一株降解生物胺的奥默柯达酵母及其在白酒酿造中的应用

摘要

本发明属于生物发酵技术领域，具体为一株能降解白酒酿造过程中生物胺的奥默柯达酵母及其应用。奥默柯达酵母，Kodamaea ohmeri HJM，已于2020年7月9号保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:2020297，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。所述奥默柯达酵母HJM在食品领域降低生物胺含量的应用。该奥默柯达酵母是从大曲中筛选出的无害菌，温度和乙醇耐受性高，耐酸性和耐糖性好；可对白酒酒曲中的生物胺进行较好的降解,提高白酒生产安全性。

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体为一株降解生物胺的奥默柯达酵母及其在白酒酿造中的应用。

背景技术

生物胺(Biogenic Amines，BAs)是一类具有生物活性含氮的低分子质量的有机化合物总称，广泛存在于生物体细胞中，是细胞内正常的活性成分。生物胺是由游离氨基酸在脱羧酶的作用下生成的，也可以是醛被胺化作用后产生；同时，生物胺也可以在胺氧化酶作用下氧化降解。生物胺广泛存在于发酵乳制品、水产品、肉类及酒类等富含蛋白质和氨基酸的食品中。范文来等人利用气相色谱首次在白酒中检测出九种生物胺：腐胺、尸胺、甲胺、乙胺、吡咯烷、异戊胺、环己胺、环庚胺、环戊胺。微量的生物胺对身体有益，促进人体新陈代谢和生长发育，但是人体过量摄入生物胺，将会产生毒害作用，如引起头痛、血压变化、心悸、呼吸紊乱等反应，严重甚至威胁生命。因此，降低食品中生物胺的含量，提高食品的安全性对人体健康十分重要。

目前控制食品中生物胺的方法主要为添加剂、辐照和控制卫生状况等，在发酵品中添加降解生物胺的微生物来降低食品的生物胺含量也变成一种普遍的方法。但是目前已报道的文章主要是从奶酪、腐乳、发酵肉制品以及豆酱中筛选出具有降解生物胺的菌株，对降解酒类尤其是白酒中生物胺的菌株尚未见报道。

我国固态白酒属于蒸馏酒，但与黄酒、啤酒等发酵酒一样，其生物胺主要来自于发酵过程中。因此，如果选育出能对白酒酿造生产过程中产生的生物胺进行降解，可显著降低白酒中生物胺含量的菌株，对生产出更健康安全的白酒产品具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于针对以上技术问题，提供一株降解生物胺的奥默柯达酵母。该奥默柯达酵母HJM是从固态白酒大曲中筛选出的无害菌，温度和乙醇耐受性高，耐酸性和耐糖性好；可对白酒发酵过程中产生的生物胺(甲胺、乙胺、环戊胺、腐胺、环己胺、尸胺、环庚胺、异戊胺、吡咯烷)进行较好的降解，降解率最高可达到96.07％，可显著提高白酒食品安全性。

本发明的另外一个发明目的为提供以上所述奥默柯达酵母HJM在白酒酿造中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明的具体技术方案为：

奥默柯达酵母，Kodamaea ohmeri HJM,已于2020年7月9号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020297，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；保藏地址邮编：430072。

作为本申请中一种较好的实施方式，制备含有所述的奥默柯达酵母HJM的微生物制剂。

作为本申请中一种较好的实施方式，每克或每毫升制剂中的奥默柯达酵母HJM的活菌数≥1×10

作为本申请中一种较好的实施方式，所述的微生物制剂为液体菌剂或固体菌剂。

作为本申请中一种较好的实施方式，所述奥默柯达酵母HJM在食品领域降低生物胺含量的应用。

作为本申请中一种较好的实施方式，所述食品为白酒、酱油、食醋或鱼露。

作为本申请中一种较好的实施方式，应用所述的奥默柯达酵母HJM制备白酒的酒曲。

作为本申请中一种较好的实施方式，所述的奥默柯达酵母HJM在降低白酒中生物胺含量方面的应用。

作为本申请中一种较好的实施方式，该奥默柯达酵母HJM是从固态白酒大曲中筛选出的无害菌，温度和乙醇耐受性高，耐酸性好；奥默柯达酵母HJM对温度最高耐受为43℃；乙醇最高耐受为14％；酸最高耐受为2；具有较高的葡萄糖耐受性，葡萄糖浓度达到600g/L时依然生长良好。

作为本申请中一种较好的实施方式，该奥默柯达酵母HJM对白酒发酵过程中产生的生物胺进行较好的降解，降解率最高可达到96.07％；所述的生物胺包括但不限于甲胺、乙胺、环戊胺、腐胺、环己胺、尸胺、环庚胺、异戊胺和吡咯烷。

一株降解生物胺的奥默柯达酵母在白酒大曲药制备中的应用，其包括以下步骤：将小麦粉碎后，加水进行润粉拌合，将Kodamaea ohmeri HJM按8～12％的接种量接种到物料中，然后压制成型，经入室安放、晾曲排潮、翻曲、合堆、翻堆、入库贮存各工艺步骤，培养制得大曲药成曲。

一株降解生物胺的奥默柯达酵母在白酒酿造中的应用，其包括如下步骤：

1)将Kodamaea ohmeri HJM制备成菌种；

2)制曲：将小麦粉碎后，加水进行润粉拌合，将步骤1)的菌种按8～12％的接种量接种到物料中，然后压制成型，经入室安放，晾曲排潮、翻曲、合堆、翻堆、入库贮存各工艺步骤，培养制得大曲药成曲。

3)将大米、高粱、糯米、玉米、小麦至少一种粮食进行蒸煮糊化，当出甑打量水后粮糟的温度降至20℃～25℃时，再加入步骤2)制成的大曲粉，翻拌均匀，然后入窖发酵、出窖、蒸馏取酒。

作为优选，加入步骤2)大曲粉的量为入窖发酵粮糟总重量的10-30％。

进一步的，步骤1)中菌种的具体制备工艺为：将Kodamaea ohmeri HJM菌株进行分离、复壮、优选，再经YPD液体培养基多级种子扩大培养，制成菌种。

所述YPD液体培养基多级种子扩大培养工艺为：称取130～160g小麦，加1L蒸馏水浸泡过夜，煮沸50～70min，过滤得到小麦浸提液，再向小麦浸提液中加入蛋白胨、酵母浸出粉和葡萄糖。作为优选，以小麦浸提液的体积算，蛋白胨的添加量为10g/L、酵母浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L。然后将优选的Kodamaea ohmeri HJM按5～10％的接种量接种到YPD液体培养基中，于25～35℃、160～180r/min的条件下培养24～48h。

进一步的，步骤2)中所述晾曲排潮是指当曲坯温度升高到30～35℃，打开门窗，排除潮气，降低室温，揭开草帘，将上、下层曲坯倒翻一次，当曲坯温度下降至20～25℃时，关闭门窗。

所述翻曲是指晾曲排潮后，当曲坯温度再次上升到30～35℃时，不定期进行翻曲、通风，使曲坯在30～50℃温度范围内保温发酵8～12天，最后入库贮存制得成曲。

与现有技术相比，本发明的积极效果体现在：

(一)筛选出的该奥默柯达酵母HJM温度耐受性好。

(二)筛选出的该奥默柯达酵母HJM乙醇耐受性好，可在高乙醇质量浓度的情况下生长良好。

(三)筛选出的该奥默柯达酵母HJM酸耐受性好。

(四)筛选出的该奥默柯达酵母HJM具有较高的葡萄糖耐受性，葡萄糖浓度达到600g/L时依然生长良好。

(五)筛选出的该奥默柯达酵母HJM可对白酒发酵过程中产生的生物胺(甲胺、乙胺、环戊胺、腐胺、环己胺、尸胺、环庚胺、异戊胺、吡咯烷)进行较好的降解，降解率最高可达到96.07％，可显著提高白酒食品安全性。

附图说明

图1为实施例2中奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM对小麦发酵基质中生物胺的降解曲线图；

其中，1、甲胺；2、乙胺；3、环戊胺；4、腐胺；5、环己胺；6、尸胺；7、环庚胺；8、异戊胺；9、吡咯烷。

图2-1为实施例1中筛选得到的奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM的菌落形态图(A)、光学显微镜图(B)。

图2-2为实施例1中筛选得到的奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM的菌落电镜图。

图3为实施例1中奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM在不同pH条件下的生长情况图。

图4为实施例1中奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM在不同糖浓度条件下的生长情况图。

图5为实施例1中奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM在不同温度条件下的生长情况图。

图6为实施例1中奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM在不同乙醇浓度条件下的生长情况图。

图7为以26S rDNA同源性为基础，用邻接法构建的系统发育树。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

本申请中所涉及的奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM,保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2020年7月9号；保藏编号为CCTCC NO:M 2020297，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；保藏地址邮编：430072。

以下实施例中所采用的％，如无特殊说明，均表示其体积百分含量。

实施例1：奥默柯达酵母的筛选

1)从大曲、窖泥、白酒和曲房环境中筛选酵母菌

分别从遂宁某传统白酒生产企业制酒生产线分别称取20g大曲，20g窖泥，量取25ml白酒到225ml无菌生理盐水中，放入摇床180r/min震荡30min左右；然后吸取25ml上清液至225ml无菌生理盐水中，再依次吸取1ml至新的9ml无菌生理盐水中，制成10

2)YPD液体培养基多级种子扩大培养

称取140g小麦，1L蒸馏水浸泡过夜，煮沸60min，过滤得到小麦浸提液。按蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L配制YPD液体培养基。然后将优选的16株Kodamaeaohmeri HJM按8％的接种量接种到YPD液体培养基中，于28℃、180r/min培养48h。

3)16株酵母菌生物胺的降解情况

将16株酵母分别接种到同时含有九种生物胺(每种生物胺含量均为100mg/L)的YPD液体培养基中，按酵母菌一般特性设置培养条件，于28℃、180r/min培养2d，采用高效液相色谱法测定培养基中剩余生物胺的含量，结果表明J5对这九种生物胺的降解率最高，其对各种生物胺的具体降解效果如表1所示，该菌对环己胺的降解效果最好，降解率(％)＝(样品组-空白组)/样品组×100％。根据来源显示，J5是从大曲中筛选出的一株酵母菌，本申请将其作为后续生物胺降解的研究。

表1奥默柯达酵母对各生物胺的降解率

4)研究J5是否产生物胺

将J5菌液分别以5～8％的接种量接种到YPD肉汤培养基中，培养分别24h、48h后采用高效液相色谱法检测其生物胺含量。结果表明，不管接种量如何，也不管培养时间多少，均没有检测到任何生物胺产生，表明该菌株本身不产生生物胺。

5)J5的分子生物学鉴定

提取J5的基因组DNA，引物为：NL1:5’GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG3’；NL4:5’GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’，进行26SrDNA扩增，PCR程序条件为：94℃预变形4min后进入以下循环，94℃变形45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；70℃修复延伸10min，40℃终止反应。送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序后，将所得序列在NCBI数据库进行BLAST序列对比，鉴定其为奥默柯达酵母，并将其命名为Kodamaea ohmeri HJM，这是首次从大曲中筛选出奥默柯达酵母，并对其进行生物胺降解研究。

5)Kodamaea ohmeri HJM的生长特性研究

对HJM进行一系列的生长特性研究：

①温度耐受性

A、小麦浸提液配制YPD液体培养基，每个250ml三角瓶的装液量均为50ml，灭菌冷却；

B、将Kodamaea ohmeri HJM菌的菌种斜面于28℃活化24h后，用9ml无菌生理盐水制成菌悬液，血球计数板计数并调整菌液浓度至1×10

C、设置培养温度：将接种了Kodamaea ohmeri HJM菌的三角瓶分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，于180r/min恒温振荡器培养48h，再于YPD琼脂培养基平板上活菌计数，确定奥默柯达酵母的最高耐受温度，具体结果见图3。

由图3可知，奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM在30℃时生长最好，与其他温度差异极显著，40℃生长减少，45℃时停止生长。

D、在已设置培养温度中没有得到其具体耐受温度，缩小温度范围继续试验，即重复步骤A、B、C，将其在40℃-45℃时继续试验。继续试验得到42℃时，菌株少量生长，43℃时不再生长，即得到奥默柯达酵母的最高耐受温度为43℃。

②乙醇耐受性

配置小麦浸提液配制YPD液体培养基，每个三角瓶的装液量为50ml，灭菌后于无菌环境下分别加入浓度为6％、8％、10％、12％、14％的乙醇，再按6％的接种量接入菌液，然后在28℃、180r/min培养48h后平板活菌计数，具体结果见图4。

由图4可知，随着乙醇浓度增加，菌株生长总数减少，当乙醇浓度为12％时，菌株生长较少，当乙醇浓度为14％时停止生长。继续试验得乙醇浓度为13％时，只有少许菌株生长，即得奥默柯达酵母的最高耐受乙醇浓度为14％。

③酸耐受性

小麦浸提液配制YPD液体培养基，每个三角瓶的装液量均为50ml，分别将其用乳酸调节pH为：2、3、4、5、6，灭菌后按6％的接种量接入菌液，于28℃、180r/min培养48h后平板活菌计数，具体结果见图5。

由图5可知，当pH为6时菌株生长情况最好，随着环境酸度增加菌株生长总数减少，pH为3时有少许菌株生长，pH为2时菌株停止生长，即得奥默柯达酵母最高耐酸pH为2。同时也表明奥默柯达酵母在过酸环境下生长受到抑制，但具有一定耐酸性，在酸性环境下能生长。

④糖耐受性

小麦浸提液配制YPD液体培养基，每个三角瓶的装液量均为50ml，由于酵母直接利用葡萄糖，因此加入分别葡萄糖调节糖浓度：100g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L、600g/L，灭菌后按6％的接种量接入菌液，于28℃、180r/min培养48h后平板活菌计数，具体结果见图6。

由图6可知，随着葡萄糖浓度的增加，菌株生长减少，当葡萄糖浓度为500g/L时，活菌数相对减少，但其总数依然有2.95×10

6)高效液相测定生物胺含量

①标准曲线的制作：按1000mg/L称取一定量的生物胺配制标准溶液，然后分别吸取1ml各生物胺单组分标准储备溶液，置于同一个10ml的容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液定容，配成100mg/L的生物胺标准混合使用液。

②衍生方法参考GB 2016《食品中生物胺的测定》并稍作改动。取1ml生物胺标准系列溶液于15ml离心管中，依次加入1ml饱和碳酸氢钠溶液，1ml 2mol/L的氢氧化钠溶液提供一个碱性环境，1ml 10mg/ml丹磺酰氯溶液，涡旋混匀1min，于40℃恒温水浴具塞暗处理30min，15min摇匀一次，取出，加入1ml饱和氯化钠溶液，40℃恒温10min以终止衍生化，取出冷却至室温，加入3ml×2乙醚，震荡2min，静置分层后转移上层有机相至新的15ml离心管，合并两次萃取液，40℃水浴氮气吹干。加入1ml乙腈溶解残留物，震荡混匀后，过0.22um滤膜，待测定。

③样品前处理：取5ml发酵液于15ml离心管中，6000×g离心20min。取1ml上清液衍生处理，同标品。

④色谱条件：色谱柱为Angilent ZORBAX SB C18柱(4.6*250mm*5um)，紫外检测波长254nm，柱温30℃，进样量10ul，流速0.4ml/min，流动相A乙腈、B超纯水，梯度洗脱程序为：：5-70％(A)、15-90％(A)、20-100％(A)、30-65％(A)。

实施例2：Kodamaea ohmeri HJM对多粮发酵糟醅中生物胺的降解

准备YPD液体培养基：称取140g小麦，加1L蒸馏水浸泡过夜，煮沸60min，过滤得到小麦浸提液；再向小麦浸提液中加入蛋白胨、酵母浸出粉和葡萄糖，以小麦浸提液的体积算，蛋白胨的添加量为10g/L、酵母浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L，121℃高温灭菌20min，冷却即得。

将奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM按5％的接种量接种到100mL YPD液体培养基，于30℃、160r/min的条件下培养24h，菌液浓度为10

将小麦粉碎后，加水进行润粉拌合，用YPD液体培养基进行多级种子扩大培养的菌种按10％的接种量接种到物料中，压制成型后入室安放，然后进行晾曲排潮。晾曲排潮时，当曲坯温度升高到33℃，打开门窗，排除潮气，降低室温，揭开草帘，将上、下层曲坯倒翻一次，当曲坯温度下降至23℃时，关闭门窗。晾曲排潮后，当曲坯温度再次上升到33℃时，不定期进行翻曲、通风，使曲坯在30～40℃温度范围内保温发酵10天，最后合堆、翻堆、入库贮存制得大曲药成曲(大曲药的制备为现有技术，不赘述)。

为研究奥默柯达酵母Kodamaea ohmeri HJM对生物胺的降解情况，分别选取实验窖和对比窖进行投窖。

实验窖：将大米、高粱、糯米、玉米、小麦五种粮食粉碎后，按0.5:6:1：0.5：1:1的重量百分比混合后进行蒸煮糊化，当出甑打量水后粮糟的温度降至23℃时，加入制备的大曲药成曲粉，翻拌均匀，加入大曲粉的量，为入窖发酵粮糟总重量的15％，然后入窖发酵、出窖、蒸馏取酒。

对比窖：将大米、高粱、糯米、玉米、小麦五种粮食粉碎后，按0.5:6:1：0.5：1:1的重量百分比混合后进行蒸煮糊化，当出甑打量水后粮糟的温度降至23℃时，加入普通浓香大曲药成曲粉，翻拌均匀，加入大曲粉的量，为入窖发酵粮糟总重量的15％，然后入窖发酵、出窖、蒸馏取酒。

将固态发酵条件下的对比窖及实验窖的出窖糟醅进行生物胺含量的测定，具体结果如表2所示，降解率(％)＝(对比窖-实验窖)/对比窖×100％。

表2奥默柯达酵母在多粮糟醅中对生物胺的降解率

由表3可知，Kodamaea ohmeri HJM菌对出窖糟醅中环戊胺的降解作用最好，达到96.07％，其余生物胺含量也降低明显，说明Kodamaea ohmeri HJM菌对白酒发酵过程中产生的生物胺有明显的降解作用。

实施例3：纯高粱发酵糟醅中HJM对生物胺的降解

同实施例2

将小麦粉碎后，加水进行润粉拌合，用YPD液体培养基进行多级种子扩大培养的菌种按12％的接种量接种到物料中，压制成型后入室安放，然后进行晾曲排潮。晾曲排潮时，当曲坯温度升高到35℃，打开门窗，排除潮气，降低室温，揭开草帘，将上、下层曲坯倒翻一次，当曲坯温度下降至25℃时，关闭门窗。晾曲排潮后，当曲坯温度再次上升到35℃时，不定期进行翻曲、通风，使曲坯在35～50℃温度范围内保温发酵12天，最后经合堆、翻堆、入库贮存各工艺步骤，培养制得大曲药成曲。入库贮存制得大曲药成曲。

实验窖：将高粱粉碎后进行蒸煮糊化，当出甑打量水后粮糟的温度降至25℃时，加入制备的大曲药成曲粉，翻拌均匀，加入大曲粉的量，为入窖发酵粮糟总重量的30％，然后入窖发酵、出窖，蒸馏取酒。

对比窖：将高粱粉碎后进行蒸煮糊化，当出甑打量水后粮糟的温度降至25℃时，加入普通浓香大曲药成曲粉，翻拌均匀，加入大曲粉的量，为入窖发酵粮糟总重量的30％，然后入窖发酵、出窖，蒸馏取酒。

将奥默柯达酵母HJM对高粱发酵糟醅中生物胺的降解率进行测定，具体结果如下：

表4奥默柯达酵母对高粱发酵糟醅中对生物胺的降解率

由表4可知，Kodamaea ohmeri HJM菌对高粱固态发酵糟醅中的生物胺同样有明显的降解作用。

虽然本发明已经通过具体实施方式对其进行了详细阐述，但是，本专业普通技术人员应该明白，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的变化，均属于本发明。