一种林麝香腺组织的三维重构方法

摘要

本发明提供了一种林麝香腺组织的三维重构方法，解决了现有技术中不能在组织和细胞形态结构层面开展林麝泌香机制和提高麝香产量方面进一步深入研究的技术问题。它包括对林麝香腺组织的取样、切片、染色、扫描、三维重构等等。本发明的林麝香腺组织的三维重构方法，基于林麝香腺组织利用组织切片染色实现了香腺组织离体可视化，得到了较好的应用效果；通过对林麝香腺组织的离体可视化方法对林麝香腺组织的生理结构进行研究，第一次将林麝香腺组织的三维离体结构展现出来，既丰富了林麝香腺组织的形态结构内容，同时为深入研究林麝泌香反应及提高麝香产量研究提供形态学依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种林麝香腺组织的三维重构方法。

背景技术

麝香是我国名贵中药，已有2000多年药用历史，居四大动物香料(麝香、龙诞香、灵猫香、海狸香)之首。其性温，味辛，归心、脾经，具有开窍醒神、活血通经、消肿止痛等功效，临床广泛用于热病神昏、中风痰厥、气郁暴厥、中恶昏迷、经闭、癥瘕、难产死胎、胸痹心痛、心腹暴痛、跌扑伤痛、痹痛麻木、痈肿瘰疬、咽喉肿痛等症。在国内收集的2621个中成药处方中需要麝香的有295种之多。利用11种动物药材生产的430种中成药中，如常用的六神丸、牛黄清心丸、人参再造丸、回生急救丹、安官牛黄丸、速效救心丸等，需用麝香的有186种，占总数的43％，且多属名贵中成药。药理研究证明，麝香能促进腺体的分泌，有发汗和利尿作用，兴奋中枢神经系统、呼吸中枢及心脏的作用，还有抗菌、消炎作用。近代用于治疗冠心病、心绞痛，还用于治疗癌症的实验。中西医临床经验证实，麝香对乙型脑炎、梅毒、麻疹等症亦有疗效。

麝香是由雄性林麝香囊中的香腺分泌液体熟化而成的，这与其生理结构和泌香机制关系密切。早在20世纪80年代，科研工作者就已对麝类的泌香机制展开了相关研究，但是由于技术条件限制，主要集中在麝香囊的解剖结构和组织结构方面。这些研究结果使人们对林麝香腺的宏观解剖结构与超微结构有了较为基础的了解，在组织和细胞形态结构层面为开展林麝泌香机制和提高麝香产量研究提供了可以借鉴的理论依据。

由于社会经济发展原因，上世界90年代至本世纪初，由于在麝类研究方面的经费投入大大减少，导致很多工作相继中断，林麝的泌香机制研究也步入困境。2010年以后，四川养麝研究所、重庆市药物种植研究所、北京林业大学、中国人民大学、陕西省动物研究所、西北农林科技大学、四川农业大学等纷纷加入林麝泌香机制研究，但碍于前人的研究历史久远，无法溯源，很多HE染色图片模糊不清，不能为现今的泌香机制研究提供有效的技术支持。并且林麝属国家二级保护动物，采样困难一直阻挠现行的研究，导致很多研究者对林麝的香腺结构认识不清，不能在组织和细胞形态结构层面开展林麝泌香机制和提高麝香产量方面进一步深入研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种林麝香腺组织的三维重构方法，以解决现有技术中不能在组织和细胞形态结构层面开展林麝泌香机制和提高麝香产量方面进一步深入研究的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种林麝香腺组织的三维重构方法，包括下述步骤：

(1)离体组织取样：在雄性林麝自然死亡后，立即取其香腺组织；

(2)固定：将步骤(1)得到的香腺组织立即浸入4％多聚甲醛溶液中避光保存24h以上，得到固定材料；

(3)脱水：取出步骤(2)中的固定材料，修整使切面平整，将切面修整平整后的固定材料依次在75％酒精中脱水4h、85％酒精中脱水2h、90％酒精中脱水2h、95％酒精中脱水1h、100％酒精Ⅰ中脱水30min、100％酒精Ⅱ中脱水30min，得到脱水材料；

(4)透明：将步骤(3)所得的脱水材料依次在无水乙醇和二甲苯的混合溶液中透明15-30min、二甲苯Ⅰ中透明15-30min、二甲苯Ⅱ中透明15-30min，得到透明材料；

(5)浸蜡包埋：将步骤(4)所得的透明材料依次在石蜡Ⅰ中浸蜡15-20min、石蜡Ⅱ中浸蜡30min-1h、石蜡Ⅲ中浸蜡30min-1h，然后包埋机包埋，得到蜡块；

(6)修块：将步骤(5)所得的蜡块外部不整齐的部分切去，使蜡块形状规则便于切片；

(7)切片：将步骤(6)中修整好的蜡块置于病理切片机上连续切片数张，切片厚度为4μm；

(8)摊片：将步骤(7)中所得切片漂浮于38-40℃温水表面展平，然后用防脱处理过的载玻片捞起；

(9)烤片及保存：将步骤(8)中捞起的切片放进60℃烘箱内烘烤，烘烤结束后室温保存；

(10)石蜡切片脱蜡至水：将经过步骤(9)处理后的切片依次放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、75％酒精5min，最后进行水洗；

(11)苏木素染色：将经过步骤(10)处理后的切片放入苏木素染液中染3-5min，然后水洗；接着放入分化液分化，然后水洗；最后返蓝液返蓝处理，流水冲洗；

(12)伊红染色：将经过步骤(11)处理后的切片依次放入85％酒精中脱水5min、95％酒精中脱水5min，然后放入伊红染液中染色5min；

(13)脱水封片：将经过步骤(12)处理后的切片依次放入无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、无水乙醇Ⅲ5min、二甲Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片；

(14)图像采集：将经过步骤(13)处理后的所有切片一一通过显微镜镜检切片是否平展无裂痕，进行图像采集分析，选择平展无裂痕的切片进行下一步骤，进行图像采集分析；

(15)扫描：将经过步骤(14)筛选出的所有切片依次放在切片扫描仪的显微镜头下快速移动进行扫描成像并通过切片扫描仪的软件控制系统将每一张切片均无缝拼接生成一整张全视野的数字化切片，每一张切片均得到一张数字化切片，得到数张数字化切片；

(16)三维重建：将步骤(15)中扫描的全部数字化切片通过3DView软件堆扫描图片进行堆栈构成一个三维立体图。

进一步的，所述步骤(7)中，连续切片的数量为150-1000张。

进一步的，所述步骤(7)中，连续切片的数量为450-850张。

进一步的，所述步骤(4)中，所述无水乙醇和二甲苯的混合溶液中，无水乙醇和二甲苯的体积比为1:1。

进一步的，所述步骤(8)中，所述防脱处理为经过多聚赖氨酸处理。

基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：

(1)本发明提供的林麝香腺组织的三维重构方法，通过对林麝香腺组织的离体可视化方法对林麝香腺组织的生理结构进行了研究，第一次将林麝香腺组织的三维离体结构展现出来，既丰富了林麝香腺组织的形态结构内容，同时为深入研究林麝泌香反应及提高麝香产量研究提供形态学依据；

(2)本发明提供的林麝香腺组织的三维重构方法，采用一个蜡块连续切片100张以上，全部做HE染色，然后把所有切片进行连续扫描，通过3DView软件堆扫描图片进行堆栈构成一个三维立体图，利用相关的三维软件(比如CaseViewer2.3软件)进行切割、旋转等操作以构成三维立体图，快速实现了香腺组织的可视化，通过本发明重现的林麝香腺组织离体可视化图像能清楚的展示出林麝香腺、肌肉层、皮脂腺和血管的分布，并且能更好展示林麝香腺导管与血管的走向及之间的对应关系；从三维重建的立体图像中可以看到香腺组织外被皮肤组织包裹，皮肤组织中含有大量皮脂腺和毛囊组织，为广大科研工作者提供了可视化的林麝香腺组织，为促进林麝泌香机制研究提供基础支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中3D软件成像图(三维立体图)；

图2是本发明实施例2中3D软件成像图(三维立体图)；

图3是本发明实施例3中3D软件成像图(三维立体图)；

图4是本发明实施例3中香囊组织切面图；

图5是本发明实施例3中皮脂腺分泌图；

图6是本发明实施例3中另一部位皮脂腺分泌图；

图7是本发明实施例3中血管组织放大图；

图8是本发明实施例3中另一部位血管组织放大图。

1、肌肉；2、皮脂腺；3、血管；4、香腺。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

一、实验器材及实验试剂说明

1、实验器材的说明，如下表1：

表1实验器材

表2、主要实验试剂的说明，如下表2：

表2主要实验试剂

二、实施例：

实施例1：

本发明提供的一种林麝香腺组织的三维重构方法，包括下述步骤：

(1)离体组织取样：在雄性林麝自然死亡后，立即取其香腺组织；

(2)固定：将步骤(1)得到的香腺组织立即浸入4％多聚甲醛溶液中避光保存24h，得到固定材料；

(3)脱水：采用脱水机脱水，取出步骤(2)中的固定材料，修整使切面平整，将切面修整平整后的固定材料依次在75％酒精中脱水4h、85％酒精中脱水2h、90％酒精中脱水2h、95％酒精中脱水1h、100％酒精Ⅰ中脱水30min、100％酒精Ⅱ中脱水30min，得到脱水材料；

(4)透明：将步骤(3)所得的脱水材料依次在无水乙醇和二甲苯的混合溶液中透明30min、二甲苯Ⅰ中透明30min、二甲苯Ⅱ中透明30min，得到透明材料；

所述无水乙醇和二甲苯的混合溶液中，无水乙醇和二甲苯的体积比为1:1；

(5)浸蜡包埋：将步骤(4)所得的透明材料依次在石蜡Ⅰ中浸蜡20min、石蜡Ⅱ中浸蜡30min、石蜡Ⅲ中浸蜡30min，然后包埋机包埋，得到蜡块；

(6)修块：将步骤(5)所得的蜡块外部不整齐的部分切去，使蜡块形状规则便于切片；

(7)切片：将步骤(6)中修整好的蜡块置于病理切片机上连续切片数张，切片厚度为4μm；

所述步骤(7)中，连续切片的数量为150张；

(8)摊片：采用组织摊片机摊片，将步骤(7)中所得切片漂浮于40℃温水表面展平，然后用防脱处理过的载玻片捞起；

所述防脱处理为经过多聚赖氨酸处理；

(9)烤片及保存：将步骤(8)中捞起的切片放进60℃烘箱内烘烤，烘烤结束后室温保存；

(10)石蜡切片脱蜡至水：将经过步骤(9)处理后的切片依次放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、75％酒精5min，最后进行水洗；

(11)苏木素染色：将经过步骤(10)处理后的切片放入苏木素染液中染5min，然后水洗；接着放入分化液分化，然后水洗；最后返蓝液返蓝处理，流水冲洗；

(12)伊红染色：将经过步骤(11)处理后的切片依次放入85％酒精中脱水5min、95％酒精中脱水5min，然后放入伊红染液中染色5min；

(13)脱水封片：将经过步骤(12)处理后的切片依次放入无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、无水乙醇Ⅲ5min、二甲Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片；

(14)图像采集：将经过步骤(13)处理后的所有切片一一通过显微镜(采用正置光学显微镜，数码显微成像系统)镜检切片是否平展无裂痕，进行图像采集分析，选择平展无裂痕的切片进行下一步骤；

(15)扫描：将经过步骤(14)筛选出的所有切片依次放在切片扫描仪的显微镜头下快速移动进行扫描成像并通过切片扫描仪的软件控制系统将每一张切片均无缝拼接生成一整张全视野的数字化切片，每一张切片均得到一张数字化切片，得到数张数字化切片；

(16)三维重建：将步骤(15)中扫描的全部数字化切片通过3DView软件堆扫描图片进行堆栈构成一个三维立体图；所述3DView软件为CaseViewer2.3软件，可利用该软件进行切割、旋转等操作以构成三维立体图。

实施例2：

本发明提供的一种林麝香腺组织的三维重构方法，包括下述步骤：

(1)离体组织取样：在雄性林麝自然死亡后，立即取其香腺组织；

(2)固定：将步骤(1)得到的香腺组织立即浸入4％多聚甲醛溶液中避光保存48h，得到固定材料；

(3)脱水：采用脱水机脱水，取出步骤(2)中的固定材料，修整使切面平整，将切面修整平整后的固定材料依次在75％酒精中脱水4h、85％酒精中脱水2h、90％酒精中脱水2h、95％酒精中脱水1h、100％酒精Ⅰ中脱水30min、100％酒精Ⅱ中脱水30min，得到脱水材料；

(4)透明：将步骤(3)所得的脱水材料依次在无水乙醇和二甲苯的混合溶液中透明15min、二甲苯Ⅰ中透明15min、二甲苯Ⅱ中透明15min，得到透明材料；

所述无水乙醇和二甲苯的混合溶液中，无水乙醇和二甲苯的体积比为1:1；

(5)浸蜡包埋：将步骤(4)所得的透明材料依次在石蜡Ⅰ中浸蜡15min、石蜡Ⅱ中浸蜡45min、石蜡Ⅲ中浸蜡45min，然后包埋机包埋，得到蜡块；

(6)修块：将步骤(5)所得的蜡块外部不整齐的部分切去，使蜡块形状规则便于切片；

(7)切片：将步骤(6)中修整好的蜡块置于病理切片机上连续切片数张，切片厚度为4μm；

所述步骤(7)中，连续切片的数量为1000张；

(8)摊片：采用组织摊片机摊片，将步骤(7)中所得切片漂浮于39℃温水表面展平，然后用防脱处理过的载玻片捞起；

所述防脱处理为经过多聚赖氨酸处理；

(9)烤片及保存：将步骤(8)中捞起的切片放进60℃烘箱内烘烤，烘烤结束后室温保存；

(10)石蜡切片脱蜡至水：将经过步骤(9)处理后的切片依次放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、75％酒精5min，最后进行水洗；

(11)苏木素染色：将经过步骤(10)处理后的切片放入苏木素染液中染3min，然后水洗；接着放入分化液分化，然后水洗；最后返蓝液返蓝处理，流水冲洗；

(12)伊红染色：将经过步骤(11)处理后的切片依次放入85％酒精中脱水5min、95％酒精中脱水5min，然后放入伊红染液中染色5min；

(13)脱水封片：将经过步骤(12)处理后的切片依次放入无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、无水乙醇Ⅲ5min、二甲Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片；

(14)图像采集：将经过步骤(13)处理后的所有切片一一通过显微镜(采用正置光学显微镜，数码显微成像系统)镜检切片是否平展无裂痕，进行图像采集分析，选择平展无裂痕的切片进行下一步骤；

(15)扫描：将经过步骤(14)筛选出的所有切片依次放在切片扫描仪的显微镜头下快速移动进行扫描成像并通过切片扫描仪的软件控制系统将每一张切片均无缝拼接生成一整张全视野的数字化切片，每一张切片均得到一张数字化切片，得到数张数字化切片；

(16)三维重建：将步骤(15)中扫描的全部数字化切片通过3DView软件堆扫描图片进行堆栈构成一个三维立体图；所述3DView软件为CaseViewer2.3软件，可利用该软件进行切割、旋转等操作以构成三维立体图。

实施例3：

一种林麝香腺组织的三维重构方法，包括下述步骤：

(1)离体组织取样：在雄性林麝自然死亡后，立即取其香腺组织；

(2)固定：将步骤(1)得到的香腺组织立即浸入4％多聚甲醛溶液中避光保存36h，得到固定材料；

(3)脱水：采用脱水机脱水，取出步骤(2)中的固定材料，修整使切面平整，将切面修整平整后的固定材料依次在75％酒精中脱水4h、85％酒精中脱水2h、90％酒精中脱水2h、95％酒精中脱水1h、100％酒精Ⅰ中脱水30min、100％酒精Ⅱ中脱水30min，得到脱水材料；

(4)透明：将步骤(3)所得的脱水材料依次在无水乙醇和二甲苯的混合溶液中透明22min、二甲苯Ⅰ中透明22min、二甲苯Ⅱ中透明22min，得到透明材料；

所述无水乙醇和二甲苯的混合溶液中，无水乙醇和二甲苯的体积比为1:1

(5)浸蜡包埋：将步骤(4)所得的透明材料依次在石蜡Ⅰ中浸蜡18min、石蜡Ⅱ中浸蜡1h、石蜡Ⅲ中浸蜡1h，然后采用包埋机包埋，得到蜡块；

(6)修块：将步骤(5)所得的蜡块外部不整齐的部分切去，使蜡块形状规则便于切片；

(7)切片：将步骤(6)中修整好的蜡块置于病理切片机上连续切片数张，切片厚度为4μm；

连续切片的数量为750张；

(8)摊片：采用组织摊片机摊片，将步骤(7)中所得切片漂浮于40℃温水表面展平，然后用防脱处理过的载玻片捞起；

所述防脱处理为经过多聚赖氨酸处理；

(9)烤片及保存：将步骤(8)中捞起的切片放进60℃烘箱内烘烤，烘烤结束后室温保存；

(10)石蜡切片脱蜡至水：将经过步骤(9)处理后的切片依次放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、75％酒精5min，最后进行水洗；

(11)苏木素染色：将经过步骤(10)处理后的切片放入苏木素染液中染4min，然后水洗；接着放入分化液分化，然后水洗；最后返蓝液返蓝处理，流水冲洗；

(12)伊红染色：将经过步骤(11)处理后的切片依次放入85％酒精中脱水5min、95％酒精中脱水5min，然后放入伊红染液中染色5min；

(13)脱水封片：将经过步骤(12)处理后的切片依次放入无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、无水乙醇Ⅲ5min、二甲Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片；

(14)图像采集：将经过步骤(13)处理后的所有切片一一通过显微镜(采用正置光学显微镜，数码显微成像系统)镜检切片是否平展无裂痕，进行图像采集分析，选择平展无裂痕的切片进行下一步骤；

(15)扫描：将经过步骤(14)筛选出的所有切片依次放在切片扫描仪的显微镜头下快速移动进行扫描成像并通过切片扫描仪的软件控制系统将每一张切片均无缝拼接生成一整张全视野的数字化切片，每一张切片均得到一张数字化切片，得到数张数字化切片；

(16)三维重建：将步骤(15)中扫描的全部数字化切片通过3DView软件堆扫描图片进行堆栈构成一个三维立体图；所述3DView软件为CaseViewer2.3软件，可利用该软件进行切割、旋转等操作以构成三维立体图。

实施例4：

在本实施例中，所述步骤(7)中，连续切片的数量为450张；其余同实施例3。

实施例5：

在本实施例中，所述步骤(7)中，连续切片的数量为850张；其余同实施例3。

如图1-图8所示：

通过本发明重现的林麝香腺组织离体可视化图像能清楚的展示出林麝香腺、肌肉层、皮脂腺和血管的分布，并且能更好展示林麝香腺导管与血管的走向及之间的对应关系；从三维重建的立体图像中可以看到香腺组织外被皮肤组织包裹，皮肤组织中含有大量皮脂腺和毛囊组织。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。