一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用

摘要

本发明公开了一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用，所述高灵敏试剂盒包括：试纸条：NC膜上的检测线上包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.1～0.5mg/ml，质控线上包被羊抗小鼠IgG，浓度为2～8mg/ml；试纸条由上至下为吸水纸、NC膜，样品垫，固定于PVC胶板上；其中，吸水纸和样品垫与NC膜重叠部分为2mm；金标微孔：将芹菜金标抗体与冻干稀释液的混合液加入到低吸附酶标板的微孔后进行冻干得到；其中，所述芹菜金标抗体是用链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物组成的网状结构来标记生物素化芹菜抗体2而制备得到。本发明的检测试剂盒，使用便利，检测灵敏度高，特异性强，极大地提高了家庭检测芹菜过敏原的便捷性。

说明书

技术领域

本发明涉及过敏原检测方法技术领域，尤其涉及一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用。

背景技术

食物过敏也称为食物变态反应或消化系统变态反应、过敏性胃肠炎，是由于某种食物或食品添加剂等引起的IgE介导和非IgE介导的免疫反应，而导致消化系统内或全身性的变态反应。在我国患有过敏性疾病的人高达两亿之多，而其中90％左右是由食品过敏引起的。芹菜作为一种常见蔬菜，属于八大类致敏原之一，它能引起严重的过敏反应，严重威胁着芹菜过敏人群的生命健康。目前国内外对芹菜过敏性疾病没有彻底有效的根治方法，防止芹菜过敏的最有效手段是避免食入含有芹菜的食物。

目前芹菜过敏原检测方法主要有电泳法、色谱法、酶联免疫实验(ELISA)、生物免疫传感器、基于质谱的蛋白质组学(LC-MS/MS)和聚合酶链式反应技术(PCR)等。其中，电泳法、色谱法和酶联免疫实验法是基于蛋白的传统的芹菜检测方法，往往只能针对单个蛋白进行分析，虽然发展的较为成熟但尚不能满足需求；基于质谱的蛋白质组学，可以同时高通量、高灵敏度的快速检测多种食物过敏原。聚合酶链式反应技术(PCR)是以DNA/RNA为基础发展起来的一项检测技术，经高温变性、低温退火及中温延伸等三步环节组成一个循环周期，达到目的基因特异性扩增的目的。PCR技术分为普通PCR和实时荧光定量PCR两种。普通PCR技术主要用于定性检测，检测结果需电泳验证，容易受交叉污染产生假阳性结果。而实时荧光PCR通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量分析，虽然与传统PCR相比，它具有特异性强、准确度高、PCR污染少、自动化程度高等优点，但是操作较为复杂，成本高，耗时长，对实验者的技能要求高等。

以上现有的芹菜过敏原检测方法均对操作人员的技术水平要求较高且需要很复杂精密的仪器设备作为配合，有些方法耗时长，有些方法成本相对较高，种种苛刻要求使以上方法走进家庭成为不可能。

因此，现有的芹菜过敏原检测方法有待进一步改进。

发明内容

针对现有芹菜过敏原检测方法的操作难度高、耗时长、对操作人员技术要求高、不易走入家庭的问题，本发明提供了一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用，该方法在胶体金免疫学方法基础上改良金标微孔得到的一种高效检测芹菜过敏源的新方法。

为解决上述问题，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本申请公开了一种家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒，其包括：

试纸条：NC膜上的检测线上包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.1～0.5mg/ml，质控线上包被羊抗小鼠IgG，浓度为2～8mg/ml；试纸条由上至下为吸水纸、NC膜，样品垫，固定于PVC胶板上；其中，吸水纸和样品垫与NC膜重叠部分为2mm。

金标微孔：将芹菜金标抗体与冻干稀释液的混合液加入到低吸附酶标板的微孔后进行冻干得到；

其中，所述芹菜金标抗体是用链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物组成的网状结构来标记生物素化芹菜抗体2而制备得到。

优选地，所述高灵敏试剂盒还包括：还包括用于提取样品中的芹菜抗原的萃取液，萃取液主要由以下浓度的各组分组成：摩尔浓度为0.05～0.1M的Tris-HCl、质量体积浓度为0.5～1.5％的Triton X-100、质量体积浓度为0.5～3％的NaCl、体积浓度5～30％的乙醇、质量体积浓度为0.01％～0.1％的NaN

第二方面，本发明提供一种芹菜过敏原的家用型检测方法，其采用上述的试剂盒进行检测，方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品中的抗原，得到提取液；

(2)向金标微孔中加入3～4滴提取液，吹打多次以完全溶解微孔内的粉色粉末，室温孵育后，将试纸条MAX端向下插入微孔内，5min后根据试剂条的显色结果判断样品中是否含有芹菜过敏原；

判断依据为：当只有质控线显色时，判定检测结果为阴性；当检测线和质控线同时显色时，判定检测结果为阳性；当质控线不显色，不管检测结果显色与否，都判定检测结果为无效。

优选地，所述家用型检测方法，由样品制备提取液的方法为：

将2～4ml萃取液和一个磁珠加入到5ml小瓶中；向小瓶中直接加入液体样本或固体样本后，上下震摇小瓶30s，静止至少1min后，吸取上清得到提取液；

其中，萃取液主要由以下浓度的各组分组成：摩尔浓度为0.05～0.1M的Tris-HCl、质量体积浓度为0.5～1.5％的Triton X-100、质量体积浓度为0.5～3％的NaCl、体积浓度5～30％的乙醇、质量体积浓度为0.01％～0.1％的NaN

第三方面，本发明还提供一种上述家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：

(1)芹菜金标抗体的制备：

A、向制备好的胶体金中加入碳酸钾，混合均匀后，边搅拌边加入链霉亲和素，室温反应1～4h后，再逐滴加入牛血清白蛋白，室温反应1～4h后，离心收集沉淀并用复溶液重悬，得到链霉亲和素金标复合物溶液；

B、向制备好的胶体金中加入碳酸钾，混合均匀后，边搅拌边加入生物素标计牛血清白蛋白，室温反应1～4h，再逐滴加入牛血清白蛋白，室温反应1～4h再逐滴加入牛血清白蛋白，反应后离心收集沉淀，将沉淀用复溶液重悬，得到生物素标记牛血清白蛋白金标复合物；

C、将前两步得到的链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物以1：3～1:30的比例进行混匀，并边搅拌边按照8～24ug/ml的比例加入生物素化鼠抗芹菜单克隆抗体2，室温反应1～4h或4度过夜，得到芹菜金标抗体。

(2)金标微孔的制备：将芹菜金标抗体溶液与冻干稀释液以1:(10～15)的体积比进行混合，将混合液分装到低吸附酶标板中，在冰箱中冷冻过夜，再进行真空冷冻干燥至少20h后，扣合酶标板帽，得到金标微孔；

(3)试纸条的准备：由上至下将吸水纸、NC膜，样品垫和MAX线固定在PVC胶板上，制备得到试纸条；NC膜上检测线包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.5～2mg/ml，质控线包被羊抗小鼠IgG，浓度为1～5mg/ml。

优选地，步骤(1)的方法具体为：

A、向制备好的胶体金中加入碳酸钾，混合均匀后，边搅拌边加入链霉亲和素，室温反应2h后，再逐滴加入10％牛血清白蛋白，室温反应2h后，离心收集沉淀并用10ml复溶液重悬，得到链霉亲和素金标复合物溶液；

B、向制备好的胶体金中加入碳酸钾，混合均匀后，边搅拌边加入生物素标计牛血清白蛋白，室温反应2h，再逐滴加入10％牛血清白蛋白1000ul，室温反应2h，再逐滴加入10％牛血清白蛋白，反应1h，离心收集沉淀，将沉淀用10ml复溶液重悬，得到生物素标记牛血清白蛋白金标复合物；

C、将前两步得到的链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物以1:5的比例进行混匀，并边搅拌边加入生物素化鼠抗芹菜单克隆抗体2，室温反应2h或4度过夜，得到芹菜金标抗体。

制备好的试剂盒可直接按照以下方法进行样品测试：

提取待测样品中的抗原，得到提取液；向金标微孔中加入3～4滴提取液，吹打多次以完全溶解微孔内的粉色粉末，室温孵育后，将试纸条MAX端向下插入微孔内，5min后根据试剂条的显色结果判断样品中是否含有芹菜过敏原。

优选地，所述胶体金是采用柠檬酸三钠还原的方法制备而成。

优选地，所述复溶液含有以下浓度的各成分：摩尔浓度为0.01M的pH7.4的磷酸缓冲溶液、质量体积浓度为1～5％的牛血清白蛋白、质量体积浓度为1～5％的蔗糖。

第四方面，本发明还提供一种上述家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒在检测食物中、空气、水源和物品表面的芹菜过敏原中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种芹菜过敏原成分的家用型检测方法，通过用链霉亲和素金标复合物和生物素标记牛血清白蛋白金标复合物反应形成的网状结构来标记生物素化芹菜抗体2，极大地提高了芹菜抗体的标记效率，起到了级联放大的效果，使制备得到的芹菜金标抗体对抗原的检测灵敏度提高了至少100倍。此外，该方法操作简单便捷，普通人即可零障碍进行筛查检测，为芹菜过敏原人群的生命健康保驾护航。

金标微孔中，网状结构标记后的生物素化芹菜抗体2、与待测样品中的抗原以及检测线上包被的鼠抗芹菜单克隆抗体1结合，形成夹心结构，通过显色反应将阳性样品检测出来。

2、本发明提供的上述方法对应的试剂盒，试剂盒中包括试纸条、金标微孔，这种试剂盒自带芹菜过敏源检测所需的主要试剂盒抗体等，使待测样品的检测简单而快捷，不用依赖其他设备，不用另花时间配置试剂，极大地提高了家庭检测芹菜过敏原的便捷性。

3、本发明的样品前处理采用了自行配置的高效萃取液，通过将其分装进小瓶并加入特制磁珠提高食物中芝麻过敏原的提取效率，极大缩短了萃取时间和简化了前处理部分，即用即取，让过敏人群足不出户就可以筛查可疑食物中是否含有芹菜成分，从而避免因摄入含有芹菜的食物而引起的过敏反应。

附图说明

图1为本发明的试纸条的结构及使用方法；

图2为采用本发明的试纸条对不同浓度的样品抗原的检测结果；样品抗原浓度从左至右依次为0ppb、1ppb、10ppb、100ppb、1000ppb和10000ppb；

其中，左图A为本发明的试剂盒的测试结果，显示灵敏度为1ppb，右图B为传统试剂盒测试的结果，显示灵敏度为100ppb；

图3为本发明的试剂盒的特异性测试结果；

其中，1～8分别为牛奶酪蛋白，虾萃取蛋白，杏仁萃取蛋白，大豆萃取蛋白，鸡蛋萃取蛋白，小麦醇溶蛋白，花生萃取蛋白和鳕鱼萃取蛋白。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实验材料来源：

1、本发明采用的多种抗体

(1)鼠抗芹菜单克隆抗体1和鼠抗芹菜单克隆抗体2的制备：用本实验室制备的芹菜过敏原蛋白(基因表达方法)免疫小白鼠，使其产生致敏B淋巴细胞，然后取其脾脏细胞与同系骨髓瘤细胞，在聚乙二醇作用下，发生融合，形成杂交瘤细胞，经筛选，得到能稳定分泌芝芹菜单克隆抗体的阳性细胞株共10株，然后将10株细胞扩大培养后注入小鼠腹腔，取腹水纯化后得到所对应的鼠抗芝麻单克隆抗体，然后筛选配对得到可用的鼠抗芹菜单克隆抗体1和鼠抗芹菜单克隆抗体2，对应细胞株克隆号分别为10-14G1和2-2G2。

(2)生物素化鼠抗芹菜单克隆抗体2：用生物素-N-羟基丁二酰亚胺活化脂在0.01MpH8.0 PBS中与鼠抗芹菜单克隆抗体2反应一定时间后得到。生物素-N-羟基丁二酰亚胺活化脂购自北京索莱宝科技有限公司。

(3)羊抗小鼠IgG：采购自北京索莱宝科技有限公司。

实施例1家用型检测芹菜过敏原的高灵敏试剂盒的制备

1、胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原的方法制备胶体金，制备的主要步骤如下：

准确量取800mL超纯水(UP级别水)，加入到1000mL锥形瓶中，再加入8ml 1％的氯金酸溶液，边搅拌边加热至沸腾状态，快速加入质量分数为12％的柠檬酸三钠水溶液1mL，溶液在2min内由灰色变黑色，最后变成红色，继续加热搅拌10min，冷却至室温，加超纯水定容至800mL，得到胶体金，避光保存备用。

2、芹菜金标抗体的制备

(1)取制备好的胶体金100ml，加入0.2M碳酸钾0.4ml，混合均匀后，搅拌情况下加入链霉亲和素500ug，室温反应2h，再逐滴加入10％牛血清白蛋白1000ul，室温反应1h，13000r/min，离心15min，弃上清液，沉淀用10ml复溶液重悬。

(2)取制备好的胶体金100ml，加入0.2M碳酸钾0.8ml，混合均匀后，搅拌情况下加入生物素标计牛血清白蛋白1000ug，室温反应2h，再逐滴加入10％牛血清白蛋白1000ul，室温反应1h，13000r/min，离心15min，弃上清液，沉淀用10ml复溶液重悬。

(3)将链霉亲和素金标抗体和生物素标记牛血清白蛋白金标抗体以1：5比例混匀，按照8ug/ml的比例边搅拌边滴加生物素化芹菜抗体2，室温反应2h，或者4度过夜，得到芹菜金标抗体。

本实施例中，1L的复溶液的制备方法为：称取2.88g的十二水合磷酸氢二钠、0.296g二水合磷酸二氢钠、10g牛血清白蛋白和20g蔗糖后溶于500ml水中，然后用水定容至1000ml。

3、金标微孔制备

取上述制备的芹菜金标抗体4ml，与56ml冻干稀释液混合在一起，按照每孔60ul的量分装在低吸附酶标板中，放在-80度冰箱中预冷过夜；第二天，将酶标板放入冻干机中抽真空至少20h，然后扣酶标板帽，得金标微孔，干燥保存备用。

4、试纸条准备

NC膜上的检测线上包被鼠抗芹菜单克隆抗体1，浓度为0.1～0.5mg/ml，质控线上包被羊抗小鼠IgG，浓度为2～8mg/ml；试纸条由上至下为吸水纸、NC膜，样品垫，固定于PVC胶板上；其中，吸水纸和样品垫与NC膜重叠部分为2mm。

5、萃取液的配置

萃取液主要由以下浓度的各组分组成：摩尔浓度为0.05～0.1M的Tris-HCl、质量体积浓度为0.5～1.5％的Triton X-100、质量体积浓度为0.5～3％的NaCl、体积浓度5～30％的乙醇、质量体积浓度为0.01％～0.1％的NaN

优选地，萃取液由以下浓度的各组分组成：摩尔浓度为0.05M的Tris-HCl、质量体积浓度为1％的Triton X-100、质量体积浓度为0.85％的NaCl、体积浓度15％的乙醇、质量体积浓度为0.01％的NaN

1L的上述优选萃取液的配置方法如下：称量6.05g的Tris，10g的Triton X-100，8.5g的氯化钠，150ml的无水乙醇，0.1g NaN

6、样品中过敏原的检测

(1)样品中芹菜过敏原的提取

将3ml萃取液和一个磁珠加入到5ml小瓶中。样本测试时，液体样本直接用0.5ml吸管滴加10滴进入5ml小瓶，固体样本时，用一次性小勺取两平勺样品加入5ml小瓶中，然后用手上下震摇小瓶30s，静止1min，收集上清液。

(2)样品的检测

用0.5ml吸管向金标微孔中滴加上清液3～4滴，吹打5～6次以完全溶解微孔内的粉色粉末，将试纸条MAX端向下插入微孔内，10min时判断结果。

(3)检测结果的分析：

判断依据为：当只有质控线(C线)显色时，判定检测结果为阴性；当检测线(T线)和质控线(C线)同时显色时，判定检测结果为阳性；当质控线不显色，不管检测结果显色与否，都判定检测结果为无效。

实施例2试剂盒的灵敏度和特异性的测试

1、实验方法：

(1)灵敏度实验：用稀释液将芹菜过敏原蛋白配置成不同浓度，分别为0ppm，0.1ppm，1ppm，10ppm，100ppm，然后按照前述检测步骤进行测试。同时以传统方法制备的试剂条(即鼠抗芹菜单克隆抗体1标记金标抗体，鼠抗芹菜单克隆抗体2包被检测线，羊抗小鼠IgG包被质控线)作为对照进行实验，结果见图2。

(2)特异性实验：分别取牛奶酪蛋白，虾萃取蛋白，杏仁萃取蛋白，大豆萃取蛋白，鸡蛋萃取蛋白，小麦醇溶蛋白，花生萃取蛋白和鳕鱼萃取蛋白，用稀释液配置成10ppm的浓度，按照检测步骤测试，结果见图3。

2、实验结果及分析：

(1)图2为灵敏度实验结果，结果显示本发明的试纸条的灵敏度为0.1ppm，对照组的试剂条的灵敏度为10ppm，这说明本发明的试剂条的灵敏度提高了100倍。

(2)图3为本发明的试纸条分别与牛奶酪蛋白，虾萃取蛋白，杏仁萃取蛋白，大豆萃取蛋白，鸡蛋萃取蛋白，小麦醇溶蛋白，花生萃取蛋白和鳕鱼萃取蛋白(从左到右)的交叉反应结果。

结果显示：该试纸条与上述过敏原蛋白均没有交叉反应，试剂条的特异性良好。

实施例3试剂盒的质量检验

1、最低检出限检验

取阴性玉米粉做加标实验，加标水平分别为0ppm、0.5ppm、1ppm、10ppm和100ppm。

结果显示：加标0ppm和0.5ppm的检验结果为阴性，其他加标组的检验结果为阳性，说明该试纸条最低检出限为1ppm。

2、阴性样本复合率

采购市面上已知芝麻阴性的样本50份，用该试纸条测试，结果显示复合率为100％。

3、阳性样本复合率

采购市面上已知芝麻阳性的样本50份，用该试纸条测试，结果全部为阳性，复合率为100％。

4、平行性检测

取阴性玉米粉，加标10ppb，重复测试8次，结果均为阳性，重复性良好。上述检测结果说明本发明的试剂盒的检测结果准确可靠。

实施例4试剂盒的稳定性考察

将本发明实施例1中制备的试纸条分别于37℃和4℃放置18天后，然后用标准品进行对比试验。检测结果显示没有明显区别，按照本领域常规换算方法(37度放置一天等同于4度放置一个月)后，结果说明该试纸条可以在2～8℃稳定保存1.5年。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。