含有盲曹鱼鳞来源胶原蛋白的细胞培养基材

摘要

本发明涉及一种含有盲曹鱼鳞来源胶原蛋白的细胞培养基材。

说明书

技术领域

本发明广泛涉及含有盲曹鱼(Lates calcarifer)鳞来源的胶原蛋白纤维的细胞培养基材等。

背景技术

在再生医疗领域中，胶原蛋白凝胶作为细胞培养基材的原料而被广泛使用。其原料多半依赖于资源量大、产量高的牛和猪等脊椎动物的真皮，但这些胶原蛋白的使用并非没有问题。例如，在东南亚的一些地区，存在文化上对哺乳类动物来源的产品的处理受到限制的问题。

另外，还需要避免在2000年代初期成为问题的BSE(Bovine spongiformencephalopathy，疯牛病)等病原体引起的感染症，寻找能代替牛和猪的胶原蛋白原料成为产业上的课题。

因此，通过养殖而容易建立批量生产体制、而且感染风险比脊椎动物低的鱼来源胶原蛋白的利用被研究，但是，以往的由鱼来源胶原蛋白制备的纤维凝胶大多与来源于恒温动物的相比，在热稳定性的观点上不充分，不能形成如来源于牛和猪的胶原蛋白凝胶那样的力学稳定的纤维凝胶。

近年来，也出现了将鱼类胶原蛋白用于细胞培养的例子。例如，有报告表示，从生活在东南亚等温暖地区的罗非鱼(日本名：Izumidai)中提取的胶原蛋白单体的变性温度高。

关于罗非鱼，在日本专利特开2014-218453号公报和日本专利特开2012-126681号公报中，公开了以从罗非鱼的皮和鳞中提取的胶原蛋白为原料的胶原蛋白纤维凝胶及其作为细胞培养基材的用途。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2014-218453号公报；

专利文献2：日本特开2012-126681号公报。

发明内容

但是，如罗非鱼鳞来源的胶原蛋白那样，即使单体状态下的温度稳定性高，不清楚引起纤维形成的胶原蛋白缔合体在37℃下是否也是热稳定。实际上，在日本专利特开2014-218453号公报中，虽然记载了鱼鳞来源的胶原蛋白从纤维形成速度的快慢、与细胞的良好的粘附性方面考虑是优选的，但是没有研究从罗非鱼的鳞制备的胶原蛋白凝胶作为细胞培养基材的合适性。

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于，提供一种能够在37℃下进行三维细胞培养的、含有鱼来源胶原蛋白的细胞培养基材。

本发明人等为了达到上述目的而进行了深入研究，结果发现，盲曹鱼鳞来源的胶原蛋白与罗非鱼鳞来源的胶原蛋白相比，显著地适合作为细胞培养基材，从而完成了本发明。

即，本发明包含以下发明。

[1]一种细胞培养基材，包括：来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白。

[2]如上述[1]所述的细胞培养基材，其中，在所述来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白中，每1000个氨基酸残基中的羟脯氨酸为80个残基以上。

[3]如上述[1]或[2]所述的细胞培养基材，其中，在所述来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白中，α

[4]一种细胞培养用试剂盒，包括：[1]至[3]中任一项所述的细胞培养基材。

根据本发明，通过利用来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白，能够提供细胞粘附性和细胞伸展活性高的细胞培养基材。由盲曹鱼鳞制备的胶原蛋白纤维凝胶具有与以往的以来源于牛和猪的真皮的胶原蛋白为原料的细胞培养基材相匹敌的特性，因此可以成为特别适合三维培养环境的培养基材的替代材料。

作为盲曹鱼来源的胶原蛋白，已知有来源于其皮的胶原蛋白(日本专利特开2015-180622号公报)。但是，关于盲曹鱼皮来源的胶原蛋白，在该公报中启示羟脯氨酸含量少得无法检测到，这一点与鳞来源的胶原蛋白不同，另外，由其制备的胶原蛋白纤维凝胶的热稳定性也比鳞来源的胶原蛋白差。

而且，在WO2017/002767中，虽然公开了由盲曹鱼的鳞制备的明胶，但明胶是通过热变性使胶原蛋白的立体结构和分子量变化的，与胶原蛋白纤维凝胶不同。例如，明胶凝胶具有无规线圈结构的明胶分子在分子之间交联的结构，与此相对，胶原蛋白纤维凝胶具有三重螺旋结构的胶原蛋白分子自聚集而成的胶原蛋白纤维进行了分子间交联的结构。特别是，来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白纤维凝胶与WO2017/002767中记载的明胶的不同之处在于，在37℃下纤维化后，即使升温至50℃后，G'也表示90Pa以上的值。

附图说明

图1示出对盲曹鱼鳞来源的胶原蛋白实施SDS-PAGE的结果(PC-S：猪皮、BC：盲曹鱼鳞、BC-S：盲曹鱼皮、TC：罗非鱼鳞(Cellcampus AQ-3LE)、CMT：猪腱(Cellmatrix Type-I-P))；

图2示出凝胶内细胞的生死判定的染色结果；

图3示出凝胶内细胞的细胞骨架的显微镜图像。

具体实施方式

以下，根据需要，参照附图，对用于实施本发明的方式(以下，简称为“本实施方式”)进行详细说明，但本发明并不局限于下述本实施方式。本发明在不脱离其主旨的范围内可以进行各种变形。

在第一实施方式中，本发明提供一种细胞培养基材，其包括盲曹鱼鳞来源的胶原蛋白。

胶原蛋白至少部分地具有由3条α链组成的螺旋结构(胶原蛋白螺旋)，所述α链具有10万左右的分子量。在α链中，根据氨基酸组成的微小差异，大致区分为α

在胶原蛋白分子中，已报告有根据结构的不同而存在19种类型，而且，在被分类为相同类型的胶原蛋白中，有时也存在数种不同的分子种类。

其中，I、II、III型和IV型胶原蛋白主要用作生物材料的原料。I型存在于大多数结缔组织中，构成细胞外基质。是生物体内量最多的胶原蛋白类型。特别是肌腱、真皮及骨中较多，工业上胶原蛋白大多从这些部位提取。II型是形成软骨的胶原蛋白。III型虽然是少量，但大多存在于与I型相同的部位。IV型是形成基底膜的胶原蛋白。I、II和III型作为胶原蛋白纤维而存在于生物体内，主要起保持组织或器官的强度的作用。IV型不具有纤维形成能力，但形成由4个分子构成的网状缔合体，与基底膜中的细胞分化有关。

本发明中使用的盲曹鱼(Lates calcarifer)鳞来源的胶原蛋白具有与III型胶原蛋白类似的分子量分布，只要没有特别说明，可以含有任何类型的胶原蛋白。

本说明书中使用的胶原蛋白纤维是指，可从盲曹鱼鳞中提取的胶原蛋白纤维，其至少具有三重螺旋结构。

从热稳定性的观点出发，胶原蛋白纤维优选每1000个氨基酸残基中的羟脯氨酸为80个残基以上。盲曹鱼鳞来源的胶原蛋白中的羟脯氨酸含量高达8％以上，因此是优选的。该值虽然不及猪皮来源的胶原蛋白的羟脯氨酸含量，但作为鱼胶原蛋白可以说含量非常高。

当用SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定时，通常，胶原蛋白在200kDa附近显示1条β链的带，在100kDa附近显示α

本实施方式中的胶原蛋白的特征在于，构成其纤维的α

α

本实施方式中的凝胶的特征在于，作为构成凝胶的单体的变性温度高，即，胶原蛋白纤维在37.0℃下维持三重螺旋结构。例如，罗非鱼鳞来源的胶原蛋白的变性温度约为35.7℃，与此相对，盲曹鱼鳞来源的胶原蛋白的变性温度约为36.1℃。变性温度可以通过圆二色性光谱(Circular Dichroism，CD)等本领域技术人员公知的方法来确认。

在通过CD来测定胶原蛋白时，可以确认起因于三重螺旋的221nm的正峰，而在明胶中看不到这样的峰。

除了变性温度的高低以外，本实施方式中的凝胶在贮藏弹性率(G')的观点上也优于罗非鱼鳞来源的凝胶。贮藏弹性率可以使用能够评价动态粘弹性特性的装置例如流变仪来决定。在本说明书中，除非特别说明，贮藏弹性率(G')是指，将含有0.27重量％胶原蛋白的pH7的水溶液，在旋转型流变仪MCR302(安东帕(Anton-Paar)公司制造)上，从10℃升温至37℃时的值。在该条件下测定时，以盲曹鱼鳞为原料的胶原蛋白凝胶的贮藏弹性率G'为90Pa以上。在相同条件下测定以盲曹鱼鳞为原料的胶原蛋白凝胶的贮藏弹性率时，升温引起的变性过程的软化温度在45℃以上。该“软化温度”是指，温度在37℃下保持恒定时所到达的G'的最后10分钟的平均值随着升温而减少5％时的温度。

来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白的浓度可以根据用途而适当变更。例如，在用于培养细胞等的培养基中使用时，胶原蛋白的浓度可以在0.20％～0.53％的范围内。当胶原蛋白浓度小于0.20％时，难以获得抵抗细胞牵引力的硬度。当胶原蛋白浓度为0.53％以上时，凝胶制作中使用的胶原蛋白水溶液的粘度高，因此与缓冲液等的混合不充分，凝胶的均质性受损。凝胶的硬度对干细胞的分化有影响(Even-Ram et al.，Cell，126，645-647(2006))，因此当凝胶的硬度不均匀时，作为细胞培养基材不是优选的。

关于来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白纤维凝胶，可以通过使构成胶原蛋白纤维的胶原蛋白分子间交联的方法来制造，从有效提高胶原蛋白纤维凝胶的弹性率的观点出发，优选使用在胶原蛋白的纤维化过程中发生交联反应的方法。作为具体方法，例如可以举出如下方法：在pH1～5、优选pH3左右的、浓度3％以下的胶原蛋白水溶液中，在成为原料的胶原蛋白的变性温度以下的温度(例如，10℃左右)下，混合pH6～10、优选pH7左右的磷酸钠缓冲液，得到具有预定的胶原蛋白浓度的溶液后进行静置等。缓冲液可任选地包含交联剂。

关于胶原蛋白水溶液，例如可以以鳞为原料，通过使用乙酸等的酸或胃蛋白酶等的酶的公知的提取方法来制造。胶原蛋白水溶液的浓度可以通过溶解曾沉淀或干燥的胶原蛋白时的胶原蛋白/溶剂的重量比来调节。当胶原蛋白浓度超过3％时，粘度变高，由于与磷酸氢钠缓冲液的混合不充分，有时产生不均匀的凝胶，因此不是优选的。优选浓度为1％以下。

缓冲液中含有交联剂时的浓度没有特别限定。但是，关于交联剂的浓度，与其说是磷酸氢钠缓冲溶液中的浓度，不如说是与胶原蛋白水溶液混合后的浓度(凝胶中的浓度)影响凝胶形成的成败、凝胶的物性。胶原蛋白纤维凝胶中的交联剂浓度优选在5～80mM的范围内。当胶原蛋白纤维凝胶中的交联剂浓度低于5mM时，胶原蛋白分子中难以导入交联，凝胶的弹性率有时不足，因此不是优选的。另一方面，当交联剂浓度超过80mM时，有时胶原蛋白水溶液与磷酸钠缓冲液混合后的凝胶化速度过快，成形性变差，因此不是优选的。更优选10～30mM的范围。

在凝胶化速度过快而成形性差的情况下，根据需要，可以添加氯化钠等无机盐作为纤维化抑制剂。所添加的无机盐的浓度作为胶原蛋白纤维凝胶中的浓度而优选30～150mM的范围。当凝胶中的无机盐的浓度低于30mM时，有时胶原蛋白的纤维化过快而胶原蛋白纤维网络不发达，凝胶变弱。当凝胶中的无机盐的浓度超过150mM时，有时胶原蛋白纤维化被抑制，凝胶变弱。更优选50～130mM的范围。

在来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白纤维凝胶中，用于使胶原蛋白分子间交联的交联剂只要是能够使蛋白质交联、且具有水溶性的交联剂即可，没有特别限定。关于蛋白质的交联剂，在文献(Biomaterials，18，p.95-105(1997))中有详细记载。其中，从经济性、安全性和操作性的观点出发，优选使用戊二醛等的醛类交联剂、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)等的碳二亚胺类交联剂、六亚甲基二异氰酸酯/盐等的异氰酸酯/盐类交联剂、乙二醇二乙醚等的聚环氧类交联剂。特别是，优选使用将EDC、1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺磺酸盐等的水溶性碳二亚胺溶解于pH6～10的磷酸缓冲液中而得到溶液。

另一方面，明胶分子通过热变性而变化，形成无规线圈结构，然而，通过冷却而螺旋结构恢复，附近的分子之间共有螺旋结构部分而缔合/凝聚，由此可以形成交联凝胶。

含有上述胶原蛋白纤维凝胶的细胞培养基材是成为培养细胞的支架的基材，可以用于任意的培养基。胶原蛋白纤维凝胶适合用作三维培养的培养基。细胞培养基材可以单独提供，或者也可以作为含有细胞培养所需的血清等成分的培养基或试剂盒来提供。细胞培养基材或培养基可以包含在细胞培养容器内。对细胞培养用容器的种类没有特别限定，优选使用作为细胞培养用消耗品而广泛使用的塑料制的皿或板等。塑料与胶原蛋白的亲和性低，与玻璃等相比，容易剥离凝胶。

在含有来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白纤维凝胶的培养基中，可以使细胞粘附/增殖，或者根据需要使其分化。培养细胞没有特别限定，例如可以用于体细胞、生殖细胞、干细胞等。作为干细胞，可以举出胚胎干细胞、人工多能性干细胞、或间充质干细胞等的体干细胞。来源于盲曹鱼鳞的胶原蛋白纤维凝胶特别适于培养在平面培养中容易去分化且难以长期继代培养的细胞，例如软骨细胞。

从盲曹鱼鳞提取胶原蛋白可以使用公知的方法来进行。例如，以鱼鳞为原料，使用酶对胶原蛋白进行可溶化处理的方法为本领域技术人员所公知的，例如，记载在日本专利第4863433号公报和日本专利第5692770号公报中。

例如，作为提取中使用的酶，可以优选使用能够水解鳞来提取胶原蛋白的酶，例如胃蛋白酶等。酶的添加量没有特别限制，优选的是，相对于鱼鳞的干燥重量为1～15重量％。

在提取工序之前，为了除去鱼鳞中所含的磷酸钙等无机物，进而提高提取效率，优选进行脱灰处理。此外，为了除去鳞中所含的不需要的蛋白质或脂质，也可以使用含有特定酸的水溶液或有机溶剂来清洗鳞。

鱼鳞来源胶原蛋白的获取方法可以包括：对鱼鳞进行脱灰的工序；在15℃～35℃的温度范围的酸性水溶液中，使蛋白酶作用于脱灰后的鱼鳞的工序；以及针对可溶化后的胶原蛋白进行回收的工序。作为原料的鱼鳞，为了防止腐败，优选在采集后冷藏保存或冷冻保存。在所采集的鱼鳞上附着/混入有相当多的杂质，例如背鳍、尾鳍等，或在其表面附着有剩余蛋白质。因此，以在保存前除去它们为目的，作为原料的鱼鳞优选在采集后作为前处理而进行清洗。

具体而言，杂质通过水洗除去即可，关于附着于表面的剩余蛋白质，例如以1～15重量％、优选5～10重量％的氯化钠水溶液，或者0.01～0.5M、优选0.05～0.2M的氢氧化钠水溶液清洗10～72小时、优选清洗24～48小时来除去即可(碱处理)。清洗优选更换清洗液进行反复清洗，特别是在除去附着于表面的剩余蛋白质时，优选更换清洗液进行反复清洗直至清洗后的废液不混浊的程度，优选更换3～5次左右。

作为前述蛋白酶处理中使用的蛋白酶水溶液的溶剂，只要pH为2～5的范围即可，没有特别限定，但优选使用廉价且容易操作的盐酸、乙酸和磷酸。酸的浓度由上述pH值规定。

在胶原蛋白纤维凝胶的制造中，例如可以在15℃～35℃的温度范围的酸性水溶液中进行蛋白酶处理。由此，能够在不引起胶原蛋白变性的情况下提高胶原蛋白的提取效率，实现高产量。当温度低于15℃时，蛋白酶活性降低，胶原蛋白的提取效率降低，并不是优选的。当温度为35℃以上时，虽然蛋白酶活性变高，但考虑到发生胶原蛋白的变性的情况，因此不是优选的。因此，蛋白酶处理在15℃～35℃的温度范围内，更优选在20℃～30℃的温度范围内进行。

蛋白酶处理只要在伴随蛋白酶失活而胶原蛋白的可溶化能力降低的同时结束即可，例如，处理时间为12～48小时左右即可。另外，为了提高提取效率，也可以使用搅拌叶片等来搅拌处理液。

关于溶解于酸性水溶液中的胶原蛋白，例如可以通过以往在来源于哺乳动物等的胶原蛋白制备中使用的通常的物理分离方法来回收，其方法没有特别限定。例如，在蛋白酶处理后，在通过离心分离或过滤等的方法而与鱼鳞残渣分离的胶原蛋白水溶液中，加入氯化钠等来提高盐浓度，或者加入氢氧化钠等来将pH调整至中性附近，由此使胶原蛋白纤维化，例如通过离心分离法等来分离回收该纤维化的胶原蛋白即可。

然后，根据需要，例如再次溶解在纯净水中，用上述方法进行一次或多次纤维化-回收操作，由此可以进行纯化。此外，在胶原蛋白的制备中，为了抑制胶原蛋白的变性，优选的是，尽可能在室温以下实施上述各前处理、回收、纯化等的各工序。

在第二实施方式中，细胞培养基材作为细胞培养用试剂盒来提供。

在这样的试剂盒中，例如，细胞培养基材可以容纳在容器中。对于这样的容器的种类没有特别限定，优选的是，广泛使用的塑料制的皿或板等。塑料与胶原蛋白的亲和性低，与玻璃相比，还具有容易剥离凝胶的优点。

容器可包含适于所培养的细胞的培养基。培养基的组成根据所培养的组成而变化，因此不作限定，通常包括无机盐类、各种氨基酸、糖类、维生素类、还有血清等。

以下，通过实施例，进一步详细说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例

<实验>

1.从鱼鳞中提取可溶性胶原蛋白

(1)鱼鳞的前处理(碱处理及脱灰处理)

用水充分清洗盲曹鱼鳞(来自A.O.KINGDOM INTERNATIONAL CO.,LTD)，除去鳍等杂质后风干。将洗净的干燥鱼鳞浸渍在0.1M的氢氧化钠水溶液中，使用搅拌叶片平稳地搅拌24小时。用金属网过滤鱼鳞，用水反复清洗直至pH表示中性。进而，在将鱼鳞浸渍于pH2的稀盐酸中的状态下，平稳地搅拌24小时，由此进行脱灰处理。用金属网过滤鱼鳞，用水反复清洗直至pH表示中性，进行冷冻干燥处理。将所得的冷冻干燥鳞在冷冻库中保管，将其供于胶原蛋白提取。

(2)从鱼鳞中提取胶原蛋白

将350g的冷冻干燥鳞加入到3000mL的0.5M乙酸水溶液中，使用搅拌叶片在室温下平稳地搅拌3天。将该水溶液离心(10000×g，20分钟)，使鱼鳞沉淀。回收上清，使用玻璃纤维过滤器(默克公司(Merck)制造)和膜过滤器(默克公司制造，接着0.65μm而使用0.45μm)进行抽滤，回收酸溶性成分。

接着，用金属网过滤鱼鳞，用水反复清洗直至pH表示中性。将鱼鳞加入到包含7g胃蛋白酶(富士胶片和光纯药公司，具有相对于1g胃蛋白酶而能够水解100g蛋白质的活性)的1000mL的0.5M乙酸水溶液中，使用搅拌叶片在室温下平稳地搅拌3天。将该水溶液离心(10000×g，20分钟)，使鱼鳞沉淀。回收上清，使用玻璃纤维过滤器(默克公司制造)和膜过滤器(默克公司制造，接着0.65μm而使用0.45μm)进行抽滤，回收胃蛋白酶处理成分。

(3)所提取的胶原蛋白的纯化

针对上述的酸溶性成分、胃蛋白酶处理成分，以最终浓度分别成为0.9M的方式加入氯化钠水溶液，用玻璃棒混合后，在4℃下静置24小时而进行盐析。将其离心(10000×g，20分钟)，将沉淀物溶解于300ml的0.5M乙酸水溶液中。将该盐析工序重复3次，将胶原蛋白的乙酸水溶液放入纤维素管中，对蒸馏水进行透析，冷冻干燥。根据提取后的冷冻干燥体的重量相对于脱灰处理后的鳞的干燥重量，计算胶原蛋白提取的产量。将冷冻干燥体以任意浓度溶解于pH3的稀盐酸中，制备酸溶性胶原蛋白、胃蛋白酶提取胶原蛋白。

2.胶原蛋白的结构分析

(1)基于氨基酸组成的一次结构的确认

为了调查盲曹鱼鳞来源的胶原蛋白(BC)的一次结构，对胃蛋白酶提取胶原蛋白进行了氨基酸自动分析。作为对照，使用与上述同样的提取方法来制备的罗非鱼鳞来源的胃蛋白酶提取胶原蛋白(TC)和猪皮来源的胃蛋白酶提取胶原蛋白(PC-S)(新田明胶公司制造，商品名为“胶原蛋白BM”)。测定是委托一般财团法人日本食品分析中心来进行，计算出相对于1000个氨基酸残基的各氨基酸组成。结果如下表所示。

[表1]

(2)通过SDS-PAGE进行的胶原蛋白的确定

上述1.(1)～(3)中通过电泳(SDS-PAGE法)调查了提取/纯化的盲曹鱼鳞的胃蛋白酶提取胶原蛋白的分子量分布。电泳凝胶使用3～8％的三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐(TRISacetate)凝胶(赛默飞世尔科技公司制造)。以每孔10μL的量施加0.06％浓度的胶原蛋白溶液，对每张凝胶以20mA的恒定电流进行电泳。作为对照，使用盲曹鱼皮胶原蛋白(BC-S)、Cellcampus AQ-03LE(TC)(罗非鱼鳞来源胶原蛋白，多木化学株式会社制造)、CellmatrixTypeI-P(CMT)(猪腱来源胶原蛋白，新田明胶株式会社制造)。

作为分子量标记，使用光谱多色高程蛋白质梯(Spectra Multicolor High RangeProtein Ladder，赛默飞世尔科技公司制造)，电泳后的凝胶使用Quick-CBB plus(商品名，富士胶片和光纯药社制造)进行染色。

结果如图1所示。

如图1所示，猪皮来源的胶原蛋白(PC-S)、盲曹鱼鳞来源的胶原蛋白(BC)、盲曹鱼皮来源的胶原蛋白(BC-S)均在120kDa附近得到表示α链的电泳带、在120kDa附近得到表示α链的电泳带、在240kDa附近得到表示β链的电泳带、在270kDa以上的位置得到表示γ链的电泳带。

BC和BC-S的α链的电泳图案表明，鳞、皮均为α

关于图1所示的分子量差，盲曹鱼鳞来源的胶原蛋白(BC)约为4.0kDa，盲曹鱼皮来源的胶原蛋白(BC-S)约为5.5kDa，罗非鱼皮来源的胶原蛋白(TC)约为11.0kDa，猪皮来源的胶原蛋白约为10.0kDa。

如上所述，不论处理方法如何，来源于猪皮或罗非鱼鳞等的一般的I型胶原蛋白的分子量差为10kDa以上，与此相对，盲曹鱼鳞来源胶原蛋白的分子量差为5.0kDa以下。

3.基于凝胶包埋细胞培养的评价

(1)凝胶包埋细胞培养

将冰凉的、上述1.(1)～(3)中提取/纯化的盲曹鱼鳞来源的胃蛋白酶提取胶原蛋白(0.3％)、5倍浓缩DME(二甲醚，dimethoxyethan)培养液(5×DME，新田明胶株式会社制造)和再构成用缓冲液(新田明胶株式会社制造)以7：2：1的比例混合，制备胶原蛋白溶液。然后，在该胶原蛋白溶液中，以4.2×10细胞/ml(Cell/ml)的浓度分散鼠来源纤维芽细胞、即NIH3T3细胞，向24孔板中每孔分注500μl，在37℃培养箱内凝胶化1小时。凝胶化后，加入含有10％小牛血清(CS)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium，达尔伯克改良伊格尔培养基，西格玛奥德里奇公司制造)，在37℃下开始培养。作为对照，使用盲曹鱼皮胶原蛋白(BC-S)、Cellcampus AQ-03A(TC)(罗非鱼鳞来源胶原蛋白、多木化学株式会社制造)、Cellmatrix TypeI-A(CMT)(猪腱来源胶原蛋白、新田明胶株式会社制造)，进行同样的培养。

(2)基于染色的凝胶内细胞的生死判定

对在上述3.(1)中培养了7天的细胞被包埋的凝胶，用DPBS(-)(Dulbecco’sPhosphate Buffered Saline，富士胶片和光纯药株式会社制造)清洗之后，使用Cellstain(注册商标)-双染色试剂盒(Double Staining Kit，同仁化学研究所制造)，在37℃下培养15分钟并进行染色。然后，用共聚焦激光显微镜观察凝胶内生死细胞的分布。

结果如图2所示。在该双重染色法中，活细胞的细胞质被钙黄绿素AM(Calcein-AM)染成绿色，死细胞的细胞核染成红色。用盲曹鱼鳞来源胶原蛋白(BC)、盲曹鱼皮来源胶原蛋白(BC-S)、罗非鱼鳞来源胶原蛋白(TC)、猪腱来源胶原蛋白(CMT)培养的细胞均被染成绿色，可知其是存活的。

(3)基于染色的凝胶内细胞的细胞骨架观察

将在上述的3.(1)中培养了7天的细胞被包埋的凝胶使用DPBS(-)(富士胶片和光纯药株式会社制造)进行清洗。之后，加入0.1％的吐温(Triton)X100(西格玛奥德里奇公司制造)，在室温下静置30分钟后，再次用DPBS(-)清洗。加入100mM的Acti-Stain 488(商品名，Cytoskelton制造)，遮光且在室温环境下静置60分钟，用DPBS(-)清洗，染色。然后，用共聚焦激光显微镜观察凝胶内部的细胞骨架的形状。

其结果如图3所示。在该染色法中，作为细胞骨架的纤维(f肌动蛋白)被染成绿色，可以观察到细胞形态。用盲曹鱼鳞来源胶原蛋白(BC)、猪腱来源胶原蛋白(CMT)培养的细胞呈纺锤形地大幅度伸展，与此相对，用盲曹鱼皮来源胶原蛋白(BC-S)、罗非鱼鳞来源胶原蛋白(TC)培养的细胞不常见伸展，支承细胞形态的肌动蛋白纤维散乱，细胞形态变圆。这表明，盲曹鱼鳞来源胶原蛋白特异性地提高细胞粘附性，具有维持细胞形态的效果。