一种检测松材线虫的HDA等温扩增试剂检测方法

摘要

本发明提供一种检测松材线虫的HDA等温扩增试剂盒及检测方法，该试剂盒主要由以下几种试剂组成：试剂A：松材线虫组织裂解液；试剂B：HDA等温扩增缓冲液，其中含有特定引物BxHDAF及BxHDAR；试剂C：HDA等温扩增反应酶液，其中含有解旋酶。扩增产物经电泳检测，出现目标电泳条带即可确定检测样本中有松材线虫存在，所说的目标电泳条带是指97bp处。使用本试剂盒，按本发明所提供的方法，可快速、灵敏、准确地检测并判断松材中线虫是否为松材线虫。

说明书

技术领域

本发明涉及一种原生动物基因组核酸诊断试剂盒，尤其涉及一种松材线虫基因诊断试剂盒及检测方法。

背景技术

松材线虫病，又称松树萎蔫病，是由松材线虫引起的具有毁灭性的森林病害，属我国重大外来入侵种，已被我国列入对内、对外的森林植物检疫对象，该病自1982年传入我国以来，扩散蔓延迅速，目前全国已有14省(市、区)发生，面积达7.7万hm2，导致大量松树枯死，对我国的松林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏，造成了严重的经济和生态损失，该病的显著特征是，被侵染的松树针叶失绿，并逐渐黄萎枯死变成红褐色，最终全株迅速枯萎死亡，但针叶可长时间内不脱落，有时直至第二年夏季才脱落，从针叶开始变色至全株死亡，平均只有30天左右，病树大多在9月至10月上、中旬死亡。

松材线虫在我国尚未得到有效控制，目前疫区仍在不断扩大之中，虽然目前已经有荧光定量PCR等技术可在标准参考实验室用于检测松材线虫，但是各地野保及林业基层部门仍然急需一套适用于基层部门的松材线虫快速检测技术，因此我们提出一种松材线虫基因诊断试剂盒及检测方法，用于解决这个问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

本发明的目的是填补现有技术的空白，提供一种松材线虫基因诊断试剂盒及检测方法。

(二)技术方案

一种松材线虫基因诊断试剂盒(简称本试剂盒)

本试剂盒主要由以下几种试剂组成：

试剂A：松材线虫组织裂解液，为2.5mmol/L DTT、1.125％Tween20、0.025％Gelatin缓冲液；

试剂B：HDA等温扩增缓冲液，其中含有特定引物BxHDAR及BxHDAF；其序列为：

BxHDAR 5′-CAAAGCCCAAGAGCGCAATATGCATTC-3′；

BxHDAF 5′-GGGTCGATGAAGAACGCAGTGAATTGC-3′。

试剂C：HDA等温扩增反应酶液，其中含有大肠杆菌解旋酶Ⅱ(UvrD)解旋酶及BstDNA Polymerase。

试剂D液：阳性对照，为松材线虫阳性DNA模板。

试剂C与试剂D中分别所含的特定引物BxHDAR和BxHDAF，应有足够的含量，—般应不少于8pM。

与现有技术相比，本发明提供了一种检测松材线虫的HDA等温扩增试剂检测方法，具备以下有益效果：

1、该检测松材线虫的HDA等温扩增试剂检测方法，能快速、灵敏、准确地检测出松树是否携带松材线虫，且已经用本发明对松树是否被松材线虫感染进行检测，得出有效、可靠的检测结果。

2、该检测松材线虫的HDA等温扩增试剂检测方法，适用于检测松材线虫。

附图说明

图1为PCR产物电泳结果图；图1中1、2、3依次为200bp ladder DNA分子量Marker、阳性对照和等温扩增产物。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

为实现上述过程简单和检测结果明显的目的，本发明提供如下技术方案：一种检测松材线虫的HDA等温扩增试剂盒及检测方法，该试剂盒主要由以下几种试剂组成：试剂A：松材线虫组织裂解液；试剂B：HDA等温扩增缓冲液，其中含有特定引物BxHDAF及BxHDAR；试剂C：HDA等温扩增反应酶液，其中含有解旋酶。扩增产物经电泳检测，出现目标电泳条带即可确定检测样本中有松材线虫存在，所说的目标电泳条带是指97bp处。

已经用本发明对松树是否被松材线虫感染进行检测，得出有效、可靠的检测结果。

本试剂盒的使用方法如下：

①松材线虫的组织裂解

待检松材线虫单条或多条加入100μ1试剂A在冰上混匀，捣碎匀浆；55℃静置15分钟。

②松材线虫等温扩增

取2μ1组织裂解液；加入含试剂C的反应管，在PCR仪或者恒温水浴锅中进行以下反应：

68℃ 90分钟；

反应结束后取10μ1加2μl 6×DNA加样缓冲液(含溴酚蓝)混匀后在2％琼脂糖凝胶进行电泳，确定扩增产物。如出现约97bp的反应产物，说明待检样品携带松材线虫。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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武汉市林业工作站

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