基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用

摘要

本发明属于传感器领域，涉及分裂型适体传感器，特别是指基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用。本申请基于能量转移原理，利用纳米金淬灭FAM荧光基团；结合分裂型核酸适体识别机制，构建了一种基于纳米金的高灵敏分裂型适体传感器。对传感器制备条件进行实验优化，如AuNPs与P2的结合过程中的柠檬酸钠用量、AuNPs与P2的比例、工作溶液的稳定时间等。利用优化后的工作溶液检测ATP，结果表明该传感器检测范围为30pmol/L到15 nmol/L，高灵敏线性检测范围为30pmol/L到3330pmol/L，检出限为30pmol/L，且具有良好的特异性，是一种极具应用潜力的分裂型适体传感器。

说明书

技术领域

本发明属于传感器领域，涉及分裂型适体传感器，特别是指基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用。

背景技术

三磷酸腺苷(triphosadenine，ATP)是生物体内各种生命活动能量的直接来源，在生化反应和药物分析中起着关键的作用。常见的心血管病、帕金森综合征和阿尔兹海默症都与ATP浓度密切相关，检测ATP浓度在病理和生命科学研究中具有重要意义。传统检测ATP的方法主要依赖于昂贵的仪器设备，如高效液相色谱法、同位素示踪法等，虽然灵敏度较高，但样品制作要求高，实验操作繁琐，仪器昂贵等缺点限制了其推广应用。

核酸适体（aptamer）是指经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段（RNA或DNA），具有易合成、易标记、性质稳定、没有免疫源性和毒性等优势。适配体与靶标结合后，其构象通常发生显著变化，形成发夹、茎环、假结或膨出结构，利用核酸适体与靶标结合后构象变化或结构修饰，结合荧光分析技术的高灵敏性可设计多种荧光适体传感器。但是在复杂的基质中，结构的改变容易受到一些干扰因素的影响，可能产生虚假的阳性或非特异性信号，影响传感器的特异性和灵敏度。为此，Stojanovic等在提出了一种分裂型核酸适体的方法，将核酸适体分裂为两个片段P1和P2，在靶目标存在的情况下形成P1-靶标-P2三明治结构。由于这两个独立的寡核苷酸片段缺乏二级结构，因此不会产生假阳性或非特异性信号。利用分裂型适体设计荧光传感器的方法有很多，You等和Jiang等利用氧化石墨烯或碳纳米管作为淬灭剂，淬灭P1上修饰的荧光信号；加入P2与靶标后，形成P1-靶标-P2三明治结构，荧光恢复，根据恢复荧光信号的多少可测量加入靶标的浓度，ATP检出限为20μmol/L，茶叶碱的检出限为155nmol/L、4nmol/L。Wang M利用纳米金淬灭荧光恢复检测ATP的检出限为5μmol/L。还有人利用无标记的方式结合分裂型适体检测ATP，检出限最低为2.67 nmol/L；将DNA分子设计与核酸外切酶等与分裂型适体结合检测ATP，检出限为1-30μmol/L。分析以上研究发现，分裂型核酸适体检测ATP的检出限一般比较高，不利于低浓度的ATP检测，这是由于核酸适体分裂后，特异性增强，但其与靶标分子的亲和力相对减弱，浓度过低时，由于空间位阻作用，难以将溶液中微量的ATP分子捕获。有研究者通过多种分子修饰（ATP检出限2.4 nmol/L）、化学过程变化（ATP检出限0.02nmol/L）等增强反应过程，有效降低了分裂型适体传感器的检出限，但传感器制备过程复杂，操作难度高且相对成本较高。

发明内容

为解决上述技术难题，本发明提出一种基于纳米金的分裂型适体传感器及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于纳米金的分裂型适体传感器的制备方法，步骤如下：

（1）将核苷酸链P2加入Tris-HCl溶液中反应2h进行激活，得P2溶液；

（2）向P2溶液中加入AuNPs，常温反应20min后，再加入柠檬酸钠溶液并在37℃恒温振荡培养3 h，再离心取底液即得到AuNPs@P2耦合物；

（3）向AuNPs@P2耦合物中加入核苷酸链P1，室温培养2h，即得基于纳米金的分裂型适体传感器工作液。

优选的，所述步骤（1）中，核苷酸链P2的序列如5′-TGCGGAGGAAGGT-(CH

进一步，所述步骤（1）中，Tris-HCl溶液的pH=7、浓度为10 mmol/L，P2溶液的浓度为5 μmol/L。

优选的，所述步骤（2）中，AuNPs的浓度为1 nmol/L，柠檬酸钠溶液的浓度为500mmol/L、pH=5。

进一步，所述P2溶液、AuNPs和柠檬酸钠溶液的体积比为20:8:1。

进一步，所述步骤（2）中，离心的条件为14000 r/min离心15min。

优选的，所述步骤（3）中，核苷酸链P1的序列如5′-FAM-ACCTGGGGGAGTAT-3′所示，AuNPs@P2耦合物与核苷酸链P1的物质的量比为1:1。

上述制备方法所制备的分裂型适体传感器。

所述的分裂型适体传感器在非疾病的诊断和治疗中检测三磷酸腺苷中的应用。

步骤为：向工作液中加入20μL待测样品用500 mmol/LTris-HCl缓冲液将溶液的总体积定容至600 μL，利用荧光分光光度计对含有ATP的AuNPs@P2-ATP-P1复合物进行荧光检测，将荧光强度代入线性回归方程Y=66.54-7.31X，相关系数R=0.99，即可得到待测样品的浓度。

本申请传感器的检测原理为：ATP核酸适体被分裂为两个片段P1和P2。P2的3’端修饰巯基，采用低pH法修饰在纳米金表面；P1的5’端修饰荧光基团FAM。未加入被测物ATP时，P1与P2因碱基互斥作用，不结合，荧光基团FAM远离纳米金，荧光信号较强；加入ATP后，P1和P2和ATP发生特异性结合形成一种“AuNPs@P2-ATP- P1@FAM”三明治结构，拉近了FAM与纳米金之间的距离，由于能量转移现象，荧光信号相对减弱，减弱光强与加入ATP浓度成正比，故测量荧光信号减少的多少即可推算加入ATP的浓度。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请利用纳米金作为淬灭剂，结合分裂型ATP核酸适体识别机制，设计了一种检出限低，操作简单的荧光适体传感器，实现了低浓度ATP的精确检测。

2、本申请基于能量转移原理，利用纳米金淬灭FAM荧光基团；结合分裂型核酸适体识别机制，构建了一种基于纳米金的高灵敏分裂型适体传感器。对传感器制备条件进行实验优化，如AuNPs与P2的结合过程中的柠檬酸钠用量、AuNPs与P2的比例、工作溶液的稳定时间等。利用优化后的工作溶液检测ATP，结果表明该传感器检测范围为30pmol/L到15 nmol/L，高灵敏线性检测范围为30pmol/L到3330pmol/L，检出限为30pmol/L，且具有良好的特异性，是一种极具应用潜力的分裂型适体传感器。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于纳米金的分裂型适体传感器检测ATP原理图。

图2为加入ATP前后工作溶液的荧光光谱。

图3为柠檬酸钠用量不同时，工作溶液的荧光光谱图和荧光强度变化曲线。

图4为环境溶液pH值改变时，FAM的荧光光谱图和荧光强度变化曲线。

图5为AuNPs与P2比例不同时，工作溶液的荧光光谱图和荧光强度变化曲线。

图6为稳定时间不同时，工作溶液的荧光光谱图和荧光强度变化曲线。

图7为加入不同浓度ATP(0.03-15nmol/L)时，工作溶液的荧光光谱和荧光强度变化曲线。

图8为ATP的特异性检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料

F-7000 荧光分光光度计（日本HITACHI公司）；电子天平和PE-20K pH 计（瑞士METTLER TOLEDO公司）；HZQ-F200恒温振荡培养箱（北京东联海尔仪器有限公司）；07HWS-2数显恒温磁力搅拌机（杭州仪表电机有限公司）；Eppendorf 离心机5418（德国EppendorfAG公司）。

三(2-羧乙基)膦（TCEP）、三磷酸腺苷二钠、20nm 纳米金颗粒（AuNPs）、二水柠檬酸三钠、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCL）均购买于上海生工生物工程股份有限公司。NaCl、MgCl

P1（ATP P1）:5′-FAM-ACCTGGGGGAGTAT-3′

P2（ATP P2）:5′-TGCGGAGGAAGGT-(CH

实验原理与可行性

基于纳米金的分裂型适体传感器检测ATP原理如图1。ATP核酸适体被分裂为两个片段P1和P2。P2的3’端修饰巯基，采用低pH法修饰在纳米金表面；P1的5’端修饰荧光基团FAM。未加入被测物ATP时，P1与P2因碱基互斥作用，不结合，荧光基团FAM远离纳米金，荧光信号较强；加入ATP后，P1和P2和ATP发生特异性结合形成一种“AuNPs@P2-ATP- P1@FAM”三明治结构，拉近了FAM与纳米金之间的距离，由于能量转移现象，荧光信号相对减弱，减弱光强与加入ATP浓度成正比，故测量荧光信号减少的多少即可推算加入ATP的浓度。

实施例1

基于纳米金的分裂型适体传感器的制备方法，步骤如下：

将5 μmol/L的修饰有巯基的P2在10 mmol/L、pH=7的Tris-HCl反应2 h激活。取20μL、5 μmol/L的P2溶液，加入8 μL、1 nmol/L的AuNPs，常温反应20 min之后，加入1 μL、500mmol/L、pH=5的柠檬酸钠溶液并在37℃恒温振荡培养3 h，将适体P2与纳米金通过Au-S键结合。再以14000 r/min的转速离心15min去除多余的P2链，取底液即可得到AuNPs@P2耦合物。在AuNPs@P2耦合物中加入20 μL、5 μmol/L的修饰有荧光基团FAM的分裂型适体P1，常温培养2 h即可得到传感器工作溶液，可在4℃储存备用。

ATP的检测：取上述工作溶液6份，分别加入20μL浓度分别为1nmol/L、15nmol/L、65nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、450nmol/L的ATP，用500 mmol/LTris-HCl缓冲液将溶液的总体积定容至600 μL，利用荧光分光光度计对含有以上不同浓度ATP的AuNPs@P2-ATP-P1复合物进行荧光检测即可得到传感器的检测范围。

分别检测加入ATP前后传感器工作溶液的荧光信号强度，如图2。曲线1为未加入ATP时的荧光光谱图，曲线2-3分别为加入0.33nmol/L和0.67nmol/L后的荧光光谱图。由图可见，加入ATP后，工作溶液的荧光信号出现了明显淬灭，且随着加入ATP浓度的增加，淬灭现象越明显，验证了传感器的可行性。

实施例2

基于纳米金的分裂型适体传感器的制备方法，步骤如下：

本实施例的制备步骤与实施例1相同，仅对柠檬酸钠溶液的加入体积进行调整，分别加入0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL体积的500 mmol/L、pH=5的柠檬酸钠溶液，制备得到初始荧光强度不同的工作溶液，如图3。随着柠檬酸钠含量的增加，工作溶液初始荧光强度呈现先增强后减少的趋势，如图3（b）。这是由于柠檬酸钠用量过少时，无法形成合适的低pH溶液环境，短时间内Au-S 键结合较少，导致部分AuNPs表面呈裸露状态。单链碱基P1易吸附于纳米金表面，拉近FAM与AuNPs之间的距离，从而发生从FAM 到AuNPs表面的能量转移，导致荧光淬灭。随着柠檬酸钠用量的增加，荧光淬灭现象逐渐减少，故工作溶液荧光强度呈增强趋势。当柠檬酸钠用量过多时，溶液pH过低，FAM自身荧光信号受pH影响会逐渐降低。如图4所示，FAM本身浓度不变时，其荧光强度随环境溶液pH值的减小而显著降低。综合考虑AuNPs和P2的结合效果和FAM本身的荧光特性，实验选择柠檬酸钠用量为1 μL时最佳。

实施例3

基于纳米金的分裂型适体传感器的制备方法，步骤如下：

本实施例的制备步骤与实施例1相同，保持P2浓度不变，仅调节AuNPs的体积从1μL增加到15μL，制备了AuNPs与P2比例不同的工作溶液，其初始荧光光谱如图5（a），峰值变化如图5（b）。由图可知，随着AuNPs浓度的增加，工作溶液光强呈现先增加后减小的趋势。在AuNPs体积为8μL时，工作溶液荧光信号最强。分析其原因可知，当AuNPs浓度小于8μL时，工作溶液荧光强度随AuNPs浓度的增加而增强，这是由于当AuNPs浓度过低时，单个AuNPs上可修饰大量的P2，AuNPs表面几乎被P2链完全包围；此时，工作溶液中荧光信号来源于游离的P1上修饰的FAM，AuNPs与P1互相影响很小，P1浓度不变，故工作溶液荧光强度变化很小，如图5（b）中1μL和4μL样品所示。当AuNPs浓度继续增加，部分AuNPs表面未被P2覆盖而裸露出来，吸引单链P1靠近AuNPs表面。但P1与P2链中均含有大量的碱基G，两条链之间的斥力会使P1远离AuNPs。当对P1的引力与斥力达到一定平衡时，P1可能会与AuNPs之间保持一定的距离，导致部分AuNPs对FAM产生金属增强荧光效应，工作溶液荧光信号强度增强，如图5（b）中4μL和8μL样品所示。当AuNPs浓度增加更多，AuNPs表面对P1的引力大于P2对其的斥力，多数P1会靠近AuNPs，使FAM与AuNPs发生能量转移而淬灭，如图5（b）中8μL、12μL、15μL样品所示。故传感器制备过程中保持P2浓度不变时，AuNPs体积应取8 μL。

实施例4

基于纳米金的分裂型适体传感器的制备方法，步骤如下：

本实施例的制备步骤与实施例1相同，在ATP的检测中，对不同的稳定时间进行检测，加入P1后，每隔10分钟工作溶液的荧光光谱，结果如图6，工作溶液的荧光强度随着时间的增加呈先上升后趋于稳定的趋势，在90min附近荧光较强且基本保持不变。故传感器制备过程中，加入P1后工作溶液的稳定时间选择为90min。

应用例

灵敏度实验：

利用实施例1的工作液的制备方法得到的工作溶液，加入20μL浓度分别为1 nmol/L、15 nmol/L、65 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、450 nmol/L的ATP溶液，用Tris-HCl缓冲液定容至600μL测试荧光光谱，如图7（a）。以ATP浓度为横坐标，不同浓度下荧光峰值为纵坐标作图，如图7（b）。随着ATP浓度的增加，AuNPs@P2-ATP- P1@FAM”三明治结构生成量增多，反应体系荧光强度不断下降，测量范围为30pmol/L到15 nmol/L，检出限为30pmol/L。其中0.03nmol/L到3.33nmol/L范围内，荧光强度与ATP浓度的线性回归方程为Y=-7.31X+66.54 (Y为荧光强度，X为ATP浓度)，相关系数R=0.99，检测灵敏度相对较高。3.33nmol/L到15nmol/L范围内线性回归方程为Y= -1.56X+47.58，相关系数R=0.99，检测灵敏度相对较低。

特异性实验：

为分析分裂型适体传感器的特异性，在实施例1制备的工作溶液中分别加入20 μL、65 nmol/L的葡萄糖、钠离子、钾离子、镁离子、UTP、GTP、CTP和ATP溶液，用Tris-HCl缓冲液定容至600μL测试荧光光谱。测量加入被测物前后其荧光峰值变化（F表示加入被测物前的荧光强度，F0表示加入被测物后的荧光强度）。实验结果如图8所示，与ATP相比，葡萄糖、钠离子、钾离子、镁离子、UTP、GTP和CTP等被测物加入后工作溶液荧光峰值变化量较小，说明该分裂型适体传感器对ATP有良好的特异性。

实施效果分析

AuNPs上修饰DNA链主要有两种方法：盐老化法和低pH法。为了减少传感器制备时间，实验选择低pH法进行DNA修饰。柠檬酸钠还原法制备的AuNPs表面带负电

工作溶液中当AuNPs浓度过高时，过量的AuNPs表面会吸附单链P1，使FAM与AuNPs距离过近发生能量转移，产生荧光淬灭，此时工作溶液的初始荧光信号会大幅下降，影响传感器的测量信号强度与检测灵敏度。为优化工作溶液中AuNPs与P2的比例，传感器制备过程中保持P2浓度不变时，AuNPs体积应取8 μL。

AuNPs@P2耦合物不发光，工作溶液中的荧光信号来源于P1上修饰的FAM。在AuNPs@P2耦合物中加入P1可得到工作溶液，但其荧光信号稳定需要一定的时间，为减少传感器制备时间，该稳定时间应尽量少。经试验验证传感器制备过程中，加入P1后工作溶液的稳定时间选择为90min。

基于能量转移原理，利用纳米金淬灭FAM荧光基团；结合分裂型核酸适体识别机制，构建了一种基于纳米金的高灵敏分裂型适体传感器。对传感器制备条件进行实验优化，如AuNPs与P2的结合过程中的柠檬酸钠用量、AuNPs与P2的比例、工作溶液的稳定时间等。利用优化后的工作溶液检测ATP，结果表明该传感器检测范围为30pmol/L到15 nmol/L，高灵敏线性检测范围为30pmol/L到3330pmol/L，检出限为30pmol/L，具有良好的特异性，是一种极具应用潜力的分裂型适体传感器。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。