一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括以下原料：胰岛素、肌醇六磷酸、发芽糙米粉、阿魏酰聚糖、纳米氧化锌、甲壳素、亚硒酸钠。本发明提供的扩增培养基，成分明确，不含外源血清及动物源蛋白，安全性更高，添加剂中的肌醇六磷酸、发芽糙米粉有利于保持人皮肤成纤维细胞扩增过程中增殖的稳定性，提高细胞增长速率，添加剂中的阿魏酰聚糖、纳米氧化锌可以提高人皮肤成纤维细胞的增殖活性，避免细胞凋亡，进而提高增殖效率。还添加甲壳素和亚硒酸钠，对细胞起到抗氧化的保护作用。本发明还提供了一种用于人皮肤成纤维细胞扩增培养基的制备方法，制备过程简便，便于商业化。

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养基，尤其涉及一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基及其制备方法。

背景技术

成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞功能活动旺盛，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。成纤维细胞的独特性能帮助修复受损皮肤，并降低年龄老化对皮肤的影响。

皮肤的成纤维细胞广泛分布于真皮组织中，成纤维细胞通过分泌多种物质构成细胞外基质，从而形成结缔组织，对机体发挥结构性功能。成纤维细胞在人的一生中发挥重要作用，如在胚胎期指导皮肤形成，器官成熟后参与皮肤稳态的维持，促进损伤部位结构与功能的修复等。

成纤维细胞在人的一生中发挥重要作用，如在胚胎期指导皮肤形成，器官成熟后参与皮肤稳态的维持，促进损伤部位结构与功能的修复等。因此，体外培养自体皮肤成纤维细胞在组织工程，美容，医疗等领域具有很广泛的应用。

传统的皮肤成纤维细胞培养是在基础培养基中添加血清，但是血清的使用会带来风险隐患：血清中含有细胞生长抑制因子和毒性因子，有潜在细胞毒性；再加上血清组分复杂，批次间质量存在差异，增加了产品质量控制的难度和不稳定性；血清中潜在的病原微生物（如引起牛海绵状脑炎的朊病毒），给血清的使用带来了不容忽视的安全隐患；再加上血清培养基中的蛋白质很难通过普通分离方法彻底去除，从而造成细胞表达产物分离纯化难度较高，严重影响产品的最终质量。这些不利因素促使了培养方法的改进，用无血清细胞培养基替代血清培养基，现有的无血清培养基存在成分复杂，应用成本高，稳定性差，细胞增值率低等问题，亟需做出改进。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，不添加外源血清，安全性高，并且可以有效提高细胞的增殖效率。

本发明的目的之二在于提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基的制备方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括以下原料：胰岛素、肌醇六磷酸、发芽糙米粉、阿魏酰聚糖、纳米氧化锌、甲壳素、亚硒酸钠。

进一步地，所述添加剂在基础培养基中的浓度为：胰岛素45-55μg/mL、肌醇六磷酸18-25μg/mL、发芽糙米粉20-27μg/mL、阿魏酰聚糖15-20ng/mL、纳米氧化锌5-10ng/mL、甲壳素15-20μg/mL、亚硒酸钠18-21μg/mL。

进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

进一步地，所述纳米氧化锌的平均粒径为20-50nm。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

上述用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基的制备方法，包括以下步骤：取基础培养基加入胰岛素、肌醇六磷酸、发芽糙米粉、阿魏酰聚糖、纳米氧化锌、甲壳素、亚硒酸钠，混合均匀，过滤除菌即得。

进一步地，采用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，成分明确，不含外源血清及动物源蛋白，安全性更高，本发明提供的培养基包括基础培养基和添加剂，添加剂中的肌醇六磷酸、发芽糙米粉有利于保持细胞扩增过程中增殖的稳定性，提高细胞增长速率，添加剂中的阿魏酰聚糖、纳米氧化锌可以提高人皮肤成纤维细胞的增殖活性，避免细胞凋亡，进而提高增殖效率。本发明的培养基中还添加甲壳素和亚硒酸钠，对细胞起到抗氧化的保护作用。

2、本发明还提供了一种用于人皮肤成纤维细胞扩增培养基的制备方法，制备过程简便易操作，便于实现商业化。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，由DMEM/F12培养基和添加剂组成，添加剂在DMEM/F12培养基中的浓度为：胰岛素45μg/mL、肌醇六磷酸18μg/mL、发芽糙米粉20μg/mL、阿魏酰聚糖15ng/mL、平均粒径20nm的纳米氧化锌ng/mL、甲壳素15μg/mL、亚硒酸钠18μg/mL。

上述用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基的制备方法，包括以下步骤：取基础培养基加入胰岛素、肌醇六磷酸、发芽糙米粉、阿魏酰聚糖、纳米氧化锌、甲壳素、亚硒酸钠，混合均匀，采用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌即得。

实施例2

一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，由DMEM/F12培养基和添加剂组成，添加剂在DMEM/F12培养基中的浓度为：胰岛素50μg/mL、肌醇六磷酸20μg/mL、发芽糙米粉25μg/mL、阿魏酰聚糖18ng/mL、平均粒径20nm的纳米氧化锌8ng/mL、甲壳素17μg/mL、亚硒酸钠20μg/mL。

该用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基的制备方法和实施例1相同。

实施例3

一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，由DMEM/F12培养基和添加剂组成，添加剂在DMEM/F12培养基中的浓度为：胰岛素55μg/mL、肌醇六磷酸25μg/mL、发芽糙米粉27μg/mL、阿魏酰聚糖20ng/mL、平均粒径50nm的纳米氧化锌10ng/mL、甲壳素20μg/mL、亚硒酸钠21μg/mL。

该用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基的制备方法和实施例1相同。

对比例1

对比例1提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：省去发芽糙米粉，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：省去肌醇六磷酸，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：省去发芽糙米粉，将肌醇六磷酸的用量调整为38μg/mL其余均和实施例1相同。

对比例4

对比例4提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：省去阿魏酰聚糖，其余均和实施例1相同。

对比例5

对比例5提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：省去纳米氧化锌，其余均和实施例1相同。

对比例6

对比例6提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：将阿魏酰聚糖替换为壳聚糖，其余均和实施例1相同。

对比例7

对比例7提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：将阿魏酰聚糖替换为葡聚糖，其余均和实施例1相同。

对比例8

对比例8提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：省去甲壳素，其余均和实施例1相同。

对比例9

对比例9提供一种用于人皮肤成纤维细胞的扩增培养基，和实施例1的区别为：省去亚硒酸钠，其余均和实施例1相同。

实验例

取健康成年男性包皮环切术后的皮肤组织，清理后用无菌剪刀剪成包皮小块，PBS洗涤后采用组织块贴壁法进行人皮肤成纤维细胞的原代培养，待细胞融合度达到80-85%时按照1:2的比例进行传代培养，取P3代生长状态良好处于对数生长期的细胞进行实验。

取消化后的处于对数生长期的P3代人皮肤成纤维细胞加入PBS洗涤，离心后再分别加入实施例1和对比例1至9的培养基中，吹打成细胞悬液，调整细胞悬液的密度为1×10

表1

表2

由表1和表2可知，实施例1和各对比例相比差异显著（P＜0.05），在培养至第3d和第6d时，采用实施例1的培养基得到的细胞数量远远高于对比例1至9，并且在培养至第6d时，实施例1中细胞的成活率较高，说明本发明提供的无血清培养基有助于提高人皮肤成纤维细胞的增殖能力和保持细胞活性，降低细胞凋亡率。

对比例1至3中分别省去肌醇六磷酸或发芽糙米粉中的一种，或者在省去其中一种后调整另一组分的用量，制备的无血清培养基在用于细胞的扩增培养过程中细胞的增殖数量不及实施例1，并且细胞的存活率也有一定程度的降低，说明本发明的培养中通过添加肌醇六磷酸、发芽糙米粉有利于保持细胞扩增过程中增殖的稳定性，提高细胞增长速率，进而提高经扩增培养得到的人皮肤成纤维细胞数量，并且得到的人皮肤成纤维细胞凋亡率低，人皮肤成纤维细胞存活率更高。

对比例4至7中省去阿魏酰聚糖或纳米氧化锌中的一种，或将阿魏酰聚糖替换为其他的多糖，如壳聚糖和葡聚糖，制备的无血清培养基在用于细胞的扩增培养时，在培养至第3d和第6d时细胞的增殖数量不及实施例1，并且细胞的存活率也有一定程度的降低，说明本发明无血清培养基添加剂中的阿魏酰聚糖、纳米氧化锌协同作用，可以提高人皮肤成纤维细胞的增殖活性，避免人皮肤成纤维细胞凋亡，进而提高增殖效率。

对比例8至9中分别省去添加剂中的甲壳素或亚硒酸钠，得到的培养基在应用时，细胞的增殖数量和存活率和实施例1相比，均有一定程度的降低，说明添加剂中的甲壳素和亚硒酸钠，对人皮肤成纤维细胞起到抗氧化的保护作用，从而促进细胞增殖，提高细胞的存活率。

综上，本发明的无血清培养基通过添加剂中各成分的协同作用，有效提高人皮肤成纤维细胞的增殖活性，提高增殖效率和细胞的存活率，为人皮肤成纤维细胞的临床应用提供保障。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。