技术领域
本发明属于天然产物提取和中药制剂领域，涉及灵芝孢子的加工利用技术领域，具体涉及一种对胃黏膜有保护作用的灵芝孢子油及其制备方法
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.exFr.)Karst.)为多孔菌科真菌灵芝中的一种(中国药典2015版一部)，味甘性平，扶正固本。灵芝孢子粉为灵芝子实体生长成熟期所产生的生殖细胞灵芝孢子的集合。含有不饱和脂肪酸类，甾醇类，三萜类，生物碱类，内酯，蛋白质和氨基酸，糖肽以及无机盐。
胃肠道是不仅是人体的重要消化器官，也是人体最大的免疫系统。发挥着消化和吸收营养物质等功能的同时还防御外界刺激，保护机体免受细菌、毒素、药物等有害物质的侵袭。临床上多种胃肠道疾病的发展均可能会对胃肠黏膜上皮造成破坏，进而可能发展为炎症性肠病等重大的肠胃疾病。在胃腔和胃黏膜间隙之间存在一道十分严密的屏障，称为胃黏膜屏障，它是由上皮顶部细胞膜和相邻细胞间的紧密连接构成的。在正常情况下，此屏障可阻止胃腔中的H
超临界二氧化碳萃取技术是指在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小，沸点高低和分子量大小的成分萃取出来.同时超临界二氧化碳的密度，极性和介电常数随着密闭体系压力的增加而增加，利用升压可将不同极性的成分进行分步提取。通过控制条件得到混合成分，然后借助减压，升降温的方法使超临界二氧化碳变成气体，被萃取物质则自动完全析出，从而达到分离提纯的目的，并将萃取与分离两过程合为一体。
专利“一种治疗肠胃疾病的药物组合物及其应用”(CN110841027)以山苍子油 10～30份、云麻油20～40份、亚麻籽油10～30份、沙棘油10～30份、阳春砂仁 10～30份、枸杞籽油5～15份、灵芝孢子油5～15份按一定比例配制成组合物，复方组合导致其真正发挥功效的活性成分不明确。同时药理结果表明：与正常组相比，胃黏膜呈浅红色，表面有少许苔状物，证明胃黏膜仍受到一定损害，说明该组合物未完全发挥配方中灵芝孢子油保护胃黏膜的作用，该专利并未提供组合物对乙醇导致症状的延缓作用。
专利“一种可以解酒的油类混合物“(CN103211856A)以大豆油50-60％，鹿油 10-15％，灵芝孢子油10-15％，菜籽油10-20％按一定比例配制成混合物，复方组合导致其真正发挥功效的活性成分不明确；该专利只提供混合物对乙醇导致症状的延缓作用，并未提供混合物对胃黏膜的药理作用。
常规超临界萃取所使用的设备如图1所示，其生产过程通常是在萃取釜Ⅰ1-1 中进行超临界萃取，萃取釜Ⅰ上设计有开关阀门V1、V2，将原料与目标产物分离，超临界流体夹杂着目标产物和杂质到达分离釜Ⅰ2-1，在特定的压力和温度下，目标产物和一部分杂质在超临界流体的溶解度下降，被分离沉降到分离釜Ⅰ2-1底部，分离釜Ⅰ有微调阀门F1、收集阀门C1，其他杂质被超临界流体带到分离釜Ⅲ2-3，在特定的压力和温度下，超临界流体成为气态，剩余杂质被分离沉降到分离釜Ⅲ的底部，分离釜Ⅲ有微调阀门F2、收集阀门C3。气态流体通过开关阀门V7后，经热交换器Ⅱ3-2在一定压力和温度下转变为液态回到储罐4中，储罐中的液态流体通过开关阀门V8经高压泵5、开关阀门V6和热交换器Ⅰ3-1转变为超临界流体进入萃取釜Ⅰ再次进行超临界萃取。
常规超临界萃取的设备只适用于单次的萃取，若要对分离釜Ⅰ中的粗产物进行第二次萃取，则需要打开萃取釜Ⅰ，将分离釜Ⅰ中的粗产物倒入，不利于生产的连贯性，不仅增加了操作时间，还容易造成分离釜Ⅰ中的粗产物被空气氧化或有被污染的可能。
发明内容
本发明的目的在于克服上述灵芝孢子油产品存在的缺陷，提供一种对胃黏膜有保护作用的灵芝孢子油及其制备方法。
本发明采用的技术方案为制备一种对胃黏膜有保护作用的灵芝孢子油，其要点是它是由超临界二氧化碳双重萃取技术提取灵芝孢子粉得到的，灵芝孢子油酸价≤2 KOH(mg/g)，过氧化值≤0.1％。
灵芝孢子油可延缓乙醇(0.1mL/10g)导致的行动变缓，肢体活动不协调，呼吸加深、频率减慢等症状的出现时间，延缓时间为20min；灵芝孢子油可显著降低的乙醇(0.1mL/10g)导致胃出血或溃疡等胃黏膜损伤；灵芝孢子油可显著降低消炎痛(40mg/kg)导致的胃出血或溃疡等胃黏膜损伤。
所述的超临界二氧化碳双重萃取技术是指：第一次萃取使用超临界二氧化碳萃取技术提取灵芝孢子粉得到灵芝孢子原油，第二次萃取为使用第一次萃取提到的灵芝孢子原油再使用超临界二氧化碳萃取技术纯化灵芝孢子原油得到灵芝孢子油。
本发明创造性地将破壁灵芝孢子粉进行超临界二氧化碳双重萃取，破壁灵芝孢子粉只经一次超临界二氧化碳萃取，无法完全分离灵芝孢子油中的塑化剂、游离羧酸、过氧化物和其他杂质等。得到的具有活性成分的灵芝孢子油含有一定量的游离羧酸、过氧化物、色素和其他杂质，导致灵芝孢子油酸价和过氧化值相对偏高，孢子油中时常也会有塑化剂残留，同时药理活性也受到影响。若以纯化工艺参数直接提取破壁灵芝孢子粉，则灵芝孢子油得率偏低，成本极高。
一种用于制作上述对胃黏膜有保护作用的灵芝孢子油的超临界双重萃取纯化分离设备，它包括萃取釜Ⅰ、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅲ、热交换器Ⅰ、热交换器Ⅱ、储罐、高压泵、微调阀门F、收集阀门C、开关阀门V和控制系统，由控制系统控制各部件的工作状态，其要点在于，还具有萃取釜Ⅱ、回收管道、分离釜Ⅱ，萃取釜Ⅰ和萃取釜Ⅱ共用流体进入管路，流体通过开关阀门V1进入萃取釜Ⅰ、通过V4进入萃取釜Ⅱ，回收管道连接于分离釜Ⅰ与萃取釜Ⅱ之间，萃取釜Ⅱ通过开关阀门V3与分离釜Ⅱ的微调阀门F4相接，从而与分离釜Ⅱ相通，分离釜Ⅱ通过微调阀门F3与分离釜Ⅲ相接，分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ分别与分离釜Ⅲ相接。
所述灵芝孢子油的制备过程为：采收成熟的灵芝孢子，集合成粉，筛除杂质，烘干至水分3％以下，破壁，然后取一定重量的破壁灵芝孢子粉，投入到超临界萃取装置的萃取釜Ⅰ中，密封，通入超临界二氧化碳，进行第一次超临界萃取：萃取釜Ⅰ压力20～30MPa，萃取釜Ⅰ温度40～50℃，分离釜Ⅰ压力8MPa，分离釜Ⅰ温度Ⅰ 40～50℃，分离釜Ⅲ压力5～6MPa，分离釜Ⅲ温度40～50℃，流量550～650L/h，提取时间5-7h，从分离釜Ⅰ得到灵芝孢子原油，将灵芝孢子原油回收输送到萃取釜Ⅱ中，通入超临界二氧化碳，进行第二次超临界萃取：萃取釜Ⅱ压力20～30MPa，萃取釜Ⅱ温度40～50℃，分离釜Ⅱ压力10～15MPa，分离釜Ⅱ温度40～50℃，分离釜Ⅲ压力5～6MPa，分离釜Ⅲ温度40～50℃，流量550～650L/h，提取时间5-7 h，从分离釜Ⅱ得到灵芝孢子油。
本发明是在现有常规超临界萃取设备的基础上进行改进，增加了萃取釜Ⅱ、回收管道、分离釜Ⅱ，将分离釜Ⅰ与萃取釜Ⅱ之间通过回收管道连接，分离釜Ⅰ中的得物直接通过回收管道进入萃取釜Ⅱ，有利于自动化生产，省时、高效，有效地防止第一次萃取分离釜Ⅰ中的得物在移动过程中氧化或被污染，萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ共用分离釜Ⅲ、热交换器、流体储罐、高压泵以及各部件相通的管路及阀门等，比两套独立的超临界萃取设备节省成本和占地空间。
进一步设计：萃取釜Ⅰ通过开关阀门V2、萃取釜Ⅱ通过开关阀门V3、分离釜Ⅰ通过微调阀门F1、分离釜Ⅱ通过微调阀门F4共同接于连通管道，控制系统控制开关阀门V1、V2、微调阀门F1、F2同时开启，此时，开关阀门V4、V3、微调阀门F3、 F4处于关闭状态，反之，开关阀门V4、V3、微调阀门F4、F3同时开启，控制开关阀门V1、V2、微调阀门F1、F2处于关闭状态。
萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ的排出共用一条连通管道，生产过程中萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ不同时工作，萃取釜Ⅰ工作时，与萃取釜Ⅱ工作相关的阀门关闭，萃取釜Ⅰ工作完成后，关闭萃取釜Ⅰ工作阀门，打开开关阀门V5，使第一次萃取分离釜Ⅰ中的得物进入萃取釜Ⅱ，完成后，打开萃取釜Ⅱ相关的阀门，萃取釜Ⅱ进入工作状态。
更好的设计：萃取釜Ⅰ通过开关阀门V2与萃取管道Ⅰ相接，并通过萃取管道Ⅰ与分离釜Ⅰ的微调阀门F1相接，从而与分离釜Ⅰ相通，萃取釜Ⅱ通过开关阀门V3 与萃取管道Ⅱ相接，并通过萃取管道Ⅱ与分离釜Ⅱ的微调阀门F4相接，从而与分离釜Ⅱ相通,开关阀门V1、V2、微调阀门F1、F2同时开启或关闭，开关阀门V4、V3、微调阀门F3、F4同时开启或关闭，其状态由控制系统控制。
将萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ的排出通往分离釜的管道独立设置，使萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ可同时工作，省时，有利于工业化生产。
萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ、微调阀门F、开关阀门V和管道耐压要达到50MPa；分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ、分离釜Ⅲ、收集阀门C耐压要达到20MPa；储罐耐压要达到10MPa；高压泵的升压要能达到50MPa。
所述的灵芝孢子油加上医学、药学或食品工业许可的辅料可制成胃黏膜口服制剂。
所述的胃黏膜口服制剂可作为食品、保健食品或药品。
所述的的灵芝孢子油作为食品、保健食品或药品的原料时，可使胃黏膜口服制剂具有保护胃黏膜、防治胃黏膜损伤溃疡、出血的功效。
所述的胃黏膜口服制剂包括，但不限于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸或口服液体制剂。
所述的灵芝孢子粉为中华人民共和国药典2020版一部所收录的多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.的孢子的集合。
本发明采用的技术方案，采用精心的工艺设计，经反复多次的试验，采用特定的工艺参数，其有益效果为：
1.本发明使用的超临界二氧化碳双重萃取技术：在第一次使用超临界二氧化碳技术提取灵芝孢子粉得到灵芝孢子原油，而后进行第二次萃取纯化灵芝孢子原油，得到富集对胃黏膜具有保护作用的活性成分的灵芝孢子油。双重萃取可克服超临界二氧化碳技术不能直接精准分离灵芝孢子粉所含的灵芝孢子油中的特定活性成分的缺点，可对灵芝孢子原油进行精准分离，除去杂质，富集活性成分；双重萃取利用的是同一套超临界设备，相比其他如超临界与分子蒸馏等设备和技术的联用，可有效降低设备成本，简化工艺，节省时间；超临界二氧化碳萃取技术是可通过有机认证的提取工艺，可使灵芝孢子油得到有机认证。
2.本发明的灵芝孢子油酸价≤2KOH(mg/g)，过氧化值≤0.1％；品质稳定，指标远低于GB 2716食品安全国家标准植物油的规定(酸价≤4KOH(mg/g)，过氧化值≤0.25％)；同时未检出邻苯二甲酸酯残留；
3，本发明使用不饱和脂肪酸为标志性成分筛选药理实验样品，发现灵芝孢子油在不饱和脂肪酸总含量上大于灵芝孢子原油，同时也大于使用超临界三重萃取技术得到灵芝孢子三重萃取油。本发明的灵芝孢子油在药理活性和制备功能食品，保健食品和药品上具有极大潜力。
4.本发明进一步进过药理实验证明灵芝孢子油可延缓乙醇(0.1mL/10g)导致的行动变缓，肢体活动不协调，呼吸加深、频率减慢等症状的出现时间，延缓时间为20min；灵芝孢子油可显著降低的乙醇(0.1mL/10g)导致胃出血或溃疡等胃黏膜损伤；灵芝孢子油可显著降低消炎痛(40mg/kg)导致的胃出血或溃疡等胃黏膜损伤。
5.与常规超临界萃取设备相比，本发明具有以下优点和有益效果：本发明可在线进行超临界双重萃取纯化分离：在第一次萃取时能发挥超临界萃取能力，提取出高得率的粗产物；通过回收管道回到另一个萃取釜Ⅱ进行第二次萃取，利用另一个分离釜Ⅱ进行精准分离，在兼顾得率的同时得到高纯度的精准分离产物。同时由于精准分离产物未暴露在空气中氧化，活性比一次萃取的粗产物要高。
附图说明
图1是常规超临界设备示意图
图2是本发明实施例1的超临界双重萃取纯化分离设备示意图
图3是本发明实施例2的超临界双重萃取纯化分离设备示意图其中：1-1、萃取釜Ⅰ，1-2、萃取釜Ⅱ，2-1、分离釜Ⅰ，2-2、分离釜Ⅱ，2-3、分离釜Ⅲ，3-1、热交换器Ⅰ，3-2、热交换器Ⅱ，4、储罐，5、高压泵，6、回收管道，7、萃取管道Ⅰ，8、萃取管道Ⅱ，9、连通管道，F1-F4、微调阀门，C1-C3、收集阀门，V1-V8、开关阀门。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
一种对胃黏膜有保护作用的灵芝孢子油，它是由超临界二氧化碳双重萃取技术提取灵芝孢子粉得到的，双重萃取技术是指使用超临界二氧化碳萃取技术提取灵芝孢子粉得到灵芝孢子原油，为第一次萃取；再使用超临界二氧化碳萃取技术纯化灵芝孢子原油得到灵芝孢子油，为第二次萃取；
灵芝孢子油的制备过程为：采收成熟的灵芝孢子，集合成粉，筛除杂质，烘干至水分3％以下，破壁，然后取一定重量的破壁灵芝孢子粉，投入到超临界萃取装置的萃取釜Ⅰ中，密封，通入超临界二氧化碳，进行第一次超临界萃取：萃取釜Ⅰ压力 20～30MPa，萃取釜Ⅰ温度40～50℃，分离釜Ⅰ压力8MPa，分离釜Ⅰ温度Ⅰ40～ 50℃，分离釜Ⅲ压力5～6MPa，分离釜Ⅲ温度40～50℃，流量550～650L/h，提取时间5-7h，从分离釜Ⅰ得到灵芝孢子原油，将灵芝孢子原油回收输送到萃取釜Ⅱ中，通入超临界二氧化碳，进行第二次超临界萃取：萃取釜Ⅱ压力20～30MPa，萃取釜Ⅱ温度40～50℃，分离釜Ⅱ压力10～15MPa，分离釜Ⅱ温度40～50℃，分离釜Ⅲ压力5～6MPa，分离釜Ⅲ温度40～50℃，流量550～650L/h，提取时间5-7h，从分离釜Ⅱ得到灵芝孢子油。
灵芝孢子原油和灵芝孢子油的酸价检测方法为GB 5009.229食品安全国家标准食品中酸价的测定；
灵芝孢子原油和灵芝孢子油的过氧化值检测方法为GB 5009.227食品安全国家标准食品中过氧化值的测定。
灵芝孢子原油和灵芝孢子油的邻苯二甲酸酯方法为GB 5009.271食品安全国家标准食品中邻苯二甲酸酯的测定。
一种用于制作上述对胃黏膜有保护作用的灵芝孢子油的超临界双重萃取纯化分离设备
实施例1
如图2所示，本发明的萃取纯化分离设备是在常规超临界设备的基础上进行改进，添加了额外的萃取釜Ⅱ1-2、分离釜Ⅱ2-2、回收管道6、相应的微调阀门F、收集阀门C和开关阀门V，使整套设备可在线同时进行萃取，纯化和分离高得率和高纯度的精准分离产物。
即一种超临界双重萃取纯化分离设备，它由萃取釜Ⅰ1-1、萃取釜Ⅱ1-2、回收管道6、分离釜Ⅱ2-2、分离釜Ⅰ2-1、分离釜Ⅲ2-3、热交换器Ⅰ3-1、热交换器Ⅱ3-2、储罐4、高压泵5、连通管道9、微调阀门F、收集阀门C和开关阀门V和控制系统，由控制系统控制各部件的工作状态，萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ共用现有萃取纯化分离设备由分离釜Ⅲ、热交换器Ⅱ、储罐、高压泵到热交换器Ⅰ之间的设备及其连接通道。
萃取釜Ⅰ进口接有开关阀门V1，出口接有开关阀门V2；
萃取釜Ⅱ进口接有开关阀门V4，出口接有开关阀门V3；
分离釜Ⅰ接有微调阀门F1，有管道与分离釜Ⅲ相通，管道中接有微调阀门F2，接有开关阀门V5及回收管道6通往萃取釜Ⅱ，底部的接有收集阀门C1，第一次萃取分离的粗产物可从分离釜Ⅰ的收集阀门C1放出，用于检测等；
分离釜Ⅱ接有微调阀门F4；有管道与分离釜Ⅲ相通，管道中接有微调阀门F3；底部的接有收集阀门C2，第二次萃取纯化的精准分离产物从分离釜Ⅱ的收集阀门C2 放出；
分离釜Ⅲ与分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ相通，接有收集阀门C3，废弃物从分离釜Ⅲ的收集阀门C3放出，有管道与热交换器Ⅱ通，管道中接有开关阀门V7，由分离釜Ⅲ、热交换器Ⅱ、储罐4、高压泵5到热交换器Ⅰ之间通道与现有技术相同，热交换器Ⅱ与储罐4连接；储罐通过开关阀门V8与高压泵连接；高压泵通过开关阀门V6与热交换器Ⅰ连接。
流体由通过开关阀门V1进入萃取釜Ⅰ、通过V4进入萃取釜Ⅱ，回收管道连接于分离釜Ⅰ与萃取釜Ⅱ之间，萃取釜Ⅱ通过开关阀门V3与分离釜Ⅱ的微调阀门F4相接，从而与分离釜Ⅱ相通，分离釜Ⅱ通过微调阀门F3与分离釜Ⅲ相接，分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ分别与分离釜Ⅲ相接。
萃取釜Ⅰ通过开关阀门V2、萃取釜Ⅱ通过开关阀门V3、分离釜Ⅰ通过微调阀门 F1、分离釜Ⅱ通过微调阀门F4共同接于连通管道9，控制系统控制开关阀门V1、V2、微调阀门F1、F2同时开启，此时，开关阀门V4、V3、微调阀门F3、F4处于关闭状态，反之，开关阀门V4、V3、微调阀门F4、F3同时开启，控制开关阀门V1、V2、微调阀门F1、F2处于关闭状态。
萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ的排出共用一条连通管道，生产过程中萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ不同时工作，萃取釜Ⅰ工作时，与萃取釜Ⅱ工作相关的阀门关闭，萃取釜Ⅰ工作完成后，关闭萃取釜Ⅰ工作相关的阀门，打开开关阀门V5，使第一次萃取分离釜Ⅰ中的得物进入萃取釜Ⅱ，完成后，打开萃取釜Ⅱ相关的阀门，萃取釜Ⅱ进入工作状态。
萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ、微调阀门F、开关阀门V和管道耐压要达到50MPa；分离釜Ⅰ、分离釜Ⅱ、分离釜Ⅲ、收集阀门C耐压要达到20MPa；储罐耐压要达到10 MPa；高压泵的升压要能达到50MPa。其余未述部分与现有技术相同。
一种利用超临界双重萃取纯化分离设备提取产物的方法，它的操作步骤为：灵芝孢子油的制备：采收成熟的灵芝孢子，集合成粉，筛除杂质，烘干至水分3％以下，破壁，然后取100kg，记原料Ⅰ，投入到超临界萃取装置的萃取釜中，密封，打开开关阀门V1，V2，V6，V7和V8，微调阀门F1和F2，通入超临界二氧化碳，进行超临界萃取：萃取釜Ⅰ压力20MPa，萃取釜Ⅰ温度50℃，分离釜Ⅰ压力8MPa，分离釜Ⅰ温度50℃，分离釜Ⅲ压力5MPa，分离釜Ⅲ温度50℃，流量650L/h，提取时间7h，关闭开关阀门V1，V2，微调阀门F1和F2，从分离釜Ⅰ得到灵芝孢子原油Ⅰ，打开开关阀门V5，灵芝孢子原油Ⅰ回收输送到萃取釜Ⅱ中，密封，关闭开关阀门V5，打开开关阀门V3，V4，微调阀门F3和F4，通入超临界二氧化碳，进行第二次超临界萃取：萃取釜Ⅱ压力30MPa，萃取釜Ⅱ温度40℃，分离釜Ⅱ压力10MPa，分离釜Ⅱ温度40℃，分离釜Ⅲ压力6MPa，分离釜Ⅲ温度40℃，流量550L/h，提取时间5h，打开收集阀门C2，从分离釜Ⅱ得到灵芝孢子油Ⅰ约18.0kg，
实施例2
如图3所示，本发明的萃取纯化分离设备是在常规超临界设备的基础上进行改进，添加了额外的萃取釜Ⅱ、分离釜Ⅱ、回收管道、相应的微调阀门F、收集阀门C和开关阀门V，使整套设备可在线同时进行萃取，纯化和分离高得率和高纯度的精准分离产物。
即一种超临界双重萃取纯化分离设备，它由萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ、回收管道、分离釜Ⅱ、分离釜Ⅰ、分离釜Ⅲ、热交换器Ⅰ、热交换器Ⅱ、储罐、高压泵、萃取管道Ⅰ、萃取管道Ⅱ、微调阀门F、收集阀门C和开关阀门V和控制系统，由控制系统控制各部件的工作状态，萃取釜Ⅰ、萃取釜Ⅱ共用现有萃取纯化分离设备由分离釜Ⅲ、热交换器Ⅱ、储罐、高压泵到热交换器Ⅰ之间的设备及其连接通道。
萃取釜Ⅰ通过开关阀门V2与萃取管道Ⅰ7相接，并通过萃取管道Ⅰ与分离釜Ⅰ的微调阀门F1相接，从而与分离釜Ⅰ相通，萃取釜Ⅱ通过开关阀门V3与萃取管道Ⅱ8相接，并通过萃取管道Ⅱ与分离釜Ⅱ的微调阀门F4相接，从而与分离釜Ⅱ相通,开关阀门V1、V2、微调阀门F1、F2同时开启或关闭，开关阀门V4、V3、微调阀门F3、F4同时开启或关闭，其状态由控制系统控制。其余未述部分与实施例1相同。
一种利用超临界双重萃取纯化分离设备提取产物的方法，在连续生产的过程中，它的操作步骤为：前一次萃取结束后关闭所有阀门，打开开关阀门V5将分离釜Ⅰ中的粗产物回收输送到萃取釜Ⅱ中，密封，关闭开关阀门V5。取一定量的原料，投入到超临界萃取装置的萃取釜Ⅰ中，密封，打开开关阀门V1，V2，V4，V3，V6，V7和 V8，微调阀门F1、F2、F3、F4，通入超临界二氧化碳，进行超临界萃取：提取时间 5-7h,萃取釜Ⅰ压力20-30MPa，萃取釜Ⅰ温度40-50℃，分离釜Ⅰ压力8MPa，分离釜Ⅰ温度40-50℃，分离釜Ⅲ压力5-6MPa，分离釜Ⅲ温度40-50℃；此时萃取釜Ⅱ对前一次分离釜Ⅰ收集的粗产物进行第二次超临界萃取：提取时间5-7h,萃取釜Ⅱ压力20-30MPa，萃取釜Ⅱ温度40-50℃，分离釜Ⅱ压力10-15MPa，分离釜Ⅱ分离釜温度40-50℃，打开收集阀门C2，从分离釜Ⅱ得到精准分离产物。分离釜Ⅲ压力5-6MPa，分离釜Ⅲ温度40-50℃，流量1100-1300L/h。由于两次萃取的时间有可能不同，可通过控制系统对两个萃取系统的相应开关进行控制。如萃取釜Ⅰ先结束，可先关闭开关阀门V1，V2。萃取釜Ⅰ降压，取出已提取完的原料，放入新原料；若萃取釜Ⅱ先结束，可先将开关阀门V4，V3关闭，打开收集阀门C2，从分离釜Ⅱ得到精准分离产物。萃取釜Ⅱ降压，打开开关阀门V5将分离釜Ⅰ中的粗产物回收输送到萃取釜Ⅱ中，密封，关闭开关阀门V5，进行第二次超临界萃取。超临界萃取时可打开收集阀门C3，废弃物从分离釜Ⅲ的收集阀门C3放出，这样进行连续生产。
一种利用超临界双重萃取纯化分离设备提取产物的方法，它的操作步骤为：采收成熟的灵芝孢子，集合成粉，筛除杂质，烘干至水分3％以下，破壁，然后取100kg，记原料Ⅱ，设备首次使用，此时，萃取釜Ⅰ工作，萃取釜Ⅱ不工作。将原料Ⅱ投入到超临界萃取装置的萃取釜中，密封，打开开关阀门V1，V2，V6，V7和V8，微调阀门F1和F2，通入超临界二氧化碳，进行超临界萃取：萃取釜Ⅰ压力25MPa，萃取釜Ⅰ温度45℃，分离釜Ⅰ压力8MPa，分离釜Ⅰ温度45℃，分离釜Ⅲ压力6MPa，分离釜Ⅲ温度45℃，流量600L/h，提取时间6h，从分离釜Ⅰ得到灵芝孢子原油Ⅱ，关闭V1、V2、微调阀门F1和F2，打开开关阀门V5，灵芝孢子原油Ⅱ回收输送到萃取釜Ⅱ中，密封，关闭开关阀门V5，打开开关阀门V3，V4，微调阀门F3和F4，通入超临界二氧化碳，萃取釜Ⅱ进行灵芝孢子原油Ⅱ第二次超临界萃取：提取时间6 h，萃取釜Ⅱ压力25MPa，萃取釜Ⅱ温度45℃，分离釜Ⅱ压力13MPa，分离釜Ⅱ分离釜温度45℃,萃取结束后，打开收集阀门C2，从分离釜Ⅱ得到灵芝孢子油Ⅱ约16.0 kg。在萃取釜Ⅱ萃取的同时，萃取釜Ⅰ降压，放出提取完的原料Ⅱ，然后再取100kg，记原料Ⅲ，放入萃取釜Ⅰ，此时萃取釜Ⅰ进行原料Ⅲ的第一次萃取：提取时间5h，萃取釜Ⅰ压力30MPa，萃取釜Ⅰ温度40℃，分离釜Ⅰ压力8MPa，分离釜Ⅰ温度40℃。分离釜Ⅲ压力6MPa，分离釜Ⅲ温度45℃，流量1200L/h，待原料Ⅱ的第二次萃取和原料Ⅲ的第一次萃取结束后，先从分离釜Ⅱ取出得到的灵芝孢子油Ⅱ约16.0kg，再关闭开关阀门V3，V4，萃取釜Ⅱ降压，打开开关阀门V5，从原料Ⅲ萃取出的灵芝孢子原油Ⅲ回收输送到萃取釜Ⅱ中，进行原料Ⅲ的第二次萃取：提取时间7h，萃取釜Ⅱ压力20MPa，萃取釜Ⅱ温度50℃，分离釜Ⅱ压力15MPa，分离釜Ⅱ温度50℃，分离釜Ⅲ压力6MPa，分离釜Ⅲ温度40℃，流量1300L/h，打开收集阀门C2，从分离釜Ⅱ得到灵芝孢子油Ⅲ约15.7kg。同时继续进行原料Ⅳ的第一次萃取……
对上述的得物进行检测
实施例1及2的每次第一次萃取结束后，打开收集阀门C1，从分离釜Ⅰ取少量灵芝孢子原油Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ样品，实施例1及2每次第二次萃取结束后，打开收集阀门C2，从分离釜Ⅱ取少量灵芝孢子油Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ样品，检测酸价、过氧化值，检测结果见表1，将实施例1-2的灵芝孢子原油Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ样品混合，灵芝孢子油Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ样品混合，检测邻苯二甲酸酯含量，检测结果见表2，后装入密闭容器，置于 37℃环境3个月，每月检测酸价和过氧化值，检测结果见表4
表1，灵芝孢子油的酸价和过氧化值
表2，灵芝孢子油的邻苯二甲酸酯含量
表3邻苯二甲酸酯名称和缩写
表4，灵芝孢子油的酸价和过氧化值稳定性
动物试验
灵芝孢子油对胃黏膜的保护和延缓乙醇效应出现的时间作用
试验动物
120只SPF级ICR小鼠，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限公司(生产许可证号：SCXK(沪)2016-0003)。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物饲养室(使用合格证：SYXK(闽)2014-005)，室温(22±2)℃，湿度(60±5)％，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。
主要药物与试剂
灵芝孢子油(实施例1及2的灵芝孢子油Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的混合样品)由福建仙芝楼生物科技有限公司提供；奥美拉唑(批号：060190533，石药集团欧意药业有限公司)；消炎痛(批号：1180801，北京红林制药有限公司)。
主要仪器
BSA223S-CW型分析天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；BT224S电子天平(赛多利斯称重设备有限公司)
方法
给药剂量选取的依据
依据《药理与中药药理实验》所述方法进行人和动物之间的等效剂量的换算，计算公式：动物等效剂量(g/kg)＝人日服总量(g)/60kg×(人转换因子/动物转换因子)。据委托单位提供的灵芝孢子油临床剂量，计算小鼠的等效剂量，将等效剂量设为中剂量，等效剂量×1/2倍为低剂量，等效剂量×2倍为高剂量。
分组
将小鼠分为6组，分别为：空白组、模型组(乙醇和消炎痛组)、奥美拉唑组、灵芝孢子油低剂量组、灵芝孢子油中剂量组、灵芝孢子油高剂量组，每组20只。
造模与给药
奥美拉唑组：4mg/kg，每天灌胃给药1次；灵芝孢子油低、中、高剂量组：给药剂量分别为0.2、0.4、0.8g/kg，空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水，每天灌胃给药1次，连续给药7d后，禁食12h，每组随机选取10只小鼠给予乙醇 (0.1mL/10g)灌胃给药，1.5h后进行样本采集；每组余下小鼠给予消炎痛(40mg/kg) 灌胃给药，3h后进行样本采集。
一般情况观察
实验过程当中记录小鼠的一般情况，如精神状态、体质量、毛发色泽、活动度、反应灵敏度、死亡状况等；同时每周3次的称量体重，并记录。
样本的采集与观察
小鼠颈椎脱臼处死，剖腹将胃取出，结扎幽门和贲门，从十二指肠与幽门部结合处注入4％多聚甲醛溶液2-3mL，固定20min后，沿胃大弯剪开，洗净胃内容物，展开胃黏膜，用滤纸吸干，观察胃黏膜损伤程度。
评价方法与评分标准
用游标卡尺测量胃出血或溃疡的最大长度及宽度，以出血或溃疡的最大长宽径作为损伤指标评分。评分标准见表5。
表5急性胃黏膜损伤模型评分标准
注：长度和宽度均以最大径计。
观察指标：各实验组胃黏膜损伤程度以损伤发生率(％)和损伤抑制率(％)表示。损伤发生率(％)＝某组出现出血或溃疡的小鼠数量/该组小鼠数量×100％；损伤抑制率(％)＝(A-B)/A×100％(A、B分别为模型组与药物组的损伤积分)
统计学分析
试验数据以平均数±标准差(x±S)表示，采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析。以P<0.01为差异具有统计学意义。
结果
一般情况
各组小鼠给药过程中无异常。小鼠给予乙醇后，模型组和奥美拉唑组10min后开始出现行动变缓，肢体活动不协调，呼吸加深、频率减慢等症状；而给予灵芝孢子油的小鼠在30min后才陆续出现行动变缓，肢体活动不协调，呼吸加深、频率减慢等症状，且出现上述症状的时间随着给药剂量的增加而延长。给予消炎痛的各组小鼠自主活动减少，各组之间无差别。使用生理盐水处理的空白组小鼠行为活动如常，未出现上述症状。
胃出血或溃疡情况
各组小鼠胃出血或溃疡情况观察如下：空白组无胃出血或者溃疡，黏膜完整。对于乙醇所致急性胃溃疡：模型组(乙醇组)可见有大量的条状出血和斑块状出血；奥美拉唑组可见大量条状出血，斑块状出血程度略轻于乙醇组；灵芝孢子油低剂量组仅见少数细小出血点，无条状出血及片状黏膜出血溃疡；灵芝孢子油中剂量组仅有1例有1微小出血点，无条状出血及斑块状出血；灵芝孢子油高剂量组无胃出血或者溃疡，胃黏膜与空白组基本无异。对于消炎痛所致胃溃疡：模型组(消炎痛组) 可见有大量的条状溃疡和圆形溃疡面，中心凹陷，粘膜缺失，胃壁极薄，甚至出现胃穿孔；奥美拉唑组可见大量的条状溃疡和圆形溃疡面，中心凹陷，粘膜缺失，胃壁略厚于模型组；灵芝孢子油低剂量组少数点状溃疡面和条状溃疡，胃壁厚度略薄于空白组；灵芝孢子油中剂量组有少数点状溃疡面，1例出现条状溃疡，胃壁厚度与空白组基本无异；灵芝孢子油高剂量组仅有少数点状溃疡面，胃壁厚度与空白组基本无异。
损伤发生率、损伤指数和损伤抑制率
各组小鼠胃损伤评分结果见表6，各组小鼠胃损伤发生率、损伤指数和损伤抑制率见表7。灌胃无水乙醇、消炎痛导致小鼠产生非常明显的胃溃疡，与模型组相比，预防性给予灵芝孢子油可显著降低胃出血或溃疡等胃黏膜损伤(P<0.01)，其中灵芝孢子油组的损伤发生率显著降低(P<0.01)，灵芝孢子油组的损伤抑制率显著提高 (P<0.01)。
表6各组小鼠胃损伤评分结果(x±S，n＝10)
注：与空白组比较，
表7各组小鼠胃损伤发生率、损伤指数和损伤抑制率(x±S，n＝10)
注：与空白组比较，
总结
本实验结果显示，小鼠给予无水乙醇或消炎痛灌胃均可导致较严重的胃溃疡，而给予灵芝孢子油能有效抑制小鼠无水乙醇和消炎痛导致的胃溃疡的发生，且对于无水乙醇所导致的急性胃溃疡效果尤为显著。
机译： 灵芝孢子油的制备方法
机译： 灵芝孢子油的制备方法
机译： 基于水飞蓟籽油的肝脏保护作用的组合物及其制备方法
