CpG ODN在促进凡纳滨对虾对虾生长和改善肠道菌群中的应用

摘要

本发明属于水产饲料应用技术领域，公开了CpG ODN在促进凡纳滨对虾对虾生长和改善肠道菌群中的应用。本发明以凡纳滨对虾为研究对象，在饲料中分别添加浓度为0.1mg/kg、0.4mg/kg、1.6mg/kg、6.4mg/kg、25.6mg/kg的CpG ODN(分别记为C0.1、C0.4、C1.6、C6.4、C25.6)，通过8周的养殖实验，比较不同水平的CpG ODN对凡纳滨对虾生长性能、肠道消化酶活性和肠道菌群组成的变化来探究CpG ODN对凡纳滨对虾生长，消化和免疫的调控作用。证实CpG ODN显著改善凡纳滨对虾生长、消化和肠胃微生物菌群结构，从而提升其免疫力，抗病能力。

说明书

技术领域

本发明属于水产饲料应用技术领域，更具体地，涉及CpG ODN在促进凡纳滨对虾对虾生长和改善肠道菌群中的应用。

背景技术

早期水产养殖过程中，养殖户通常使用化学药物和抗生素来应对病害的发生。虽然抗生素会起到一定的作用，但不规范和大规模的使用导致细菌对抗生素产生耐药性，从而使多种常规抗生素失效，不仅不利于病害的预防和治疗，甚至造成了因药物残留带来食品安全问题、破坏水体微生物环境平衡、水体恶化加速、病原耐药性增强，药效降低，对对虾产生二次污染等问题，最终影响高等动物和人类的健康。

凡纳滨对虾因其具有高蛋白、低脂肪的优良特点，成为全球最重要的海水养殖品种之一，是水产品国际贸易中最活跃和主要的品种，具有重要的经济价值。但是由于对虾产业的迅猛发展，养殖过程中出现了养殖管理水平低、养殖密度过高、病害侵扰、环境污染以及抗生素的滥用等一些问题，导致对虾产业损失惨重。对虾疾病的爆发不是由单一因素引起的，而是养殖环境的破坏和对虾抗病性减弱的综合作用的结果。因此，提高对虾的免疫力和抗病性是养殖过程中疾病预防和控制的基本措施之一。

因此，开发能够代替抗生素、无毒、无污染和高效安全的生物制剂，生产健康、绿色的产品是对虾养殖业乃至整个水产行业当前和未来发展的方向，对于凡纳滨对虾产业的健康发展具有重大意义。

免疫增强剂是一类可以通过促进或诱导机体免疫系统的防御反应，从而增强机体自身非特异性免疫，提高机体对抗原微生物或病原体抵抗能力的物质。由于其安全性、无毒、高效、低成本、无环境污染等特点，免疫增强剂已成为国内外水产养殖疾病防治领域的研究重点。在仅具有非特异性免疫系统的虾类动物中，对非特异性免疫增强剂的研究更为重要。目前为止，免疫增强剂的种类繁多，在人，畜禽和水产中广泛应用。未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)-寡脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotide；即CpG ODN)是富含未甲基化GC的寡聚脱氧核苷酸，在真核生物中含量很少，广泛存在于细菌或病毒DNA中。CpG ODN作为一种免疫增强剂，安全性高，其免疫功能在对虾饲料的应用将越来越受到关注。但在凡纳滨对虾饲料中，CpG ODN的最适添加量，抗病免疫影响及其作用机制还有待进一步研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供CpGODN在提高凡纳滨对虾肠道消化能力中的应用。

本发明的第二个目的是提供CpG ODN在调节凡纳滨对虾肠道微生物肠道菌群中的应用。

本发明的第三个目的是提供饲料A在改善凡纳滨对虾生长、消化和肠胃微生物菌群结构中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供CpG ODN在提高凡纳滨对虾肠道消化能力中的应用。

本发明通过实验随着饲料中CpG ODN浓度的增加，肠道的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均呈现出先升高后降低的变化趋势(P<0.05)。因此，适量的CpG ODN可以提高凡纳滨对虾肠道的消化能力。

本发明还提供CpG ODN在调节凡纳滨对虾肠道微生物肠道菌群中的应用。

本发明实验发现饲喂不同水平的CpG ODN能够调节凡纳滨对虾肠道中的微生物菌群。另外，也发现，饲料中添加不同浓度的CpG ODN对凡纳滨对虾肠道的微生物多样性无显著影响；但是，通过研究肠道微生物菌群的丰度，发现，在门水平，凡纳滨对虾的肠道微生物群落丰富度排名前五位的是变形细菌门，拟杆菌门，扁平门，疣微菌门和酸杆菌门。发现变形细菌门，拟杆菌门是优势菌门，但与对照组(C0)相比其余各组的拟杆菌门相对丰度均减少，而变形菌门则增加。在属水平上，凡纳滨对虾的肠道微生物群落丰富度最高的前5位是弧菌属(Vibrio)、Tenacibaculum菌属、Ruegeria菌属、Hoppeia菌属和Halieaceae菌属。发现弧菌属、Hoppeia菌属和Tenacibaculum菌属是主要属，但实验组的Hoppeia比对照组减少，而实验组的弧菌则比对照组增加。许多研究表明，弧菌作为水生动物中一种常见的菌群，已被确定为虾胃肠道的主要成员。本研究中饲喂CpG ODN后，凡纳滨对虾肠道中弧菌属较对照组相对丰度均有所上升。考虑到是CpG ODN持续刺激引起抗细菌病能力减弱。

因此，优选的，上述应用中，所述CpG ODN提高了肠胃微生物菌群中变形菌门的量，降低了肠道微生物菌群中的拟杆菌门的量。

另外，Ruegeria，一种革兰氏阴性菌属，被广泛认为是降解甘油三酯的益生菌。在本研究中，添加CpG ODN组中作为一种益生菌的Ruegeria的丰度较对照组增加。以上结果表明，添加CpG ODN的日粮可以通过增加潜在益生菌的含量来调节肠道菌群的组成，从而对虾产生有益的作用。因此，优选的，上述应用中，所述CpG ODN提高了肠胃微生物菌群中的Ruegeria的丰度。

本发明还提供饲料A在改善凡纳滨对虾生长、消化和肠胃微生物菌群结构中的应用，所述饲料A由0.001％～0.002％的CpG ODN、99.999％～99.998％的基础饲料组成。

优选的，所述饲料A由0.0016％的CpG ODN、99.9984％的基础饲料组成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以凡纳滨对虾为研究对象，在饲料中分别添加浓度为0.1mg/kg、0.4mg/kg、1.6mg/kg、6.4mg/kg、25.6mg/kg的CpG ODN(分别记为C0.1、C0.4、C1.6、C6.4、C25.6)，通过8周的养殖实验，比较不同水平的CpG ODN对凡纳滨对虾生长性能、肠道消化酶活性和肠道菌群组成的变化来探究CpG ODN对凡纳滨对虾生长，消化和免疫的调控作用。证实CpG ODN显著改善凡纳滨对虾生长、消化和肠胃微生物菌群结构，从而提升其免疫力，抗病能力。

附图说明

图1为添加CpG ODN对凡纳滨对虾肠道消化酶活性的影响；

图2为不同水平CpG ODN对虾肠道菌群OUT的韦恩图比较；

图3为不同浓度CpG ODN对对虾肠道菌群在门(图3A)和属(图3B)水平上的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备。

下述实施例中所用的凡纳滨对虾基础饲料组成和配比如下：

表1基础饲料的配方及营养组成

实施例1

饲养8周后凡纳滨对虾生长性能如表2所示，表2中，C0、C0.1、C0.4、C1.6、C6.4、C25.6分别代表饲料中CpG ODN添加量为0mg/kg、0.1mg/kg、0.4mg/kg、1.6mg/kg、6.4mg/kg、25.6mg/kg组别；表2结果显示：饲喂添加不同水平CpG ODN的饲料对凡纳滨对虾的末均重、存活率、增重率、特定生长率和饲料系数均无显著影响(P>0.05)。

当CpG ODN添加量≥1.6mg/kg时，饲料系数均低于对照组(P>0.05)。

表2添加不同水平CpG ODN对凡纳滨对虾生长性能的影响

如图1所示，饲喂添加不同水平CpG ODN的饲料可以不同程度调节凡纳滨对虾的肠道消化酶活性。其中C0和C0.1组凡纳滨对虾肠道胰蛋白酶和淀粉酶活性均显著低于其他各组(P<0.05)。C1.6和C6.4组的肠道脂肪酶活性显著高于其余各组(P<0.05)。随着饲料中CpGODN浓度的增加，肠道的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均呈现出先升高后降低的变化趋势(P<0.05)。因此，适量的CpG ODN可以提高凡纳滨对虾肠道的消化能力。

如图2所示，养殖8周后，饲喂不同水平CpG ODN的凡纳滨对虾肠道出现不同数量和种类的微生物种群。由此可知，饲料中添加CpG ODN能够调节凡纳滨对虾肠道中的微生物菌群。

表3列出了6组(C0、C0.1、C0.4、C1.6、C6.4、C25.6)中所有样品的观察物种(Sobs)，Chao1，基于丰度的覆盖估计(ACE)和Shannon指数，以评估6组凡纳滨对虾肠道菌群的α多样性。其中C0.4组的Sobs和Chao1指数最大，高于其余各组，差异不显著(P>0.05)。C6.4组Shannon和ACE指数最大，均高于其余各组，差异不显著(P>0.05)。

结果表明：CpG ODN肠道菌群α多样性指数各组间均无显著性差异。

表3添加CpG ODN对凡纳滨对虾肠道菌群α多样性指数的影响

如图3所示，在门水平，凡纳滨对虾的肠道微生物群落丰富度排名前五位的是变形细菌门，拟杆菌门，扁平门，疣微菌门和酸杆菌门(图3A)。发现变形细菌门，拟杆菌门是优势菌门，但与对照组(C0)相比其余各组的拟杆菌门相对丰度均减少，而变形菌门则增加。在属水平上，凡纳滨对虾的肠道微生物群落丰富度最高的前5位是弧菌属(Vibrio)、Tenacibaculum菌属、Ruegeria菌属、Hoppeia菌属和Halieaceae菌属(图3B)。发现弧菌属、Hoppeia菌属和Tenacibaculum菌属是主要属，但实验组的Hoppeia比对照组减少，而实验组的弧菌则比对照组增加。许多研究表明，弧菌作为水生动物中一种常见的菌群，已被确定为虾胃肠道的主要成员。本研究中饲喂CpG ODN后，凡纳滨对虾肠道中弧菌属较对照组相对丰度均有所上升。考虑到是CpG ODN持续刺激引起抗细菌病能力减弱。Ruegeria，一种革兰氏阴性菌属，被广泛认为是降解甘油三酯的益生菌。在本研究中，添加CpG ODN组中作为一种益生菌的Ruegeria的丰度较对照组增加。以上结果表明，添加CpG ODN的日粮可以通过增加潜在益生菌的含量来调节肠道菌群的组成，从而对虾产生有益的作用。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。