一种基于双水相液滴微流控的3D类器官工程化方法

摘要

本发明提供了一种基于双水相液滴微流控的3D类器官工程化方法。该方法包括双水相水凝胶微囊的细胞负载、胰岛类器官工程化、肝类器官工程化等。本发明主要结合了新兴的人多能干细胞来源的3D类器官和液滴微流控技术，通过可控合成具有良好生物相容性、成分确定、大小均一的双水相水凝胶微囊，用于干细胞来源的3D类器官体外模型构建。本发明具有操作简单、可控性好、减小类器官的变异性、高通量产生等优点，为类器官在疾病模拟、药物筛选、体内移植等生物医学应用方面提供了一个强有力的新平台。

说明书

技术领域

本发明属于再生医学等领域，具体涉及一种基于双水相液滴微流控的3D类器官工程化方法。

背景技术

体外构建3D组织或器官模型可以模拟人体生理学，在生物医学应用中具有重要意义。近年来多种干细胞来源(包括成体干细胞、胚胎干细胞ESC以及诱导多能干细胞hiPSC)的类器官是一项重大技术突破，代表了一种新型的体外器官模型。类器官是干细胞在3D培养中进行特异分化并自组织形成的3D多细胞复杂结构，可以概括体内相应器官的关键结构和功能。目前已成功开发出多种类器官，如肠、脑、肝、肾、视网膜类器官，它们在组织器官发育研究、疾病模拟、药物筛选和转化医学应用等方面显示出巨大的潜力。尽管这类技术有潜在的优势和应用，仍然面临很多局限和不足。一般来说，类器官的产生主要依赖于干细胞包埋在动物来源的基质(如Matrigel)中进行自组织。然而，由于基质成分不确定性和批次间差异，这些传统方法产生的类器官往往具有明显的变异性，可控性差，产量较低等限制。结合现有的工程化手段如生物材料工程和微流控技术，有望优化类器官技术。

水凝胶材料作为细胞3D培养支架，已经在干细胞诱导分化和细胞共培养体系、类器官模型建立等方面得到了广泛的应用。然而，利用传统技术所得到的细胞3D培养水凝胶块，存在比表面积小，细胞营养物质交换不畅、材料尺寸及形貌可控性差等缺点，从而影响细胞或组织表型和功能。因此人们需要一种微观可控的水凝胶支架材料制备方法，而微流控的方法可以满足这些要求，开始在微型水凝胶(微凝胶)材料的合成方面得到应用。水凝胶微囊以其均匀的形态、良好的渗透性和可大量产生等优势，已被认为是组织工程中合适的3D细胞培养支架和移植载体。目前，合成水凝胶微囊主要依赖于微流控液滴技术，涉及到的水凝胶种类包括人工合成的聚乙二醇(PEG)类材料，天然的海藻酸盐、明胶、琼脂等。与传统油水体系不同，基于双水相体系的微流控液滴系统近年来快速发展起来。双水相体系利用的是聚合物的不相容性质，从而使两种不同聚合物的溶液在混合后可能自动分层，形成两相体系。该体系的两相溶液均为水溶液，具有更好的生物相容性，避免了传统的油包水乳液可能带来的细胞毒性风险。利用这些技术和材料制备的微囊在细胞3D培养、干细胞诱导分化以及体外组织或器官构建方面存在很大的应用价值。结合水凝胶材料和微流控液滴技术可以更好地控制组织形态大小均一，有利于高通量产生3D微组织。但是目前将双水相微流控液滴技术用于类器官工程化，优化体外类器官的形成及操作尚属空白。

发明内容

本发明的目的在于开发一种新型的双水相液滴微流控系统，用于一步制备水凝胶微囊，致力于3D类器官工程化。所建立的液滴微流控系统包含不同的功能单元：多相流体入口、液滴生成和微囊产生单元。该系统通过可控形成均一大小的水凝胶微囊，不仅可以用于细胞包封、3D培养、分化和类器官形成，还有利于减小类器官的可变性，并具有易操作、生物兼容性好、高通量、高可控性的特点。为多种类器官工程化以及类器官模型在疾病研究、药物筛选、移植治疗等方面提供了一个新的策略和技术平台。

本发明提供了一种基于双水相液滴微流控的3D类器官工程化方法，该方法结合人多能干细胞来源的3D类器官和液滴微流控技术，通过可控合成具有良好生物相容性、成分确定、大小均一的双水相水凝胶微囊，用于干细胞来源的3D类器官体外模型构建；包括下列步骤：

步骤一、采用双水相液滴微流控芯片，生成双水相水凝胶微囊并完成细胞负载；

步骤二、3D类器官工程化：人多能干细胞汇集到一定生长密度时，将培养干细胞的商业化mTESR1培养基替换为内胚层分化培养基，静置培养，之后诱导组织前体细胞分化，最终产生3D类器官。

所述人多能干细胞的生长密度为50％-70％。

所述内胚层分化培养基为以下两种中的一种：

内胚层分化培养基1：基础成分为商业化的DMEM/F12培养基，添加占总体积1％的B27 supplement(50×)，占总体积1％的KnockOut Replacement(KSR)，占总体积1％的GlutaMax(100×)，占总体积1％的penicillin-streptomycin(100×)，以及加入浓度为80-100ng/ml的Human Activin-A的因子；

内胚层分化培养基2：基础成分为商业化的RPMI-1640培养基，添加占总体积1％的B27 supplement(50×)，占总体积1％的KnockOut Replacement(KSR)，占总体积1％的GlutaMax(100×)，占总体积1％的penicillin-streptomycin(100×)，以及加入浓度为80-100ng/ml的Human Activin-A的因子。

所述双水相水凝胶微囊的产生与细胞负载具体为：水凝胶材料选择生物相容性和稳定性都很好的聚乙二醇(PEG)-葡聚糖组成的双水相体系，PEG分子量范围：8000-20000Da，浓度范围：10-50％，葡聚糖分子量范围：70k-500kDa，浓度范围：10-30％；芯片出口通入浓度为0.5-4％CaCl

海藻酸钠使用的粘度范围：55-1000cps，浓度范围：0.1-2％；分散相流速0.01-1μl/min，连续相流速0.5-5μl/min，泵阀开关周期0.1-1s；

人多能干细胞定向分化为肝或胰岛的前体细胞，将1×10

所述3D类器官为胰岛类器官或肝类器官。

3D类器官为胰岛类器官工程化方法具体如下：

(1)内胚层诱导分化：将培养板中汇集50％-70％密度的人多能干细胞的mTESR1培养基替换为内胚层分化培养基1，静置培养5天；

(2)诱导胰腺内胚层分化：将DMEM/F12培养基替换为高糖DMEM培养基，需添加占总体积0.5％的B27 supplement(50×)，终浓度为2μM dorsomorphin，2μM retinoic acid，10μM SB431542,5ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF)和250nM SANT-1，静置培养6天；

(3)诱导胰腺内分泌前体细胞分化：DMEM培养基需添加占总体积0.5％的B27supplement(50×)，终浓度为2μM dorsomorphin小分子化合物,10μM SB431542小分子化合物,50μg/mL抗坏血酸(ascorbic acid)和10μM DAPT(γ-secretase抑制剂)静置培养5天；

(4)胰岛类器官产生：为促进向胰岛细胞进一步分化，DMEM培养基更换为商业化的CMRL 1066培养基，另外需添加占总体积0.5％的B27 supplement(50×)，终浓度为25mM葡萄糖(glucose)，10mM烟酰胺(nicotinamide),10μM SB431542小分子化合物,50μg/mL抗坏血酸(ascorbic acid)和2μM dorsomorphin小分子化合物；将培养至15-23天的胰岛细胞消化离心，将细胞悬液与含海藻酸钠的分散相溶液充分混匀，通入芯片中形成负载细胞的水凝胶微囊，转入孔板中继续培养；第二天细胞在微囊中聚集成球，在诱导培养基中进一步分化、发育成为胰岛类器官；后续可在此培养基中进行长期的培养，培养期间每隔1-3天换液一次，并进行胰岛类器官的细胞活力和胰岛素分泌功能鉴定。

3D类器官为肝类器官工程化方法具体如下：

(1)内胚层诱导分化：将培养板中汇集50％-70％密度的人多能干细胞的mTESR1培养基替换为内胚层分化培养基2，静置培养5天；

(2)诱导肝前体细胞分化和增殖：将步骤(1)内胚层分化培养基2中的Activin-A替换成HGF和bFGF因子，静置培养5天；HGF终浓度为20-30ng/ml，bFGF终浓度为10-20ng/ml；

(3)肝类器官产生：为促进肝前体细胞进一步分化，将步骤(2)中的培养基更换为商业化的肝细胞培养基Hepatocyte Medium(HCM)，另外需添加OSM因子和地塞米松(Dex)，静置培养；OSM终浓度为10-20ng/ml，Dex终浓度为10

使用的水凝胶材料是任何能快速交联的物质；具体为海藻酸钠、壳聚糖、光聚明胶、PEGDA中的一种。

所述人多能干细胞为人诱导多能干细胞(hiPSC)或胚胎干细胞(hESC)，细胞接种密度范围为2×10

本发明通过以下技术方案实现：双水相水凝胶微囊的产生及细胞负载；胰岛类器官工程化；肝类器官工程化。

所述双水相水凝胶微囊的产生及细胞负载，具体步骤为：(1)制备的集成泵阀的微流控液滴芯片主要由连续相、分散相入口，气动泵阀，液滴生成和微囊产生单元组成。选用聚乙二醇(PEG)-葡聚糖组成的双水相体系，PEG分子量范围：8000-20000Da，浓度范围：10-50％，葡聚糖分子量范围：70k-500kDa，浓度范围：10-30％；芯片出口通入浓度为0.5-4％CaCl

(2)人多能干细胞定向分化为肝或胰岛的前体细胞，将1×10

所述胰岛类器官工程化，具体步骤为：

(1)内胚层诱导分化：将培养板中汇集50％-70％密度的人多能干细胞的mTESR1培养基替换为DMEM/F12培养基，需添加占总体积1％的B27supplement(50×)，占总体积1％的KSR，占总体积1％的GlutaMax以及加入浓度为80-100ng/ml的Activin-A的因子，静置培养5天。

(2)诱导胰腺内胚层分化：将DMEM/F12培养基替换为高糖DMEM培养基，需添加占总体积0.5％的B27 supplement(50×)，终浓度为2μM dorsomorphin，2μM retinoic acid，10μM SB431542,5ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF)和250nM SANT-1，静置培养6天。

(3)诱导胰腺内分泌前体细胞分化：DMEM培养基需添加占总体积0.5％的B27supplement(50×)，终浓度为2μM dorsomorphin,10μM SB431542,50μg/mL ascorbicacid和10μM DAPT，静置培养5天。

(4)胰岛类器官产生：为促进向胰岛细胞进一步分化，DMEM培养基更换为商业化的CMRL 1066培养基，另外需添加占总体积0.5％的B27 supplement(50×)，终浓度为25mMglucose，10mM nicotinamide,10μM SB431542,50μg/mL ascorbic acid和2μMdorsomorphin；将培养至15-23天的胰岛细胞消化离心，将细胞悬液与含海藻酸钠的分散相溶液充分混匀，通入芯片中形成负载细胞的水凝胶微囊，转入孔板中继续培养；第二天细胞在微囊中聚集成球，在诱导培养基中进一步分化、发育成为胰岛类器官；后续可在此培养基中进行长期的培养，培养期间每隔1-3天换液一次，并进行胰岛类器官的细胞活力和胰岛素分泌功能鉴定。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明是将干细胞、生物材料和工程化技术相结合，更好地用于类器官产生，提高了类器官的生理相关性，为体外多种类器官工程化及其生物医学研究提供了一个强有力的技术支撑。

附图说明

图1是双水相液滴微流控芯片的结构示意图，其中：a总体图；b泵阀结构局部图；c水凝胶负载细胞原理图，

其中：1连续相入口；2气体入口；3分散相的入口；4液滴的出口；5分散相的通道；6气体通道；7连续相通道；8主通道；9气动泵阀。

图2是液滴微流控系统中类器官产生的原理图。其中：a水凝胶微囊产生原理图；b水凝胶微囊用于负载细胞和类器官工程化的原理图，

图3是水凝胶微囊中胰岛类器官工程化表征图，其中：a明场表征图(标尺：50μm)和7天内胰岛类器官大小分布图；b 7天内死活染色图和细胞活力荧光定量表征图；c微囊中胰岛类器官的免疫荧光染色图。

图4是水凝胶微囊中肝类器官工程化表征图，其中：a明场表征图和死活染色图(标尺：50μm)；b微囊中肝类器官的免疫荧光染色图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

双水相液滴微流控系统用于胰岛类器官工程化。

所述胰岛类器官工程化，具体步骤为：

(1)内胚层诱导分化：将培养板中汇集50％密度的人多能干细胞的mTESR1培养基替换为DMEM/F12培养基，需添加占总体积1％的B27 supplement，占总体积1％的KSR，占总体积1％的GlutaMax以及加入浓度为80ng/ml的Activin-A的因子，静置培养5天。

(2)诱导胰腺内胚层分化：将DMEM/F12培养基替换为高糖DMEM培养基，需添加占总体积0.5％的B27 supplement，终浓度为2μM dorsomorphin，2μM retinoic acid，10μMSB431542,5ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF)和250nM SANT-1，静置培养6天。

(3)诱导胰腺内分泌前体细胞分化：DMEM培养基需添加占总体积0.5％的B27supplement，终浓度为2μM dorsomorphin,10μM SB431542,50μg/mL ascorbic acid和10μM DAPT，静置培养5天。

(4)胰岛类器官产生：为促进向胰岛细胞进一步分化，DMEM培养基更换为商业化的CMRL 1066培养基，另外需添加占总体积0.5％的B27 supplement，终浓度为25mM glucose，10mM nicotinamide,10μM SB431542,50μg/mL ascorbic acid和2μM dorsomorphin；

将培养至15天的胰岛细胞用0.25％trypsin-EDTA消化成单细胞，将密度为1×10

按以上步骤利用双水相液滴微流控系统工程化胰岛类器官的原理图及初步表征图分别如图2和图3所示，说明胰岛细胞可以在水凝胶微囊中成功包封、分化形成胰岛类器官。

实施例2

双水相液滴微流控系统用于胰岛类器官工程化。

所述胰岛类器官工程化，具体步骤为：

(1)内胚层诱导分化：将培养板中汇集70％密度的人多能干细胞的mTESR1培养基替换为DMEM/F12培养基，需添加占总体积1％的B27 supplement，占总体积1％的KSR，占总体积1％的GlutaMax以及加入浓度为100ng/ml的Activin-A的因子，静置培养5天。

(2)诱导胰腺内胚层分化：将DMEM/F12培养基替换为高糖DMEM培养基，需添加占总体积0.5％的B27 supplement，终浓度为2μM dorsomorphin，2μM retinoic acid，10μMSB431542,5ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF)和250nM SANT-1，静置培养6天。

(3)诱导胰腺内分泌前体细胞分化：DMEM培养基需添加占总体积0.5％的B27supplement，终浓度为2μM dorsomorphin,10μM SB431542,50μg/mL ascorbic acid和10μM DAPT，静置培养5天。

(4)胰岛类器官产生：为促进向胰岛细胞进一步分化，DMEM培养基更换为商业化的CMRL 1066培养基，另外需添加占总体积0.5％的B27 supplement，终浓度为25mM glucose，10mM nicotinamide,10μM SB431542,50μg/mL ascorbic acid和2μM dorsomorphin；

将培养至23天的胰岛细胞用0.25％trypsin-EDTA消化成单细胞，将密度为5×10

按以上步骤利用双水相液滴微流控系统工程化胰岛类器官的原理图及初步表征图分别如图2和图3所示，说明胰岛细胞可以在水凝胶微囊中成功包封、分化形成胰岛类器官。

实施例3

双水相液滴微流控系统用于肝类器官工程化。

所述肝类器官工程化，具体步骤为：

(1)内胚层诱导分化：将培养板中汇集50％密度的人多能干细胞的mTESR1培养基替换为1640+B27培养基，加入浓度为80ng/ml的Activin-A的因子，静置培养5天。

所述1640+B27培养基的基础成分为商业化的RPMI-1640培养基，需添加占总体积1％的B27。

(2)诱导肝前体细胞分化和增殖：在1640+B27培养基添加HGF和bFGF因子静置培养5天；

所述HGF终浓度为20ng/ml，bFGF终浓度为10ng/ml。

(3)肝类器官产生：为促进肝前体细胞进一步分化，1640+B27培养基更换为商业化的肝细胞培养基HCM，另外需添加OSM因子和地塞米松Dex，静置培养；所述OSM终浓度为10ng/ml，Dex终浓度为10

将培养至10-15天的肝前体细胞用0.25％trypsin-EDTA消化成单细胞，将密度为1×10

按以上步骤利用双水相液滴微流控系统工程化肝类器官的原理图及初步表征图分别如图2和图4所示，说明肝前体细胞可以在水凝胶微囊中成功包封、分化形成肝类器官。

实施例4

双水相液滴微流控系统用于肝类器官工程化。

所述肝类器官工程化，具体步骤为：

(1)内胚层诱导分化：将培养板中汇集70％密度的人多能干细胞的mTESR1培养基替换为1640+B27培养基，加入浓度为100ng/ml的Activin-A的因子，静置培养5天。

所述1640+B27培养基的基础成分为商业化的RPMI-1640培养基，需添加占总体积1％的B27。

(2)诱导肝前体细胞分化和增殖：在1640+B27培养基添加HGF和bFGF因子静置培养5天；

所述HGF终浓度为30ng/ml，bFGF终浓度为20ng/ml。

(3)肝类器官产生：为促进肝前体细胞进一步分化，1640+B27培养基更换为商业化的肝细胞培养基HCM，另外需添加OSM因子和地塞米松Dex，静置培养；所述OSM终浓度为20ng/ml，Dex终浓度为10

将培养至10-15天的肝前体细胞用0.25％trypsin-EDTA消化成单细胞，将密度为5×10

按以上步骤利用双水相液滴微流控系统工程化肝类器官的原理图及初步表征图分别如图2和图4所示，说明肝前体细胞可以在水凝胶微囊中成功包封、分化形成肝类器官。