地中海弧菌烈性噬菌体vB_VmeM-Yong及其应用

摘要

本发明公开了一种地中海弧菌高效烈性噬菌体vB_VmeM‑Yong及其应用，涉及地中海弧菌污染和感染的生物处理。vB_VmeM‑Yong是首株以致病性地中海弧菌为靶标分离获得的噬菌体。vB_VmeM‑yong保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17098。vB_VmeM‑Yong可专一性裂解致病性地中海弧菌，潜伏期约为40min，裂解期为40min‑150min。vB_VmeM‑Yong的应用，用于特异性地抑制、杀死高致病性地中海弧菌。其对紫菜有明显的保护作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原菌的噬菌体，尤其是涉及一种地中海弧菌烈性噬菌体vB_VmeM-Yong及其应用。

背景技术

地中海弧菌(Vibrio mediterranei)属于弧菌科，弧菌属。弧菌属是弧菌科的一个主要类群，其成员广泛存在于海洋环境中，可分为致病性的或非致病性的。自1986年由Pujalte和Garay第一次描述地中海弧菌以来，该细菌已从各种海洋生物中分离出来，如植物、贝类、其他海洋无脊椎动物和来自不同地理区域的鱼类。地中海弧菌117-T6株就是从爆发黄斑病的条斑紫菜Pyropia yezoensis丝状体的典型患病样本中分离鉴定得到的，其可以导致多种紫菜丝状体呈现致死性黄斑病。在我国紫菜养殖有着多年的历史，大规模的紫菜生产集团也在形成，但是对紫菜病害的防治，特别是对紫菜危害最大的黄斑病没有有效的防治措施。严重影响了养殖户的经济收入和紫菜养殖业的健康持续发展。

噬菌体(phage)是感染细菌、真菌的病毒。裂解性噬菌体又可以称为烈性噬菌体或者毒性噬菌体(virulent phage)。裂解性噬菌体进入宿主菌体内后，开始了自己的生命循环，进行不断地复制、增殖得到大量的子代噬菌体，宿主菌被裂解。烈性噬菌体在抗菌药物研发方面具有巨大的潜力和优势。烈性噬菌体特异性侵染目标细菌，将其裂解，并且不感染人和动、植物，也不会对正常微生物群落和环境造成污染。噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内。

研发能够高效裂解地中海弧菌的噬菌体对养殖业的健康、持续发展具有重要的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可高效、快速地裂解地中海弧菌的噬菌体及其应用。该噬菌体特异性感染、裂解地中海弧菌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种以地中海弧菌117-T6株为靶标分离获得的特异侵染地中海弧菌的裂解性噬菌体，依据噬菌体命名原则命名vB_VmeM-Yong(即Virus of bacteria，Vibrio mediterranei，Myoviridae的缩写)，分类上属于肌尾科Myoviridae。vB_VmeM-Yong于2019年1月22日保藏于微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17098，保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

该噬菌体的生物学特征如下：噬菌体vB_VmeM-Yong具有呈现二十面体近似球形的头部，直径109nm(±9nm)，具有可收缩的尾部，长度320nm(±50nm)；噬菌体vB_VmeM-Yong在地中海弧菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑；噬菌体vB_VmeM-Yong可裂解地中海弧菌，使菌液澄清化；噬菌体vB_VmeM-Yong的宿主范围具有种特异性；vB_VmeM-Yong潜伏期约为40min，裂解期为40min-150min。

上述噬菌体vB_VmeM-Yong的分离纯化方法，具体包括如下步骤：

(1)地中海弧菌117-T6的活化、培养

取117-T6菌种划线接种于含1.5％(W/V)琼脂的海水营养固体培养基平板上，26℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL海水营养液体培养基的试管内，摇床(26℃、180rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL海水营养液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(26℃、180rpm)上扩大培养至菌液OD

其中海水营养培养基配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，加入过滤海水定容至1L，pH7.2，高压灭菌。

(2)噬菌体的富集

噬菌体vB_VmeM-Yong分离自浙江省宁波市北仑区梅山岛海水(North latitude：29.7831421；East longitude：121.9586032)。从海边采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室处理。将采集的水样充分颠倒混匀后10000g离心10min，取上清80mL到250mL锥形瓶中。锥形瓶中再加入40ml 3×海水营养培养基和2mL新鲜培养的对数期117-T6菌液(OD

点板验证：取融化状态下于42-45℃孵育超过半小时的含0.7％(W/V)琼脂的海水营养培养基与500μL对数期117-T6菌液迅速混匀，立即倾倒于含1.5％(W/V)琼脂的海水营养培养基单层平板上，铺平，冷却凝固后，点2μL噬菌体原液于平板上，28℃过夜培养。翌日双层平板上点噬菌体富集液出出现明显透明噬菌斑。

噬菌体的进一步富集：取两根试管，其中一根用作实验组，添加如下组分：6mL上述噬菌体富集液、2mL 3×海水营养培养基、100μL新鲜的对数期117-T6菌液：对照组添加如下组分：8ml 1×海水营养培养基+100μL新鲜的对数期117-T6菌液。将试管置于26℃，180rpm摇床培养过夜。实验组培养液较对照组明显澄清，将培养液4℃，10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，滤液即为的二次噬菌体富集液。

其中3×海水营养培养基配方：蛋白胨30g，牛肉膏9g，加入过滤海水定容至1L，pH7.2，121℃高压灭菌20min。

(3)噬菌体的分离纯化

将步骤(2)获得的二次噬菌体富集液用海水营养液体培养基做10倍系列梯度稀释，分别取10

(4)噬菌体的扩大培养

将步骤(3)纯化得到的vB_VmeM-Yong原液与新鲜的对数期117-T6菌液按体积200μL∶20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期117-T6菌液作为对照组，一起放置于摇床于26℃，180rpm培养，至实验组与对照组液体比出现肉眼可见明显差异时停止培养，将噬菌体vB_VmeM-Yong-菌培养裂解液置于4℃保存。

(5)噬菌体悬液制备

取步骤(4)制备的噬菌体vB_VmeM-Yong-菌培养裂解液离心在4℃，10000g离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_VmeM-Yong悬液。

上述裂解性噬菌体vB_VmeM-Yong的应用，用于抑制地中海弧菌生长、杀死对紫菜构成严重危害的地中海弧菌。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种新的裂解性噬菌体vB_VmeM-Yong及其分离方法和应用，是首株分离、鉴定的地中海弧菌噬菌体。该病毒具有高特异性，专一性感染、裂解对紫菜构成严重危害的地中海弧菌117-T6，这是保证生态安全的重要前提；此裂解病毒vB_VmeM-Yong具有高复制率、高感染率的特点，可高效裂解地中海弧菌；操作简单，且不会造成环境污染；是一种新型的控制地中海弧菌的技术，具有良好的发展前景。

综上所述，本发明提供一种新的噬菌体vB_VmeM-Yong及其分离方法和应用，该噬菌体可高效、快速、专一地感染、杀死致病性地中海弧菌。

附图说明

图1为噬菌体vB_VmeM-Yong在地中海弧菌117-T6双层平板上的噬菌斑形态

图2左侧试管为地中海弧菌117-T6对照菌液，中、右侧试管中的117-T6菌液因添加了噬菌体vB_VmeM-Yong而变澄清。

图3为负染的噬菌体vB_VmeM-Yong的透射电镜图，其中右侧为放大的噬菌体。

图4为vB_VmeM-Yong的一步生长曲线

图5为噬菌体vB_VmeM-Yong对V.mediterranei 117-T6感染的坛紫菜丝状体的保护效果

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述

实施例1

噬菌体vB_VmeM-Yong的分离纯化

水样采自浙江省宁波市北仑区梅山岛海水；靶标宿主菌为紫菜的致病菌地中海弧菌(Vibrio mediterranei)117-T6，具体制备方法如下：

(1)地中海弧菌117-T6的活化、培养

取117-T6菌种划线接种于含1.5％(W/V)琼脂的海水营养固体培养基平板上，26℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL海水营养液体培养基的试管内，摇床(26℃、180rpm)培养12小时。从试管中取1mL液体培养液1∶100(V/V)稀释至装有100mL海水营养液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床(26℃、180rpm)上扩大培养至菌液OD

(2)噬菌体的富集

噬菌体vB_VmeM-Yong分离自浙江省宁波市北仑区梅山岛海水(North latitude：29.7831421；East longitude：121.9586032)。从海边采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室处理。将采集的水样充分颠倒混匀后10000g离心10min，取上清80mL到250mL锥形瓶中。锥形瓶中再加入40ml 3×海水营养培养基和2mL新鲜培养的对数期117-T6菌液(OD

点板验证：取融化状态下于42-45℃孵育超过半小时的含0.7％(W/V)琼脂的海水营养培养基与500μL对数期117-T6菌液迅速混匀，立即倾倒于含1.5％(W/V)琼脂的海水营养培养基单层平板上，铺平，冷却凝固后，点2μL噬菌体原液于平板上，28℃过夜培养。翌日双层平板上点噬菌体富集液出出现明显透明噬菌斑。

噬菌体的进一步富集：取两根试管，其中一根用作实验组，添加如下组分：6mL上述噬菌体富集液、2mL 3×海水营养培养基、100μL新鲜的对数期117-T6菌液；对照组添加如下组分：8ml 1×海水营养培养基+100μL新鲜的对数期117-T6菌液。将试管置于26℃，180rpm摇床培养过夜。实验组培养液较对照组明显澄清，将培养液4℃，10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，滤液即为的二次噬菌体富集液。

(3)噬菌体的分离纯化

将步骤(2)获得的二次噬菌体富集液用海水营养液体培养基做10倍系列梯度稀释，分别取10

(4)噬菌体的扩大培养

将步骤(3)纯化得到的vB_VmeM-Yong原液与新鲜的对数期117-T6菌液按体积200μL∶20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期117-T6菌液作为对照组，一起放置于摇床于26℃，180rpm培养，至实验组与对照组液体比出现肉眼可见明显差异时停止培养，将噬菌体vB_VmeM-Yong-菌培养裂解液置于4℃保存。

(5)噬菌体悬液制备

取步骤(4)制备的噬菌体vB_VmeM-Yong-菌培养裂解液离心在4℃，10000g离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_VmeM-Yong悬液。

将纯化的噬菌体vB_VmeM-Yong与对数生长期的地中海弧菌混合感染，进行噬菌斑实验，可以得到形态大小一致的透明的圆形噬菌斑，其周围无晕环，边缘清晰规则(图1)。将噬菌体vB_VmeM-Yong添加至地中海弧菌菌液后，菌体裂解菌液变得澄清(图2)。

其中海水营养培养基的配方如下：蛋白胨10g，牛肉膏3g，，用过滤海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min。

3×海水营养培养基配方如下：蛋白胨30g，牛肉膏9g，加入过滤海水定容至1L，pH7.2，121℃高压灭菌20min

该纯化的噬菌体保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.17098，保藏日期2019年1月22日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

实施例2

噬菌体vB_VmeM-Yong的形态观察

取实施例1步骤(5)制备的噬菌体vB_VmeM-Yong悬液，4℃下10000g离心10min，取上清在4℃下58000g离心，1h，弃上清，沉淀加入200μL的经过棉花过滤并经常规高压灭菌且冷却的海水悬浮，得到噬菌体悬液。用移液枪取一滴该噬菌体悬液至铜网上，静置10min后用中性滤纸从侧面吸去多余水分。在铜网上滴一滴3％乙酸双氧铀，负染色20s后，用中性滤纸从侧面吸去染色剂。静置10min晾干后使用透射电镜(日立H-7650)观察噬菌体形态。

结果如图3所示，该噬菌体vB_VmeM-Yong具有呈现二十面体近似球形的结构的头部，直径109nm(±9nm)，具有可收缩的尾部，长度320nm(±50nm)。

实施例3

噬菌体vB_VmeM-Yong基因组序列测定和比对

噬菌体vB_VmeM-Yong基因组测序采用Illumina MiSeq高通量测序平台。步骤包括基因组提取、基因组文库构建、上机测序及序列拼接。

基因组提取：在噬菌体悬液中加入DNase I和RNase A至终浓度1μg/mL，37℃过夜消化，80℃灭活15min。体系中加入裂解液(0.5％SDS，50μg/mL蛋白酶K，20nM EDTA，均为终浓度)，56℃孵育1h。加入等体积平衡酚，温和振荡后4℃下10000g离心5min。收集上层液体，加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，温和振荡后4℃下10000g离心5min。收集上层液体，加入等体积氯仿，充分混匀后10000g离心5min，收集上层液体，重复2次。加入等体积异丙醇，-20℃放置至少30min，4℃下10000g离心20min，沉淀用75％乙醇洗2次。将核酸沉淀用去离子水重悬，-20℃保存。

基因组文库构建：使用试剂盒NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit forIllumina(#E7645)构建基因组文库。步骤包括1、基因组片段化：将提取的噬菌体基因组用Covaris超声波破碎仪(30s，90s，11min，L)随机打断，得到的DNA片段长度主要集中在500bp。2、末端修复：取50μL打断后的DNA片段到无核酸酶的1.5ml EP管中，分别加入3μLNEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix和7μL NEBNext Ultra II End Prep ReactionB uffer后混匀。20℃孵育30min，65℃孵育30min，4℃保存。3、添加测序接头：在上步体系中加入30μL NEBNext Ultra II Ligation Master Mix、1μL NEBNext Ligation Enhancer、2.5μL NEBNext Adaptor，混匀。20℃下孵育15min。加入3μL

上机测序：照Agilent High sensitivity DNA kit 2100说明书鉴定纯化后PCR产物的片段分布。通过实时荧光定量PCR进行定量，根据上机需求量将DNA样品进行混合，最后加入NaOH使DNA变性为单链。使用Illumina PE300试剂盒进行Illumina MiSeq测序。

序列拼接：通过FastQC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对测序数据进行质量评估，然后用Trimmomatic v0.36软件去除低质量值的测序数据，最后使用SPAdes v3.13.0软件对过滤后的数据进行拼接，最终完成全基因组测序工作。

序列比对与注释：用NCBI提供的BLAST工具，将vB_VmeM-Yong基因组与所有序列比对。用RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology，http：//rast.nmpdr.org)和tRNAscan-SE(http：//lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE)对vB_VmeM-Yong基因组进行功能注释。

结果发现：vB_VmeM-Yong基因组为双链DNA(dsDNA)，全长为290537bp，GC含量为45.87％，具体核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.1所示。BLAST比对表明vB_VmeM-Yong序列不存在于已有数据库中，是一株未被报道的新的肌尾科噬菌体。vB_VmeM-Yong编码的terminase在Genbank中进行Blastp比对，与该数据库中序列的最高相似度为44.74％(图4)。

实施例4

噬菌体vB_VmeM-Yong的宿主范围检定

将地中海弧菌117-T6株和待试菌株(详见表1)分别培养至对数期(OD

表1噬菌体vB_VmeM-Yong的宿主范围检定结果

“+”代表感染，“-”代表不感染

实施例5

噬菌体滴度测定

使用双层平板法进行噬菌体vB_VmeM-Yong的滴度测定，具体操作如下：将融化后的海水营养半固体培养基，即含有0.7％(W/V)琼脂的海水营养培养基分装成5mL/管，置于45℃恒温水浴中30min以上至温度恒定，同时将海水营养固体培养基平板放置于37℃恒温培养箱中预热30min。将噬菌体原液用海水营养液体培养基做10倍梯度稀释，根据实施例1噬菌体纯化实验的结果推算出便于噬菌斑计数的稀释度，取10

实施例6

噬菌体vB_VmeM-Yong增殖特性研究-一步生长实验

取新鲜培养的浓度为1.93×10

实施例7

噬菌体vB_VmeM-Yong对坛紫菜丝状体的保护实验

以“浙东1号”坛紫菜自由丝状体作为实验对象，将紫菜丝状体分为三组，分别为实验组、对照组、和空白组。实验组和对照组添加最终浓度为1×10

空白组藻丝如常，实验进行到第5天结束，对照组的累积死亡率为100％，实验组累积死亡率约为34.1％(图5)，实验组累计死亡率比对照组小65.9％，即噬菌体vB_VmeM-Yong对坛紫菜丝状体的相对保护率为65.9％。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。