一种PHA合酶N端缺失突变体构建方法及应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种PHA合酶N端缺失突变体构建的方法。通过设计引物对嗜水气单胞菌PHA合酶进行克隆，然后构建N端第2到28位氨基酸的缺失突变的重组质粒的方法。经酶切测序确认表达载体构建成功后转化到富养产碱菌(Ralstonia eutropha)突变株PHB‑4中选择不同碳源摇瓶发酵验证PHA合酶功能活性，然后与野生型嗜水气单胞菌比较。通过本发明的方法，发现了N端突变的合酶基因具有产生PHA的功能，且PHA产量要高于野生菌，提高了PHA产量。这对今后利用基因工程技术构建产新型PHA的嵌合酶提供了理论基础在促进PHA更广泛的应用方面有一定价值。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种PHA合酶N端缺失突变体构建的方法。

技术背景

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate)是一种由许多细菌在营养不平衡条件下合成的胞内能量和碳源贮藏性的物质。PHA有着良好的生物相容性、生物可降解性、憎水性以及由不同官能团带来的独特性质，被用作组织工程材料药物缓释材料，是一种有很好发展潜力的生物材料。不溶于水的高分子量PHAs表现出了热塑性塑料和或弹性功能，以及其他的物理和材料学功能，包括生物降解，生物相容性，压电性等，吸引了越来越多工业界的注意。PHA有许多潜在的用途，如作为大宗商品塑料，渔线，梭织材料，和潜在的生物医学应用。

目前PHA生产存在着生产成本高、产量低、成分单一的问题。PHA合酶是PHA合成过程中的关键酶，它的活性和底物特异性决定着PHA的含量和组成。在对PHA合酶进行缺失突变研究时发现，PHA合酶的N端与酶的性质，例如底物特异性、酶活性、耐热性相关，对于聚合反应，最终聚合物的组分起着重要作用。本研究旨在通过对N端的改造来改变PHA合酶的底物特异性，提高PHA合酶的催化活性，提高PHA产量。

富氧产碱菌(R.eutropha)PHA合酶具有很高的酶活性但是只产生PHB。而嗜水气单胞菌WQ(A.hydrophila WQ)PHA合酶有广泛的底物范围、产生P(3HB-co-3HHx)，但是其生产PHA能力低。基于这两个亲本，对PHA合酶的N端进行改造以产生新型PHA具有重大理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的在于对合酶基因N端进行缺失突变研究，研究N端对于合酶性质的影响，改变PHA合酶的底物特异性，提高PHA合酶的催化活性，提高PHA产量以及便于将来构建PHA嵌合酶。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种通过克隆设计引物构建PHA合酶N端缺失突变的方法，包括如下步骤：一种PHA合酶N端缺失突变体构建的方法，包括如下步骤：

1)从NCBI中获得嗜水气单胞菌WQ(A.hydrophila WQ)的序列，并以此序列设计引物P1、P2；

P1-5’-TTAAAGCTTCTAATGGAGCGCACCGCCCAG-3’P2-5’-TTTGAATTCTCATGCGGCGTCCTCCTCT-3’

2)以pUC19-phaPCJ

3)将步骤2)得到的phaPCJ

4)将重组质粒pBBR1MCS2-phaC′J

上述的一种PHA合酶N端缺失突变体构建的方法，步骤2)中反应体系为50μl：ddH

上述的一种PHA合酶N端缺失突变体构建的方法，步骤2)中扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30sec；62℃退火30sec；72℃延伸2.5min，25个循环；72℃延伸10min。

上述的一种PHA合酶N端缺失突变体构建的方法，步骤4)中，所述的培养是37℃培养过夜。

上述的一种PHA合酶N端缺失突变体构建的方法生产的重组菌在生产PHA中的应用。

本发明的有益效果是：通过本发明的方法，成功构建产PHA合酶N端缺失，通过对N端的改造来改变PHA合酶的底物特异性，提高PHA合酶的催化活性，提高了PHA产量。解决PHA单体组成单一的问题。还研究了N端缺失后在不同宿主菌中对于PHA合酶底物特异性的影响。在促进PHA更广泛的应用方面有一定价值。

附图说明

图1是pBBR1MCS2-phaC’JWQ表达质粒构建过程简图。

图2是质粒pUC19-phaPCJWQ琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是(1kb DNA Ladder(10000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3500bp,3000bp,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)、1是(质粒pUC19-phaPCJWQ)、2是(质粒pUC19-phaPCJWQ)。

图3是phaC’JWQ琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是(1kb DNA Ladder(10000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3500bp,3000bp,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)；)、1是(phaC’JWQ PCR电泳结果.)、2是(phaC’JWQ PCR电泳结果.)。

图4是重组质粒酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是(1kb DNA Ladder(10000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3500bp,3000bp,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)；)、1是(空质粒电泳结果)、2是(重组质粒电泳结果)、3是(重组质粒Hind III单酶切电泳结果)、4是(重组质粒Hind III、EcoRI单酶切电泳结果)。

图5是Nile red荧光染色结果。

具体实施方式

一种PHA合酶N端缺失突变体的制备方法，包括如下步骤：

实施例1采用富氧产碱菌(R.eutropha)PHA合酶与嗜水气单胞菌WQ(A.hydrophilaWQ)PHA合酶。

1、PHA合酶基因克隆：

从NCBI中获得嗜水气单胞菌WQ(A.hydrophila WQ)的序列，并以此序列设计引物P1-5’-TTAAAGCTTCTAATGGAGCGCACCGCCCAG-3’，P2-5’-TTTGAATTCTCATGCGGCGTCCTCCTCT-3’。以NCBI上登记的质粒pUC19-phaPCJ

PCR产物大小与预期结果基本一致，phaC’J

2、构建质粒：

PCR扩增获得phaPCJ

验证如图3，同时测序结果表明，表达载体pBBR1MCS2-phaC′J

3、重组菌功能验证：

将含有质粒的R.eutropha PHB

本研究选用Nile red对PHA合酶活性进行初步的定性检测，Nile red是一种荧光染料，可用于脂类及蛋白质等的染色。将发酵所有矿物盐固体培养基培养基配置为固体平板，加入0.5mg/ml Nile red，避光培养3天后，与紫外灯下照相观察有无荧光来初步检测PHA合酶活性。结果如图4所示，N端缺失构建后的PHA合酶初步验证具有PHA合酶活性。

重组菌所产PHA的分子组成及含量的结果见表1。

表1

结果如表1所示，带有pBBR1MCS2-phaC’J