血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质制备方法

摘要

本发明提供了一种血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质制备方法，包括以下步骤：(1)搜集临床新鲜无黄疸、乳糜、溶血的血清进行传染病筛查，选择筛查结果为阴性的血清，混合在一起，备用；(2)血清放置在‑20℃环境下，反复冻融，再用滤膜过滤，除去血清冻融后产生的沉淀物；(3)检测血清维生素A和维生素E含量，再添加适量维生素A和维生素E标准储备液；(4)加入抗氧剂、赋形剂、防腐剂，搅拌至完全溶解；(5)用安瓿瓶进行分装，然后将血清冷冻干燥制备成冻干粉，再在安瓿瓶内充入氮气并熔封，得到均匀性良好、稳定性良好、无需保存在‑70℃低温下的血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种血清型冻干粉维生素A和E质量控制物质制备方法。

背景技术

维生素A和维生素E是维持正常生命活动所必需的脂溶性维生素。

维生素A又叫视黄醇(retinol)，天然存在的维生素A有两种类型：维生素A1(视黄醇)与维生素A2(3-脱氢视黄醇)。维生素A1主要存在于海产鱼肝脏中，维生素A2主要存在于淡水鱼，A2的活性仅为A1的40％。植物中的胡萝卜素具有与维生素A相似的化学结构，能在体内转化为维生素A。维生素A的食物来源：一是动物性食物，以动物肝脏、未脱脂乳和乳制品及蛋类的含量较高；二是植物性食物，以绿色、红黄色蔬菜的含量最多，如菠菜、韭菜、豌豆苗、红心甘薯、胡萝卜、青椒和南瓜等。

维生素A具有重要的生理功能，主要包括：(1)维持视网膜的正常功能：维生素A与视网膜的红色色素形成视紫素，视紫素是眼睛在稍暗状况下看物体的必要因素；(2)酶系统的重要辅助因子；(3)促进骨骼、牙齿生长和再生；(4)有助于皮肤、头发、粘膜的健康生长；(5)增加人体对呼吸道感染的抵抗力；(6)睾丸功能、卵巢功能、胚胎形成、成长调节及人体组织分化等的必要要素。当人体缺乏维生素A时，易引起夜盲，易患呼吸道感染疾病，皮肤干且粗糙，粘膜变差，体重减轻，骨骼成长较差，牙齿珐琅质不佳，腹泻，成长缓慢等症状。

维生素E是生育酚(tocopherol)和生育三烯酚(tocotrienol)的总称，是一类天然的抗氧化剂。天然存在的维生素E有α、β、γ、δ4种生育酚和α、β、γ、δ4种生育三烯酚共8种类似物，其中以α-生育酚含量最高，活性也最高。维生素E的所有类似物均可被小肠吸收，通过乳糜微粒的形式进入血液循环并到达肝脏。肝脏中的α-TTP可以选择性的将α-生育酚转运到极低密度脂蛋白(VLDL)中储存待用；或再转运到身体的其他组织细胞，而其他维生素E类似物则很少在肝细胞中停留，多数通过胆汁、尿液或其他途径排出体外。

维生素E具有显著的抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病、提高机体免疫力等许多功能，是人类生命活动中不可缺少的维生素。

成年人食用维生素E的推荐量是10mg/天，一般认为口服高剂量维生素E的主要危害是通过抑制维生素K的吸收及提高抗血凝剂的活性而损害血液的凝固。维生素E及其酯化物能抑制存在于皮肤中的谷胱甘肽S-转移酶P1-1的活性，而缺乏这种酶的小鼠更易患皮肤肿瘤，是皮肤肿瘤产生的诱发因子。新发现的有关维生素E不利的生物学功能，使人们重新评估维生素E的安全性，避免维生素E的使用出现“越多越好”的错误倾向。

由于维生素A和维生素E具有重要的生理功能，其缺乏和过量都会对人体产生不良影响，需要对人体中的维生素A、E含量进行一个有效的测量。目前检测维生素A和维生素E的方法主要有免疫法、荧光法、HPLC法和LC-MS/MS法。其中免疫法检测周期短，自动化程度高，但目前试剂依赖进口，试剂成本高昂；荧光法是将维生素A和维生素E经过皂化处理，然后在特定波长下测量其荧光强度；HPLC法和LC-MS/MS法因仪器贵重目前在临床医院应用较少，但因其特异性强，灵敏度高，检测干扰少，测量结果准确可靠，国内已有机构在进行相关方面的研究并推动其在临床的发展应用。临床上一般采用血清或血浆来进行维生素A和维生素E的检测，无论采用哪种方法进行检测，其准确测量均需要一个均匀性、稳定性良好的质量控制物质来校准、监控仪器状态和试剂的好坏，另外，由于血清为液体，临床实验室缺少超低温保存装置，导致质量控制物质不稳定、不宜长时间保存。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术所存在的不足之处，以人血清为基质，提供一种血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质制备方法，该质量控制物质均匀性、稳定性良好，不需-70℃低温保存，可用于维生素A和维生素E试剂盒的校准品，也可作为质控品用于临床监测维生素A和维生素E检测系统的准确性和稳定性。

血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质制备方法，包括以下步骤：

(1)搜集临床新鲜无黄疸、乳糜、溶血的血清进行传染病筛查(HIV、乙肝、梅毒、丙肝)，选择筛查结果为阴性的血清，混合在一起，备用；

(2)将步骤(1)中的血清放置在-20℃环境下，反复冻融1～5次，再依次用0.45μm、0.22μm滤膜过滤，除去血清冻融后产生的沉淀物；

(3)取适量步骤(2)中过滤后的血清，检测维生素A和维生素E含量，再添加适量维生素A和维生素E标准储备液，以达到质量控制物质中维生素A和维生素E的浓度要求；

(4)向步骤(3)血清中加入抗氧剂、赋形剂、防腐剂，搅拌至完全溶解；

(5)将步骤(4)中的血清用安瓿瓶进行分装，然后将血清冷冻干燥制备成冻干粉，再在安瓿瓶内充入氮气并熔封，得到血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质。

与现有技术相比，本发明的血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质制备方法具有如下优点：本发明在血清中添加适量维生素A和维生素E标准储备液以制备不同浓度梯度的质控品和校准品，符合各种维生素A和维生素E含量的质量控制物质需求；同时，将血清冷却干燥制备成冻干粉，不需要在超低温保存装置中-70℃低温保存，即可应用于临床中；另外，在装有冻干粉的安瓿瓶内充入氮气熔封，可提高冻干粉中维生素A和维生素E的稳定性。

优选地，步骤(3)的具体操作方法为：先取适量维生素A标准储备液并用氮气吹干，再加入适量步骤(2)中过滤后的血清，边搅拌边添加适量的维生素E标准储备液，搅拌1～8h，使维生素A和维生素E溶解完全。

进一步地，血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质可制备成不同维生素A和维生素E浓度梯度的质控品，低浓度质控品中维生素A(视黄醇)的浓度范围可控制在0.3～0.7μg/mL，维生素E(±α-生育酚)的浓度范围可控制在7～13μg/mL；高浓度质控品中维生素A(视黄醇)的浓度范围可控制在0.8～1.5μg/mL，维生素E(±α-生育酚)的浓度范围可控制在14～25μg/mL。

进一步地，血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质可制备成用于维生素A和维生素E检测系统的校准品，校准品中的维生素A和维生素E浓度范围可根据不同方法配制。

优选地，维生素A和维生素E校准品优选为以下6个浓度点：

维生素A(视黄醇)：0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、15.00μg/mL；

维生素E(±α-生育酚)：5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、50.00μg/mL、150.00μg/mL、300.00μg/mL；

上述维生素A和维生素E校准品的6个浓度点的浓度值为视黄醇和±α-生育酚的混合浓度，6个浓度度为各个成分在总混合溶液中的浓度。实际工作中，维生素A和维生素E校准品的浓度可根据临床需要进行调整，浓度水平可增加也可减少。

进一步地，因维生素A和维生素E易被氧化，制备血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质时需向其中加入抗氧化剂，抗氧化剂为2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、焦亚硫酸钠中的一种或多种组合，浓度范围为0～0.5％。

进一步地，为保持血清型冻干粉维生素A和维生素E质量控制物质具有良好的外观，需向其中添加适量的多元醇类赋形剂、蛋白质类赋形剂，赋形剂为甘露醇、海藻糖、葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)中的一种或多种物质组合，浓度范围为0～7％。

进一步地，防腐剂为叠氮钠、PC-300中的一种或多种组合，浓度范围为0～1.0％。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例一

搜集无黄疸、乳糜，溶血的血清，选取其中传染病筛查结果为阴性(HIV、乙肝、梅毒、丙肝)的样本混合在一起，搅拌均匀，备用。

取上述混合血清放入-20℃，冷冻完全后取出，室温融化，完全融化后，分别用0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，得到澄清血清。取少量血清进行维生素A和维生素E检测，维生素A本底值为0.42μg/mL，维生素E本底值为7.05μg/mL，为了制备100mL血清量的维生素A和维生素E质量控制物质(维生素A目标值为0.70μg/mL，维生素E目标值为10μg/mL)，经计算，需再添加854.6μg/mL维生素A标准储备液约33μL，再添加2852.9μg/mL维生素E标准储备液约103μL。

用移液器先移取854.6μg/mL维生素A标准储备液33μL置烧杯中，氮气吹干后，加入磁力转子，添加100mL已处理好的血清，搅拌，再用移液器移取2852.9μg/mL维生素E标准储备液103μL，逐滴加入，搅拌均匀；然后再依次加入BHT 0.05g，甘露醇4.0g，叠氮钠0.05g，搅拌至完全溶解，按规格1.0mL/瓶用安瓿瓶进行分装，冷冻干燥得到冻干粉，安瓿瓶再充入氮气熔封。

实施例二

搜集无黄疸、乳糜，溶血的血清，选取其中传染病筛查结果为阴性(HIV、乙肝、梅毒、丙肝)的样本混合在一起，搅拌均匀，备用。

取上述混合血清放入-20℃，冷冻完全后取出，反复冻融2次，用0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，得到澄清血清。取少量血清进行维生素A和维生素E检测，维生素A本底值为0.40μg/mL，维生素E本底值为6.95μg/mL，为了制备100mL血清量的维生素A和维生素E质量控制物质(维生素A目标值为0.50μg/mL，维生素E目标值为12μg/mL)，经计算，需再添加854.6μg/mL维生素A标准储备液约12μL，再添加2852.9μg/mL维生素E标准储备液约177μL。

用移液器先移取854.6μg/mL维生素A标准储备液12μL置烧杯中，氮气吹干后，加入磁力转子，添加100mL已处理好的血清，搅拌，再用移液器移取2852.9μg/mL维生素E标准储备液177μL，逐滴加入，搅拌均匀；然后再依次加入BHT 0.05g，TBHQ 0.01g，BSA 4.0g，PC-300 0.02mL，搅拌至完全溶解，按规格0.5mL/瓶用安瓿瓶进行分装，冷冻干燥得到冻干粉，安瓿瓶再充入氮气熔封。

实施例三

搜集无黄疸、乳糜，溶血的血清，选取其中传染病筛查结果为阴性(HIV、乙肝、梅毒、丙肝)的样本混合在一起，搅拌均匀，备用。

取上述混合血清放入-20℃，冷冻完全后取出，反复冻融4次，用0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，得到澄清血清。取少量血清进行维生素A和维生素E检测，维生素A本底值为0.35μg/mL，维生素E本底值为6.90μg/mL，为了制备100mL血清量的维生素A和维生素E质量控制物质(维生素A目标值为0.60μg/mL，维生素E目标值为11μg/mL)，经计算，需再添加854.6μg/mL维生素A标准储备液约29μL，再添加2852.9μg/mL维生素E标准储备液约144μL。

用移液器先移取854.6μg/mL维生素A标准储备液29μL置烧杯中，氮气吹干后，加入磁力转子，添加100mL已处理好的血清，搅拌，再用移液器移取2852.9μg/mL维生素E标准储备液144μL，逐滴加入，搅拌均匀；然后再依次加入TBHQ 0.03g，海藻糖2.0g，叠氮钠0.03g，搅拌至完全溶解，按规格1.0mL/瓶用安瓿瓶进行分装，冷冻干燥得到冻干粉，安瓿瓶再充入氮气熔封。

测试例一

维生素A和维生素E质量控制物质均匀性测试

取维生素A和维生素E质量控制物质冻干粉，随机抽取10瓶，规格为1.0mL/瓶，准确加入1.0mL纯化水，并用液相色谱法进行检测，计算维生素A和维生素E的浓度及均值、SD等，结果如表1所示。

表1维生素A和维生素E质量控制物质均匀性考察(单位：μg/mL)

将上述质量控制物质任取3瓶混匀，连续测定10次，计算维生素A和维生素E测量结果的均值、SD，结果如表2所示。

表2维生素A和维生素E质量控制物质3瓶混匀后测量结果

按照下列公式计算瓶间重复性CV

当S

式中：

测试例二

儿茶酚胺类物质及其代谢物质量控制物质加速稳定性测试

取该质量控制物质冻干粉6瓶，规格：1.0mL/瓶，放37℃水浴中，经3天、5天、7天后分别取出2瓶，复溶，对维生素A和维生素E进行检测，每瓶检测2次，结果与表1中均值比较，结果详见表3。

表3 37℃水浴加速稳定性考察结果(单位μg/mL)

从表3的数据可看出，本实施例制备的维生素A和维生素E质量控制物质在37℃水浴加速考察7天后与靶值相比偏倚在±15％以内，表明本实施例该质量控制物质质量稳定并可存放较长时间(2～8℃可存放1年)。

以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体方法允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。