检测2,6-吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种检测2,6‑吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针及制备方法和应用。所述荧光探针为稀土‑强力霉素配合物，具体方法是：将可溶性稀土盐和强力霉素溶于水，得到均一的含稀土元素的溶液；调节含稀土元素的溶液的pH为弱碱性，此时出现沉淀物，再继续反应至沉淀物不再增加，得到稀土‑强力霉素配合物荧光探针。应用是将该荧光探针用于检测2,6‑吡啶二羧酸钙溶液的浓度。本发明创新地将强力霉素与稀土离子配位，得到的稀土‑强力霉素配合物具有荧光寿命长、发光信号稳定、Storkes位移大、窄峰及避免生物体的背景干扰，与2,6‑吡啶二羧酸钙的结合性较强，能够用于2,6‑吡啶二羧酸钙浓度的检测，并且可推广至其他传感器，用于对不同生物小分子的浓度检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体是一种检测2,6-吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针及制备方法和应用。

背景技术

炭疽作为一种烈性传染病，其病原体炭疽芽孢杆菌属于我国公布的《人间传染的病原微生物名录》中第二类病原微生物(高致病性病原微生物)。而芽孢萌发过程中，占芽孢干重约5-10％的是2,6-吡啶二羧酸(简称DPA)以及与其结合的二价阳离子(主要为Ca

目前为止，已经开发了许多检测2,6-吡啶二羧酸钙的方法，其中包括比色分析法、聚合酶链式反应分析法、免疫分析法、傅里叶变换红外光谱法、气相色谱法、表面增强拉曼光谱法、高压液相色谱法、电化学分析法以及荧光分析法等。由于其他检测技术实施过程较为复杂，所涉及仪器价格昂贵，检测结果也无法直接观察可得，因此，荧光分析法由于检测结果具有直观性等优点，而被广泛应用。

构筑荧光探针中稀土离子掺杂的基质主要为无机材料和有机配体两大类。无机材料方面，研究主要集中于稀土掺杂的碳/硅量子点及其他小尺度纳米材料。有机配体方面，专注于含氧有机物、含氮有机物、超分子大环和生物分子等配体的设计和合成。四环素类抗生素作为一类快速抑菌剂，从1950年首次发现以来，一直被广泛使用于兽类药物。强力霉素作为四环素类抗生素中的一种，其分子结构具备β－二酮结构，故而是稀土的优良配体。

由于炭疽杆菌的自然宿主包括草食性野生动物和家畜，因此对于以这些动物为原料所生产出的肉制品与奶制品的2,6-吡啶二羧酸钙的检测，要求其检测手段快速、绿色、无毒。除此之外，检测试剂应当具有较好的水溶性。而目前的荧光探针，不管是稀土配合物还是稀土修饰的纳米材料，存在以下弊端：制备步骤较为复杂、制备中都需要不同程度毒性的试剂参与、水溶性一般。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是，提供一种检测2,6-吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针及制备方法和应用。

本发明解决所述荧光探针技术问题的技术方案是，提供一种检测2,6-吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为稀土-强力霉素配合物。

本发明解决所述方法技术问题的技术方案是，提供一种所述的检测2,6-吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将可溶性稀土盐和强力霉素溶于水，得到均一的含稀土元素的溶液；

(2)调节含稀土元素的溶液的pH为弱碱性，此时出现沉淀物，再继续反应至沉淀物不再增加，得到稀土-强力霉素配合物荧光探针。

本发明解决所述应用技术问题的技术方案是，提供一种所述的检测2,6-吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针的应用，其特征在于，将该荧光探针用于检测2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度，具体步骤如下：

(1)将所述荧光探针与不同浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液混合反应；

(2)采用荧光法测定光谱，得到不同浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的荧光光谱；

(3)再以2,6-吡啶二羧酸钙的浓度值为横坐标，以不同2,6-吡啶二羧酸钙浓度所对应的荧光光谱中特征峰处的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线；

(4)对待测浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液通过荧光法测得其荧光强度，在标准曲线中找到该荧光强度所对应的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度，即得待测2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明创新地将强力霉素与稀土离子配位，得到的稀土-强力霉素配合物具有荧光寿命长、发光信号稳定、Storkes位移大、窄峰及避免生物体的背景干扰，与2,6-吡啶二羧酸钙的结合性较强，能够用于2,6-吡啶二羧酸钙浓度的检测，并且可推广至其他传感器，用于对不同生物小分子的浓度检测。

2、强力霉素的分子结构中具有多个酮羰基和羟基官能基团，此类官能团在碱性条件下能够实现酮醇式互变异构，从而产生游离的氧离子。而稀土元素由于其自身的高路易斯酸性，易对带有负电荷或中性氧及氮原子有倾向性。因此稀土离子能够更好地与强力霉素中的羰基氧、羧酸根离子中的氧负离子形成配合物。

3、本发明通过一锅法合成荧光探针，制备过程简单，原料无毒、易得且价格低廉，环境友好，适合推广使用。

4、本发明的2,6-吡啶二羧酸钙浓度定量分析方法，将铕/镝-强力霉素配合物荧光探针与标准曲线结合，不仅简单便捷，简化了检测步骤，无需借助其他精密贵重仪器，降低了成本，而且标准曲线的斜率可直观反映荧光探针的相对灵敏性，斜率越大则相对灵敏性更高。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的铕-强力霉素配合物的扫描电镜图；

图2为本发明实施例1得到的铕-强力霉素配合物的荧光发射光谱图；

图3为本发明实施例1提供的铕-强力霉素配合物在不同浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液中的荧光发射光谱图；

图4为本发明实施例1提供的铕-强力霉素配合物的标准曲线图；

图5为本发明实施例2得到的镝-强力霉素配合物的扫描电镜图；

图6为本发明实施例2得到的镝-强力霉素配合物的荧光发射光谱图；

图7为本发明实施例2提供的镝-强力霉素配合物在不同浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液中的荧光发射光谱图；

图8为本发明实施例2提供的镝-强力霉素配合物的标准曲线图。

具体实施方式

下面给出本发明的具体实施例。具体实施例仅用于进一步详细说明本发明，不限制本申请权利要求的保护范围。

本发明提供了一种检测2,6-吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针(简称荧光探针)，其特征在于，所述荧光探针为稀土-强力霉素配合物。

其中，铕-强力霉素配合物荧光探针为60nm的纳米棒状颗粒，镝-强力霉素配合物荧光探针为无定型态。

本发明同时提供一种检测2,6-吡啶二羧酸钙浓度的荧光探针的制备方法(简称方法)，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将可溶性稀土盐、强力霉素和水混合后，在15～35℃条件下以搅拌反应0.5～1.5h至可溶性稀土盐和强力霉素溶于水，得到均一的含稀土元素的溶液；

优选地，步骤1中，所述水为去离子水、蒸馏水或超纯水；

优选地，步骤1中，所述可溶性稀土盐为稀土氯化盐或稀土硝酸盐，稀土元素为镝或铕；

优选地，步骤1中，可溶性稀土盐与强力霉素的摩尔比为1:1～3；可溶性稀土盐的摩尔与水的体积的比为1mol:20～60L；

(2)调节含稀土元素的溶液的pH为碱性(优选弱碱性)，此时出现黄褐色沉淀物，再在搅拌条件下继续反应0～5h至沉淀物不再增加，离心分离、洗涤除杂、干燥得到稀土-强力霉素配合物荧光探针。

优选地，步骤2中，弱碱性为pH＝8～10；调节pH的方法是在含稀土元素的溶液中加入氨水，氨水起碱性作用。

优选地，步骤1和步骤2中的搅拌条件为：转速为200～800r/min的磁力搅拌。

本发明还提供了一种所述荧光探针的应用，其特征在于，将该荧光探针用于检测2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度，具体步骤如下：

(1)将所述荧光探针与不同浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液混合反应；所述混合反应的温度为15～35℃，时间为10～20min；

(2)采用荧光法测定450～700nm的光谱，得到不同浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的荧光光谱；测试条件为：在电压值为700V、扫描速度为1200nm/min、狭缝宽度为10nm、激发波长为340nm的荧光光谱仪中测定光谱。

(3)再以2,6-吡啶二羧酸钙的浓度值为横坐标，以不同2,6-吡啶二羧酸钙浓度所对应的荧光光谱中特征峰处的荧光强度值为纵坐标，绘制近似直线的标准曲线；

本实施例中，铕-强力霉素配合物荧光探针615nm为特征峰，荧光强度随2,6-吡啶二羧酸钙浓度变化而变化；铕-强力霉素配合物荧光探针480nm为特征峰，荧光强度随2,6-吡啶二羧酸钙浓度变化而变化。

(4)对待测浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液通过荧光法测得其荧光强度，在标准曲线中找到该荧光强度所对应的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度，即得待测2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度。

步骤1)中，2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度为1～100μM。铕-强力霉素配合物荧光探针对应的2,6-吡啶二羧酸钙溶液浓度为1μM、16μM、32μM、48μM、64μM、80μM和100μM。镝-强力霉素配合物荧光探针对应的2,6-吡啶二羧酸钙溶液浓度为1μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM。

在紫外灯的协助下，随着2,6-吡啶二羧酸钙溶液浓度的不断增大，用眼睛可以直接观察到稀土-强力霉素配合物荧光探针的荧光由弱到强，其中，铕离子由无色至红色的渐变，镝离子由无色至蓝光的渐变。因此，铕/镝-强力霉素配合物荧光探针可用于2,6-吡啶二羧酸钙的检测。

实施例1

(1)将0.5mmol氯化铕(EuCl

(2)用氨水调节含稀土元素的溶液的pH为9，转速为800r/min的条件下搅拌反应2h，在转速为5000r/min的条件下离心分离出沉淀物，采用无水乙醇洗涤3次，最后，将分离出的沉淀物置于60℃的烘箱中干燥24h，得到铕-强力霉素配合物荧光探针。

由图1可以看出，实施例1所得的铕-强力霉素配合物荧光探针为纳米棒状颗粒，平均粒径为60nm。

由图2可以看出，实施例1所得的铕-强力霉素配合物在615nm处有明显的特征峰，对应铕离子

铕-强力霉素配合物荧光探针检测2,6-吡啶二羧酸钙溶液浓度的方法，包括如下步骤：

(1)将0.0053g(1.0×10

标准浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度分别为1μM、16μM、32μM、48μM、64μM、80μM和100μM，体积均为100mL；

(2)用移液管分别取3mL上述待测溶液逐一置于比色皿中，再采用荧光光谱仪在监测波长为340nm的条件下检测其发射光谱图(如图3所示)；

(3)再以标准浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度值为横坐标，以标准浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液所对应的荧光光谱中615nm处的荧光强度值为纵坐标，绘制铕-强力霉素配合物荧光探针下2,6-吡啶二羧酸钙的标准曲线(如图4所示)。

由图3可知，615nm处的发射峰(即特征峰)对应的是铕-强力霉素配合物中Eu

由图4可知，标准曲线基本呈线性关系，说明铕-强力霉素配合物对2,6-吡啶二羧酸钙有很好的选择性。对待测浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液通过荧光法测得其荧光强度，在标准曲线中找到该荧光强度所对应的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度，即得待测2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度。

图4中R

实施例2

(1)将0.5mmol氯化镝(DyCl

(2)用氨水调节含稀土元素的溶液pH为9，转速为800r/min的条件下搅拌反应2h，在转速为5000r/min的条件下离心分离出沉淀物，采用无水乙醇洗涤3次，最后，将分离出的沉淀物置于60℃的烘箱中干燥24h，得到镝-强力霉素配合物荧光探针。

由图5可以看出，实施例2所得的镝-强力霉素配合物荧光探针为无定形态。

由图6可知，实施例2所得的镝-强力霉素配合物在480nm处有明显的特征峰，对应镝离子

镝-强力霉素配合物荧光探针检测2,6-吡啶二羧酸钙溶液浓度的方法，包括如下步骤：

(1)将0.0053g(1.0×10

标准浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度分别为1μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，体积均为100mL；

(2)用移液管分别取3mL上述待测溶液逐一置于比色皿中，再采用荧光光谱仪在监测波长为340nm的条件下检测其发射光谱图(如图7所示)；

(3)再以标准浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度值为横坐标，以标准浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液所对应的荧光光谱中480nm处的荧光强度值为纵坐标，绘制镝-强力霉素配合物荧光探针下2,6-吡啶二羧酸钙的标准曲线(如图8所示)。

由图7可知，480nm处的发射峰(即特征峰)对应的是镝-强力霉素配合物中Dy

由图8可知，标准曲线基本呈线性关系，说明镝-强力霉素配合物对2,6-吡啶二羧酸钙有很好的选择性。对待测浓度的2,6-吡啶二羧酸钙溶液通过荧光法测得其荧光强度，在标准曲线中找到该荧光强度所对应的2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度，即得待测2,6-吡啶二羧酸钙溶液的浓度。

此外，由标准曲线的斜率比较得知，相较于铕-强力霉素配合物荧光探针，镝-强力霉素配合物对2,6-吡啶二羧酸钙有更好的检测灵敏性。