菴闾中总香豆素及制备方法和其药物用途

摘要

本发明涉及一种菴闾中总香豆素及制备方法和其药物用途，属于中药有效成分制备和天然药物化学领域。将菴闾切片风干后，加入粉碎机粉碎，过20～40目筛，称取粉末，加入到超临界CO2萃取装置中进行萃取。本发明的优点是首次从菴闾中提取并富集具有抗炎作用的有效部位：总香豆素；该提取物制备方法简单，绿色环保，适合工业化生产；该提取物具有显著减轻骨关节病动物炎症反应、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨细胞增殖、并明显减轻关节软病理损伤的药理作用，可用于制备具有抗骨关节炎作用的各种药物或保健食品。

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效成分制备和天然药物化学领域，具体涉及菴闾总香豆素类提取物及制备方法和医药用途。

背景技术

骨关节炎(OA)是一种与遗传、创伤、代谢、应力改变、炎症等多因素相关的关节退行性疾病，好发于中老年人，以关节软骨退变、骨质增生为病理特征，临床表现为关节疼痛、肿胀、僵硬、活动受限等，最终可致关节功能障碍和残疾。随着人口老龄化和肥胖患病率的增加，髋和膝关节OA成为全球第11大致残原因，造成沉重的经济及社会负担。目前OA的治疗仅限于对症，尚缺延缓病情进展的药物，其病理机制及治疗靶点、药物亟待研究。

菴闾(Artemisia KeiskeanaMiq.)菊科植物菴闾的全草，分布于我国黑龙江省、辽宁省、吉林省、河北省等地。始载于《神农本草经》，列为上品。味辛、苦，性温。具有行淤祛湿之功效。菴闾主治妇女血瘀经闭，跌打损伤，风湿痹痛。现代研究发现菴闾还具有抗肿瘤、抗炎、抗肥胖等功效。研究表明，菴闾甲醇提取物可以使脂多糖刺激的RAW264.7细胞NO释放量降低，而香豆素类化合物是其中的主要成分。

香豆素类化合物是指邻羟基桂皮酸内酯类成分的总称。其广泛分布于高等植物的根、茎、叶、花等各部位，具有抗HIV，抗癌，抗菌，抗炎等生物活性。目前香豆素提取工艺已经日渐成熟，使用超临界CO

至今为止，国内外尚未见有菴闾中的香豆素类化合物应用于防止骨关节炎的相关研究报道。

发明内容

本发明提供一种菴闾中总香豆素及制备方法和其药物用途。

本发明采取的技术方案是：是由下列步骤得到的：

将菴闾切片风干后，加入粉碎机粉碎，过20～40目筛，称取粉末，加入到超临界CO

本发明所述萃取条件为：萃取釜压力为15-35MPa。

本发明所述萃取条件为：釜温度为30-60℃。

本发明所述萃取条件为：CO

本发明所述萃取条件为：时间为1-4小时。

本发明所述的总香豆素中香豆素含量>50％。

本发明菴闾中总香豆素在制备抗骨关节炎的药物中的用途。

本发明用于制备抗骨关节炎药物时，其口服或非口服给药均是安全的。在口服情况下,其可以是任何常规形式给药,如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、漂浮剂、口服液、悬浮液、糖浆、口腔含片、喷雾剂或气雾剂等当该药物非口服给药时,可采用任何常规形式,如栓剂、注射剂静脉注射、肌肉注射、软膏剂、吸入剂等。

本发明制备抗骨关节炎药物时，是与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体赋形剂在本领域是众所周知的,下面举几个具体例子,固体制剂的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氯化镁、硬脂酸镁,碳酸氢钠、干燥酵母等液体制剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等软膏剂的赋形剂可以使用脂油,含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木腊、液体石蜡、树脂、高级蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。

本发明的优点是首次从菴闾中提取并富集具有抗炎作用的有效部位：总香豆素；该提取物制备方法简单，绿色环保，适合工业化生产；该提取物具有显著减轻骨关节病动物炎症反应、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨细胞增殖、并明显减轻关节软病理损伤的药理作用，可用于制备具有抗骨关节炎作用的各种药物或保健食品。

具体实施方式

实施例1

将菴闾干燥，加入粉碎机中粉碎，过20目筛，称取粉末200g加入到超临界CO

实施例2

菴闾香豆素类化合物的提取：将菴闾干燥，加入粉碎机中粉碎，过30目筛，称取粉末200g加入到超临界CO

实施例3

菴闾香豆素类化合物的提取：将菴闾干燥，加入粉碎机中粉碎，过40目筛，称取粉末200g加入到超临界CO

实施例4

菴闾香豆素类化合物的提取：将菴闾干燥，加入粉碎机中粉碎，过30目筛，称取粉末200g加入到超临界CO

实施例5

菴闾香豆素类化合物的提取：将菴闾干燥，加入粉碎机中粉碎，过30目筛，称取粉末200g加入到超临界CO

下边通过实验例来进一步说明本发明。

实验例1

1.对照品溶液的配置：精密称取莨菪亭对照品1.0mg，甲醇溶解并定容于10ml的容量瓶中，摇匀，即得浓度为0.1mg/ml的对照品溶液。

2.标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，分别定容于10ml容量瓶中，得浓度分别为0.002mg/ml、0.003mg/ml、0.004mg/ml、0.005mg/ml、0.006mg/ml的莨菪亭对照品溶液，在341nm波长处测定吸光度，以莨菪亭对照品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝115.5x+0.026，R

3.供试品溶液的制备：取实施例5中提取物5.0mg，加甲醇溶解定容至10ml量瓶中，摇匀。精密吸取0.1ml，加甲醇溶解定容至10ml量瓶中，即得浓度为0.005mg/ml的供试品溶液。

4.含量测定：取供试品溶液在341nm波长处测定吸光度，按标准曲线法计算样品中香豆素成分含量。经测定，供试品溶液吸光度值为0.334，即浓度为0.00267mg/ml，所得菴闾的香豆素类提取物中香豆素类成分含量为53.4％。

实验例2菴闾总香豆素提取物对大鼠骨关节炎模型的炎症抑制作用

方法：体外采用LPS诱导建立关节软骨细胞损伤模型，以不同浓度的菴闾总香豆素提取物进行干预。通过染色法检测软骨细胞增殖、形态，ELISA法检测iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性因子的水平。

体内研究采用手术离断大鼠前交叉韧带法以建立骨关节炎模型，隔日关节腔内注射菴闾总香豆素提取物，连续给药30天，HE及番红固绿染色检测病理损伤情况。

结果：菴闾总香豆素提取物可以显著促进软骨细胞的增殖，120μmol/L浓度时增殖作用最明显(p<0.01)；与模型组比较，软骨细胞活力明显增加(p<0.05)，IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS等炎性因子的水平显著降低(均p<0.01)；病理检查结果显示，与模型组相比，菴闾总香豆素提取物组关节软病理损伤程度明显减轻。

结论：菴闾总香豆素提取物可抑制LPS所致的炎症因子的表达和释放，减轻软骨细胞外基质降解，缓解骨关节炎的进展。

实验例3菴闾总香豆素提取物对胶原诱导关节炎模型大鼠的影响

方法：将雌性大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组及菴闾总香豆素提取物高、中、低剂量组，每组12只。除正常照组外，其余各组均构建CIA模型：将牛Ⅱ型胶原溶于0.1mol/L醋酸中，配成2mg/mL胶原溶液。次日与等体积弗氏完全佐剂(CFA)冰浴中充分乳化，以配制浓度为1mg/mL胶原乳剂。正常组外，其余各组大鼠皮内多点注射胶原乳剂0.4mL，1周后再同法给予胶原乳剂0.2mL，复制CIA大鼠模型，并第7天开始灌胃给予3个剂量的菴闾总香豆素提取物，给药持续4周，给药结束后，静脉取血，处死大鼠后分离关节滑膜，采用ELISA法检测血清IL-12、HIF-1α、IL-10的含量。

关节炎症指数评分：根据5级评分法评价大鼠关节受累程度。每只大鼠关节炎指数(Arthritis index,AI)为四肢关节得分之和。标准如下：无关节红肿，0分；小趾关节稍肿，1分；趾关节和足跖肿胀，2分；踝关节以下的足爪肿胀，3分；包括踝关节在内的全部足爪肿胀，4分。

关节滑膜组织病理形态观察：取右后膝关节及滑膜组织长约2cm存放10％的中性福尔马林中固定，脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋,石蜡切片、染色。光镜下观察关节滑膜增生及破坏等情况。

结果：指数评分：与正常组比较，模型组关节炎症指数均显著升高(p<0.05),与模型组比较，总香豆素提取物各给药组在给药第28天时关节炎症指数评分显著降低(p<0.05)。

总香豆素提取物对胶原诱导关节炎模型大鼠关节滑膜组织病理学的影响：结果显示，正常滑膜组织无炎细胞浸润，滑膜细胞排列整齐。关节炎模型大鼠滑膜组织可见滑膜细胞增生，淋巴细胞成弥漫性浸润，并可见肉芽肿改变。总香豆素提取物高剂量组和阳性对照组均可见滑膜轻度增生,炎性细胞浸润较少，与模型组比较，炎性浸润、增生、血管新生组织均被抑制。

菴闾总香豆素提取物对胶原诱导关节炎模型大鼠血清IL-12、IL-10含量的影响：与正常大鼠比较，模型组大鼠血清IL-12水平显著升高，IL-10水平显著降低(p<0.05)，说明模型成立。与模型组比较，总香豆素提取物各给药组的血清IL-12水平显著降低(p<0.01)，IL-10水平显著升高(p<0.01)。

结论：综上，菴闾总香豆素提取物可抑制RA病情的进展，缓解关节肿胀，降低炎症反应，防止骨破坏。

实验例4菴闾总香豆素提取物对类风湿关节炎模型大鼠的疗效

方法：建立大鼠类风湿关节炎模型，治疗组大鼠每周灌胃给予菴闾总香豆素提取物200mg/kg，每天给药2次，连续给药6周。苏木精-伊红(HE)染色和甲苯胺蓝染色检测类风湿关节炎的病理改变程度；ELISA检测组织中TNF-α，IL-1β和IL-17水平；Western blot检测RANKL和OPG蛋白表达。

结果：菴闾总香豆素提取物给药组大鼠关节炎评分和足趾容积明显低于模型组大鼠(p<0.05)。与模型组比较，总香豆素提取物给药组RANKL蛋白含量显著降低，OPG蛋白含量明显上升(p<0.05)；TNF-α、IL-1β和IL-17含量明显下降(p<0.05)。

结论：菴闾总香豆素提取物可通过抑制细胞因子表达，降低ACCP、RF水平，发挥治疗大鼠类风湿关节炎的疗效。