU350379.1和FJ772435.1)进行同源性Blast比对，发现该微孢子虫的序列与已报道的家蚕微孢子虫对应序列的相似性达到90％以上，鉴定该微孢子虫属于微孢子虫属。选取同源序列，使用MEGA7.0将其在NCBI数据库中比对得到的序列下载构建系统发育树，结果如图2所示。本发明分离纯化得到的寄生虫CT-WB2022属于微孢子虫属，与家蚕微孢子虫为近似种。

实施例2

实施例1得到的草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022对草地贪夜蛾的致病力研究

1供试材料

1.1供试昆虫：

草地贪夜蛾来源于河北省农林科学院植物保护研究所玉米综防实验室。

1.2供试微孢子虫：

采用饲喂法，用1.0×10

利用灭菌水将分离纯化的微孢子虫悬浮液配置成不同的孢子浓度的微孢子虫悬浮液(1.0×10

2.结果分析

2.1感染微孢子虫的草地贪夜蛾症状如图3和图4所示，其中图3为感染微孢子虫的草地贪夜蛾的初孵幼虫，图4为感染微孢子虫的草地贪夜蛾的大龄幼虫。根据图3和图4可以看出，草地贪夜蛾低龄幼虫很容易被微孢子虫感染，幼虫死亡后腹部末端微微勾起，且有些幼虫腹部有发黑现象，身体柔软；草地贪夜蛾大龄幼虫被微孢子虫感染后腹部肿胀，膨大，不能完成蜕皮或蜕皮不完全，尾部有病变，不能化蛹等；幼虫化蛹后，蛹宽度大，包被不完全，露白，蛹弯曲，发黑，畸形等，且有些幼虫化蛹后不能羽化；蛹羽化后的成虫不能完全脱离蛹壳，翅畸形等。

2.2用上述5个浓度微孢子虫悬浮液处理草地贪夜蛾1～4龄幼虫后，草地贪夜蛾幼虫死亡率结果如图5所示。根据图5看可以看出，以1.0×10

2.3计算不同微孢子虫悬浮液(6.25×10

表2微孢子虫对草地贪夜蛾各个龄期幼虫的致死中时间

表3微孢子虫对草地贪夜蛾致病力回归方程

注：LC

根据表2和表3可以看出；随微孢子虫悬浮液浓度的增加，草地贪夜蛾幼虫的致死中时(LT

1龄和2龄幼虫的致死中浓度最低，分别为2.51×10

实施例3

(1)使用无菌水将实施例1得到的草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022悬浮液稀释至1×10

(2)在草地贪夜蛾重发地区玉米田设置田间小区试验，将田间小区分为2个处理区和一个对照区，一个处理区喷施步骤(1)草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022悬浮剂喷雾(处理1)，另外一个处理区喷施化学农药20％氯虫苯甲酰胺悬浮剂2000倍液喷雾(处理2)；对照区为空白对照，不喷施任何试剂(处理3)。每个处理进行3次重复，每个重复小区面积100m

表4 CT-WB2022制剂田间应用效果

根据表4和图6可以看出，采用CT-WB2022悬浮液和化学药剂氯虫苯甲酰胺的喷雾处理，玉米生长良好，草地贪夜蛾虫口减退率分别为67.18％和69.50％，防治效果分别为78.30％和79.82％，CT-WB2022与氯虫苯甲酰胺喷雾对草地贪夜蛾的防治效果较好且差异不显著。

本发明草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022能够延长草地贪夜蛾幼虫发育和阻碍生长，对草地贪夜蛾幼虫有较强的致病作用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 一种草地贪夜蛾微孢子虫CT-WB2022及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgttcccaag tggtctccct tcttagtact gattaagctc atactggttt aacttcggag 60

ttctgatggg ttccggtggg tttcagtaga tatgaccgta tctgttgaaa taagtgtgtt 120

gttacaagta tacctacttg attttatgaa cataaaaact tcccaaaacc acttagatta 180

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tttaccacat acataaattt agctaataaa cttccttata tcactcattc taaacctcgt 300

gaaggtattt tatatttaga acatagacaa gatcattata atgtcagcat acactttcat 360

tataataatc ccatcttttt ttatttatga tcctgctaat ggttctccaa cagcaaccat 420

gttacgactt atatcagatc tagtactatc tattcacttt ataaatttgt tcatagataa 480

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<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaacaggtc cgttatgc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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