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基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用。该重组疫苗的活性成分为重组病毒rVSV‑SARS‑CoV/2‑RBD,为将水疱性口炎病毒的糖蛋白G替换为嵌合囊膜蛋白S后得到的病毒;所述嵌合囊膜蛋白S为将SARS‑CoV囊膜蛋白S的RBD替换为SARS‑CoV‑2囊膜蛋白S的RBD后得到的蛋白;所述SARS‑CoV囊膜蛋白S的RBD的氨基酸序列为SARS‑CoV囊膜蛋白S氨基酸序列的第315‑536位;所述SARS‑CoV‑2囊膜蛋白S的RBD的氨基酸序列为SARS‑CoV‑2囊膜蛋白S氨基酸序列的第319‑541位。该重组病毒对新冠病毒的疫苗研制具有重要意义。

著录项

  • 公开/公告号CN112375748A

    专利类型发明专利

  • 公开/公告日2021-02-19

    原文格式PDF

  • 申请/专利权人 中国科学院动物研究所;

    申请/专利号CN202110027659.6

  • 申请日2021-01-11

  • 分类号C12N7/01(20060101);C12N15/86(20060101);G01N33/68(20060101);A61K39/215(20060101);A61P31/14(20060101);C12R1/93(20060101);

  • 代理机构11245 北京纪凯知识产权代理有限公司;

  • 代理人关畅

  • 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院

  • 入库时间 2023-06-19 09:57:26

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域,具体涉及基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新出现的β属冠状病毒。病毒基因组分析显示,该病毒与同属的SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome-coronavirus)非常接近(89.1%的核苷酸相似性),感染后会引起人类肺炎等症状。新型冠状病毒为单股正链RNA病毒,具有囊膜。在电镜下观察,病毒颗粒呈圆形或椭圆形,具有放射状突起。这种放射状突起是冠状病毒的特征结构,它由囊膜蛋白Spike(S)构成。S蛋白是冠状病毒的重要结构蛋白,在病毒侵入宿主细胞的过程中起着关键作用。S蛋白还是冠状病毒中和抗体的靶点,是疫苗研究的重要靶蛋白。

现已将由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)纳入《中 华人民共和国传染病防治法》规定的“乙类”传染病,并采取“甲类”传染病的预防、控制措施。 COVID-19流行病学特点如下:主要传播途径为经呼吸道飞沫传播,亦可通过接触传播;人 群普遍易感,老年人及有基础疾病者感染后病情较重,儿童及婴幼儿也有发病。基于目前的 流行病学调查,患者潜伏期一般为3-7天,最长不超过14天。临床表现多为发热、乏力、干 咳。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。重症患者表现为呼吸困难、急性呼吸窘迫综合 征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。

由于目前尚无新型冠状病毒肺炎的特异药物,所以对患者主要开展对症治疗和支持治疗。卧床休息,保证充分热量;注意水、电解质平衡,维持内环境稳定;密切监测生命体征、指氧饱和度等。抗病毒治疗方法包括:α-干扰素雾化吸入及服用洛匹那韦/利托那韦。另外,新型冠状病毒感染的肺炎属于中医疫病范畴,病因为感受疫戾之气,可使用中医方案进行辩证治疗。

目前针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的疫苗和药物还处于临床试验或更早期的阶段,亟须进行全面评价和进一步优化。本申请发明人前期以水疱性口炎病毒(VesicularStomatitis Virus,VSV)为载体,将VSV病毒的糖蛋白G替换成新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的囊膜蛋白S,构建了复制型的重组病毒rVSV-SARS-CoV-2。此重组病毒表面表达新型冠状病毒囊膜蛋白S,可以模拟新冠病毒入侵细胞的过程,并能激发机体产生针对SARS-CoV-2的免疫反应,通过喷鼻免疫可以在食蟹猴体内产生高滴度的新冠病毒中和抗体,并产生针对新冠病毒的保护。近期也有两篇文献:Replication-Competent Vesicular StomatitisVirus Vaccine Vector Protects against SARS-CoV-2-Mediated Pathogenesis inMice(Cell Host Microbe. 2020 Sep 9;28(3):465-474)和A single dose ofrecombinant VSV-ΔG-spike vaccine provides protection against SARS-CoV-2challenge(bioRxiv 2020.06.18.160655)报道用VSV作为载体,表达SARS-CoV-2的囊膜蛋白S作为抗原,在小动物模型中能产生针对SARS-CoV-2的免疫反应和保护。这两篇文献使用的复制型重组病毒与本申请发明人在前期发明中构建的rVSV-SARS-CoV-2相同,其诱导的免疫反应和保护效果也相近,都仍需进一步提高。

发明内容

为了研制免疫保护效果更好的新型冠状病毒疫苗,本发明提供了基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用。

第一方面,本发明保护一种重组病毒。

本发明保护的重组病毒为如下1)或2):

1)将水疱性口炎病毒的糖蛋白G替换为嵌合囊膜蛋白S后得到的病毒;所述嵌合囊膜蛋白S为将SARS-CoV囊膜蛋白S的RBD(受体结合结构域,Receptor binding domain)替换为SARS-CoV-2囊膜蛋白S的RBD后得到的蛋白;

2)将水疱性口炎病毒的糖蛋白G替换为嵌合囊膜蛋白S后得到的病毒;所述嵌合囊膜蛋白S为将SARS-CoV囊膜蛋白S的RBD替换为SARS-CoV-2囊膜蛋白S的RBD,且将SARS-CoV囊膜蛋白S氨基酸序列的第1261-1279位删除后得到的蛋白;

所述SARS-CoV囊膜蛋白S的RBD的氨基酸序列为SARS-CoV囊膜蛋白S氨基酸序列的第315-536位;

所述SARS-CoV-2囊膜蛋白S的RBD的氨基酸序列为SARS-CoV-2囊膜蛋白S氨基酸序列的第319-541位。

上述重组蛋白中,所述SARS-CoV-2囊膜蛋白S氨基酸序列为序列表中的序列4。

所述SARS-CoV囊膜蛋白S氨基酸序列为序列表中的序列6。

进一步的,所述嵌合囊膜蛋白S的氨基酸序列为a)或b)或c):

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质;

b)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质;

c)与序列2所示的氨基酸序列具有85%或85%以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

更进一步的,所述重组病毒为将水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的病毒。所述嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列为序列表中的序列1。

第二方面,本发明保护一种重组病毒。

本发明保护的重组病毒是将重组病毒载体转染病毒包装细胞,然后进行细胞培养后得到的;所述重组病毒载体为如下A)或B):

A)将水疱性口炎病毒载体中的水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的载体;

B)在A)所述的重组病毒载体中插入报告基因序列后得到的载体。

进一步的,所述嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列为序列表中的序列1。

所述报告基因可为现有技术中常用的报告基因,如eGFP基因(序列表中的序列14所示)、Luciferase基因。

更进一步的,所述A)中,所述重组病毒载体为将序列1所示的DNA分子插入rVSVΔG载体的酶切位点MluI和NotI之间后得到的载体。

所述rVSVΔG载体包括T7启动子序列、缺失糖蛋白G编码基因序列的水疱性口炎病毒Indiana毒株全基因组序列和HDV终止子序列,其核苷酸序列为序列表中的序列7。

所述病毒包装细胞可为现有技术中常用的用于病毒包装的细胞系,如293T细胞、Vero细胞和BHK细胞,具体可为Vero细胞。

所述重组病毒是将所述重组病毒载体、表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒及表达T7RNA聚合酶的质粒共同转染所述病毒包装细胞,然后进行细胞培养后得到的。

所述表达VSV的N蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的N蛋白编码基因序列(序列表中的序列8),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达VSV的P蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的P蛋白编码基因序列(序列表中的序列9),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达VSV的L蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的L蛋白编码基因序列(序列表中的序列10),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达VSV的M蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的M蛋白编码基因序列(序列表中的序列11),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达VSV的G蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的G蛋白编码基因序列(序列表中的序列12),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达T7 RNA聚合酶的质粒具体为将T7RNA聚合酶编码基因序列(序列表中的序列13),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。

所述SARS-CoV-2具体为SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1毒株(GenBank:NC_045512.2);

所述SARS-CoV具体为SARS-CoV BJ01毒株(GenBank:AY278488.2);

所述水疱性口炎病毒具体为水疱性口炎病毒Indiana毒株(GenBank:KF935251.1)。

上述重组病毒载体也属于本发明的保护范围。

第三方面,本发明保护上述重组病毒或上述重组病毒载体的新用途。

本发明保护上述重组病毒或上述重组病毒载体在如下X1)-X3)中任一种中的应用:

X1)制备新型冠状病毒疫苗;

X2)制备预防和/或治疗新型冠状病毒导致的疾病的产品;

X3)筛选新型冠状病毒入侵抑制剂。

上述应用中,所述筛选新型冠状病毒入侵抑制剂具体体现在用于检测新型冠状病毒疫苗诱导产生的中和抗体滴度。

第四方面,本发明保护一种用于预防和/或治疗新型冠状病毒导致的疾病的产品。

本发明保护的用于预防和/或治疗新型冠状病毒导致的疾病的产品的活性成分为上述重组病毒或上述重组病毒载体。

上述任一所述应用或产品中,所述产品为新型冠状病毒疫苗。

上述任一所述应用或产品中,所述新型冠状病毒具体为SARS-CoV-2。

所述新型冠状病毒导致的疾病具体为新型冠状病毒导致的COVID-19。

本发明所涉及的概念如下:

疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物,经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后,免疫系统便会产生一定的保护物质,如抗体等;当动物再次接触到这种病原菌时,动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆,制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。

水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)为单股负链不分节段RNA病毒,基因组长约11Kb,结构简单。从3'到5'依次转录出5条mRNA,分别编码5种蛋白:核衣壳蛋白N(nucleocapsid protein)、磷蛋白P(phosphoprotein)、基质蛋白M(matrix protein)、糖蛋白G(glycoprotein)、大聚合酶L(large protein)。G蛋白是I型整合膜蛋白,在病毒粒子表面以三聚体形式存在,行使与靶细胞受体结合及膜融合的功能。在感染了VSV的动物体内,所产生的抗体绝大部分针对G蛋白。VSV是弹状病毒科的代表模式毒种,被广泛用作研究囊膜病毒入侵细胞、复制和装配等机制。VSV病毒引起的水疱性口炎是接触性传染的良性疾病,主要感染啮齿类动物牛、猪和马,也能感染人类和其它动物。人只偶然感染,但常不显症状或仅轻微发热。人群中具有VSV抗体的比率极低,只有经常暴露接触VSV的人群血清阳性率较高,比如一些科研人员,接触病畜的兽医的农场工人。VSV的中和抗体靶点是G蛋白,一旦G蛋白被替换成外源病毒的囊膜蛋白,重组病毒将不受人体预存免疫(pre-existingimmunity)的影响。不受预存免疫影响和不具明显致病性是VSV作为疫苗载体的前提条件。

在现有的各种活病毒疫苗载体中,水疱性口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus,VSV)具有人群中血清阳性率低;能诱导粘膜免疫;基因组简单,易于规模化生产等突出的优点,被认为是最具有开发潜力的病毒疫苗载体之一。成功的从DNA恢复出有感染性的VSV病毒,使得对VSV进行遗传操作变为可能。带有合适胞质尾的外源病毒功能囊膜蛋白可以有效包装进病毒的囊膜,形成各种包装异源囊膜蛋白的嵌合重组VSV。重组VSV各转录单元之间的非编码区可耐受长达4.5kb外源基因的插入并获得高效表达。这些特性赋予了VSV作为活病毒疫苗载体的应用潜力。

作为一种新兴的活载体疫苗,VSV具有以下优点:(1)易于培养:VSV在大多数哺乳动物细胞上都可获得很高滴度,容易大量制备。(2)高效性:在VSV-HA感染的小鼠模型中,10个感染性病毒颗粒诱导的免疫应答和10

本发明制备的VSV重组病毒不同于VSV假病毒,其最大区别在于本发明制备的VSV重组病毒感染细胞后可以复制,而VSV假病毒只能感染细胞却不能复制。另外,两者制备方法及应用范围也不同。虽然二者都可以用于病毒抑制剂的筛选和病毒感染机制的基础研究,但本发明制备的VSV重组病毒还可以用于制备疫苗,而VSV假病毒不能用于制备疫苗。

SARS冠状病毒(SARS-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)相似性很高,都属于β属冠状病毒,使用相同的细胞受体ACE2,S蛋白的受体结合结构域(RBD)是主要的抗原表位。但是,研究发现VSV重组SARS冠状病毒rVSV-SARS-CoV诱导的中和抗体水平远高于VSV重组新型冠状病毒rVSV-SARS-CoV-2。为了进一步提高VSV重组新型冠状病毒载体疫苗的免疫保护效果,本发明将SARS冠状病毒囊膜蛋白S的RBD替换为新型冠状病毒的RBD,构建出复制型的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD。该重组病毒表面表达新型冠状病毒和SARS冠状病毒囊膜蛋白S的嵌合蛋白,其中主要抗原表位为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RBD,因此嵌合S蛋白激发免疫反应主要针对新型冠状病毒。而且把新型冠状病毒的主要抗原表位RBD嵌合到免疫原性更强的SARS冠状病毒的S蛋白上后,可以在小鼠和猕猴动物模型内诱导比野生型新型冠状病毒S蛋白更高滴度的中和抗体,从而有更好的保护效果。该重组病毒对新型冠状病毒的疫苗研制具有重要意义。

附图说明

图1为嵌合囊膜蛋白S的嵌合示意图。

图2为VSV-SARS-CoV/2-RBD构建示意图。

图3为S蛋白在重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD上的表达水平检测。

图4为rVSV-SARS-CoV/2-RBD的生长曲线。

图5为重组病毒rVSV-SARS-CoV-2和rVSV-SARS-CoV接种人ACE2转基因小鼠hACE2-KI/NIFDC产生的中和抗体。

图6为重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2接种Balb/c小鼠产生的中和抗体。

图7为重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2接种人ACE2转基因小鼠hACE2-KI/NIFDC产生的中和抗体。

图8为重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2接种猕猴产生的中和抗体。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。

下述实施例中的rVSVΔG载体记载于文献“Single dose of a rVSV-basedvaccine elicits complete protection against severe fever withthrombocytopenia syndrome virus. NPJ Vaccines. 2019 Jan 25;4:5.”中,公众可从中国科学院动物研究所获得,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。rVSVΔG载体的核苷酸序列为序列表中的序列7,其包括T7启动子序列、缺失糖蛋白G编码基因序列的水疱性口炎病毒Indiana毒株全基因组序列和HDV终止子序列。

下述实施例中的表达VSV的N蛋白的质粒为将VSV基因组中的N蛋白编码基因序列(序列表中的序列8),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。

下述实施例中的表达VSV的P蛋白的质粒为将VSV基因组中的P蛋白编码基因序列(序列表中的序列9),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。

下述实施例中的表达VSV的L蛋白的质粒为将VSV基因组中的L蛋白编码基因序列(序列表中的序列10),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。

下述实施例中的表达VSV的M蛋白的质粒为将VSV基因组中的M蛋白编码基因序列(序列表中的序列11),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。

下述实施例中的表达VSV的G蛋白的质粒为将VSV基因组中的G蛋白编码基因序列(序列表中的序列12),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。

下述实施例中的表达T7 RNA聚合酶的质粒为将T7RNA聚合酶编码基因序列(序列表中的序列13),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。

下述实施例中的Vero细胞是ATCC(American type culture collection)的产品,货号为CCL-81。

实施例1、重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的制备

一、重组载体VSV-SARS-CoV/2-RBD的制备

1、嵌合囊膜蛋白S序列的优化

为了研制新型冠状病毒疫苗,将SARS-CoV BJ01毒株(基因库登录号AY278488.2)的囊膜蛋白S氨基酸序列(基因库登录号AAP30030.1)的第1-314位和第537-1259位的编码基因序列,与SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1毒株(基因库登录号 NC_045512.2)的囊膜蛋白S氨基酸序列(基因库登录号YP_009724390.1)的第319-541位的编码基因序列进行人源化优化并嵌合后,得到嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列,其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

嵌合囊膜蛋白S为将SARS冠状病毒(SARS-CoV)囊膜蛋白S的RBD(SARS-CoV囊膜蛋白S氨基酸序列的第315-536位)替换为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)囊膜蛋白S的RBD(SARS-CoV-2囊膜蛋白S氨基酸序列的第319-541位),且将SARS冠状病毒(SARS-CoV)囊膜蛋白S氨基酸序列的第1261-1279位(SARS-CoV囊膜蛋白S胞内区的C端的19个氨基酸)删除,且保持SARS冠状病毒(SARS-CoV)囊膜蛋白S的其他氨基酸序列不变后得到的蛋白(图1),其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

2、重组载体VSV-SARS-CoV/2-RBD的构建

将步骤1中嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列(序列1)插入rVSVΔG载体的酶切位点MluI和NotI之间,得到重组载体,将其命名为重组载体VSV-SARS-CoV/2-RBD。

二、重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的制备

将步骤一中的重组载体VSV-SARS-CoV/2-RBD以及辅助质粒(表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒、表达T7 RNA聚合酶的质粒)共同转染Vero细胞,制备得到重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD。重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的结构示意图如图2所示。具体步骤如下:

1、将Vero细胞传代至培养皿中,第二天细胞密度达到70%-80%时,把完全培养基换成含有2%(体积分数)胎牛血清(FBS,Thermo Fisher,货号为10091)的DMEM培养基(ThermoFisher,货号为SH30243.01B),得到Vero细胞培养体系。

2、完成步骤1后,将36μL FuGENE 6(Promaga公司,货号为E2692)与Opti-MEM培养基(Thermo Fisher,货号为51985091)室温孵育5分钟,与步骤一中的重组载体质粒VSV-SARS-CoV/2-RBD(1.59μg)、表达VSV的N蛋白的质粒(1.286μg)、表达VSV的P蛋白的质粒(639ng)、表达VSV的L蛋白的质粒(159.9ng)、表达VSV的M蛋白的质粒(159.9ng)、表达VSV的G蛋白的质粒(159.9ng)、表达T7 RNA聚合酶的质粒(8.1μg)混匀,室温孵育15分钟,得到孵育后溶液(总体积为600μL)。

3、完成步骤2后,将步骤2中孵育后的溶液加入步骤1中的Vero细胞培养体系中,6小时后换新鲜培养基。转染3天之后收取细胞上清,该上清中含有重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD。用所获得的上清感染新的Vero细胞,实现重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的扩增。重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD为将水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的病毒。

三、对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2的制备

1、重组载体VSV-SARS-CoV-2的制备

将序列3所示的SARS-CoV-2的囊膜蛋白S的编码基因序列插入rVSVΔG载体的酶切位点MluI和NotI之间,得到重组载体,将其命名为重组载体VSV-SARS-CoV-2。SARS-CoV-2的囊膜蛋白S的氨基酸序列如序列表中的序列4所示。

2、重组病毒rVSV-SARS-CoV-2的制备

按照步骤二中的方法,将步骤1中的重组载体VSV-SARS-CoV-2以及辅助质粒(表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒、表达T7 RNA聚合酶的质粒)共同转染Vero细胞,制备得到重组病毒rVSV-SARS-CoV-2。重组病毒rVSV-SARS-CoV-2为将水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为SARS-CoV-2的囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的病毒。

四、对照重组病毒rVSV-SARS-CoV的制备

1、重组载体VSV-SARS-CoV的制备

将序列5所示的SARS-CoV的囊膜蛋白S的编码基因序列插入rVSVΔG载体的酶切位点MluI和NotI之间,得到重组载体,将其命名为重组载体VSV-SARS-CoV。SARS-CoV的囊膜蛋白S的氨基酸序列如序列表中的序列6所示。

2、重组病毒rVSV-SARS-CoV的制备

按照步骤二中的方法,将步骤1中的重组载体VSV-SARS-CoV以及辅助质粒(表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒、表达T7 RNA聚合酶的质粒)共同转染Vero细胞,制备得到重组病毒rVSV-SARS-CoV。重组病毒rVSV-SARS-CoV为将水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为SARS-CoV的囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的病毒。

实施例2、重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的抗原表达鉴定

为了鉴定rVSV-SARS-CoV/2-RBD表达嵌合S蛋白的情况,收集实施例1制备的rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2感染的Vero细胞上清,采用超速离心方法,39,000转4℃离心3小时(Beckman SW41转头),获得病毒沉淀,重悬病毒沉淀后得到浓缩的病毒。然后采用Western Blot方法(抗RBD蛋白的抗体,北京义翘神州科技有限公司,兔抗SARS-CoV-2 RBD多抗,货号40592-T62)检测S蛋白在纯化的病毒颗粒和感染的Vero细胞上清中的表达情况。以未感染的Vero细胞作为对照。

结果如图3所示。结果显示:在rVSV-SARS-CoV/2-RBD感染的Vero细胞上清和纯化的病毒颗粒上都能检测到S蛋白的表达,条带大小约为180KD,说明嵌合S蛋白成功的包装进了重组病毒中。对照病毒rVSV-SARS-CoV-2除了检测到180KD条带外,还有一条110KD条带,分别对应S和S1蛋白。

实施例3、重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的生长曲线

将Vero细胞按照1:3的比例传代于10cm细胞培养皿中。第二天细胞长到80%左右密度时加入实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2,M.O.I.=0.01,感染2个小时后换液成含有2%(体积分数)FBS的DMEM培养基。感染后每隔12小时取样,一直取到感染后108个小时。通过免疫荧光法测定不同感染时间上清液中的病毒滴度。

免疫荧光法测病毒滴度的操作方法具体如下:将Vero细胞按照每孔1.0万个细胞传代于96孔板中。第二天细胞长到80%-90%左右密度时加入待测病毒上清。对病毒上清进行10倍梯度稀释,即30 µl病毒原液与270 µl病毒稀释液混匀,以此类推,共稀释6-7个梯度。病毒稀释液为含有2%(体积分数)FBS的DMEM培养基。每个孔中加入100 µl病毒液,每个稀释度设3孔重复。将细胞放置于37℃细胞培养箱中,感染2小时后换液为含有20 mM NH

结果如图4所示。结果显示:对比两种重组病毒的生长曲线,rVSV-SARS-CoV/2-RBD扩增更快,在感染后36小时即达到10

实施例4、免疫实验

一、人ACE2转基因小鼠免疫实验

试验动物:人ACE2转基因小鼠hACE2-KI/NIFDC模型(在C57BL/6小鼠背景上基于CRISPR/Cas9技术将人hACE2基因cDNAs插入到小鼠mACE2启动子之下获得的人源化动物模型)。该模型记载于文献“A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis.Cell Host Microbe. 2020;28(1):124-133.e4.”中。

试验方法:将实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV-2和rVSV-SARS-CoV通过肌肉注射途径接种hACE2-KI/NIFDC小鼠(剂量为8×10

中和抗体滴度检测方法的具体步骤如下:将Vero细胞按照每孔1.0万个细胞传代于96孔板中。第二天细胞长到80%-90%左右时准备试验。首先将血清按照5倍稀释法进行稀释,例如1:10、1:50、1:250、1:1250。同时把rVSV-eGFP-SARS-CoV-2病毒稀释至2×10

结果如图5所示。结果显示:rVSV-SARS-CoV免疫的小鼠,所诱导的中和抗体水平远高于rVSV-SARS-CoV-2所诱导的中和抗体,为其的5倍左右。

二、小鼠免疫实验

试验动物:BALB/c小鼠(斯贝福(北京)生物技术有限公司,雌性,6-8周龄)。

试验方法:将实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2通过肌肉注射和滴鼻途径接种BALB/c小鼠(肌肉注射3×10

结果如图6所示。结果显示:rVSV-SARS-CoV-2免疫的小鼠,在14天,28天均未检测到中和抗体。而用rVSV-SARS-CoV/2-RBD免疫后,无论是肌肉注射还是滴鼻途径免疫都能产生针对SARS-CoV-2的中和抗体。其中肌肉注射组在免疫后28天中和抗体平均滴度为121.7,滴鼻组中和抗体平均滴度为112。

三、人ACE2转基因小鼠免疫实验

试验动物:人ACE2转基因小鼠hACE2-KI/NIFDC模型。

试验方法:将实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2通过肌肉注射和滴鼻途径接种hACE2-KI/NIFDC小鼠(肌肉注射8×10

结果如图7所示。结果显示:rVSV-SARS-CoV-2免疫的小鼠,仅有肌肉注射组可检测到中和抗体,其中28天的中和抗体平均滴度为301.2。而用rVSV-SARS-CoV/2-RBD免疫后,无论是肌肉注射还是滴鼻都能产生针对SARS-CoV-2的中和抗体,其中肌肉注射组在免疫后28天的中和抗体平均滴度为717.1,滴鼻组中和抗体平均滴度为339.9。由此可见rVSV-SARS-CoV/2-RBD所诱导的中和抗体水平明显优于rVSV-SARS-CoV-2。

四、猕猴免疫实验

试验动物:3只20岁的老年猕猴(相当于80岁老人)(雌性,北京中科灵瑞生物技术股份有限公司)。

试验方法:将实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2通过滴鼻途径接种3只20岁的老年猕猴,接种剂量为1×10

结果如图8所示。结果显示:rVSV-SARS-CoV/2-RBD免疫组中有一只产生很高滴度的中和抗体,滴度为2174.6。而rVSV-SARS-CoV-2免疫组中产生的最高中和抗体滴度为1075.7。总体而言rVSV-SARS-CoV/2-RBD免疫组的免疫效果好于rVSV-SARS-CoV-2免疫组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3783

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60

tcggctagcg acctggacag gtgcaccacc ttcgacgacg tgcaggcccc caactacacc 120

cagcacacca gcagcatgag gggcgtgtac taccccgacg agatcttcag gagcgacacc 180

ctgtacctga cccaggacct gttcctgccc ttctacagca acgtgaccgg cttccacacc 240

atcaaccaca ccttcgacaa ccccgtgatc cccttcaagg acggcatcta cttcgccgcc 300

accgagaaga gcaacgtggt gaggggctgg gtgttcggca gcaccatgaa caacaagagc 360

cagagcgtga tcatcatcaa caacagcacc aacgtggtga tcagggcctg caacttcgag 420

ctgtgcgaca accccttctt cgccgtgagc aagcccatgg gcacccagac ccacaccatg 480

atcttcgaca acgccttcaa ctgcaccttc gagtacatca gcgacgcctt cagcctggac 540

gtgagcgaga agagcggcaa cttcaagcac ctgagggagt tcgtgttcaa gaacaaggac 600

ggcttcctgt acgtgtacaa gggctaccag cccatcgacg tggtgaggga cctgcccagc 660

ggcttcaaca ccctgaagcc catcttcaag ctgcccctgg gcatcaacat caccaacttc 720

agggccatcc tgaccgcctt cagccccgcc caggacacct ggggcaccag cgctgcagcc 780

tacttcgtgg gctacctgaa gcccaccacc ttcatgctga agtacgacga gaacggcacc 840

atcaccgacg ccgtggactg cagccagaac cccctggccg agctgaagtg cagcgtgaag 900

agcttcgaga tcgacaaggg catctaccag accagcaact tccgggtgca gcctacagag 960

tctattgtgc ggttcccaaa catcacaaac ctgtgccctt tcggcgaggt gttcaacgcc 1020

acccggttcg cctctgtgta cgcctggaac cggaagcgga tctctaactg cgtggccgac 1080

tactccgtgc tgtacaactc cgcctctttc tctacattca agtgctacgg cgtgtcccct 1140

acaaagctga acgacctgtg cttcaccaac gtgtacgccg actctttcgt gattagaggc 1200

gacgaggtga ggcagattgc ccccggccag acaggcaaga tcgccgacta caactacaag 1260

ctgcccgacg acttcacagg ctgcgtgatc gcctggaact ctaacaacct ggactctaag 1320

gtgggcggca actacaacta cctgtacaga ctgttccgga agtctaacct gaagccattc 1380

gagagggaca ttagcaccga gatttaccag gccggctcta ccccatgcaa cggcgtggag 1440

ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggcttcc agcctacaaa cggcgtgggc 1500

taccagcctt accgggtggt ggtgctgtct ttcgagctgc tccacgcccc cgccacagtg 1560

tgcggcccaa agaagagcac aaacctcgtg aagaacaagt gcgtgaactt caacttcaac 1620

ggcctgaccg gcaccggcgt gctgacacct agcagcaaga ggttccagcc cttccagcag 1680

ttcggcaggg acgtgagcga cttcaccgac agcgtgaggg accccaagac cagcgagatc 1740

ctggacatca gcccttgcag cttcggcggc gtgagcgtga tcacacctgg caccaacgcc 1800

agcagcgagg tggccgtgct gtaccaggac gtgaactgca ccgacgtgag caccgccatc 1860

cacgccgacc agctgacacc tgcctggagg atctacagca ccggcaacaa cgtgttccag 1920

acccaggccg gctgcctgat cggcgccgag cacgtggaca ccagctacga gtgcgacatc 1980

cctatcggcg ccggcatctg cgccagctac cacaccgtga gcctgctgag gagcaccagc 2040

cagaagagca tcgtggccta caccatgagc ctgggcgccg acagcagcat cgcctacagc 2100

aacaacacca tcgccattcc taccaacttc agcatcagca tcaccaccga ggtgatgccc 2160

gtgagcatgg ccaagaccag cgtggactgc aacatgtaca tctgcggcga cagcaccgag 2220

tgcgccaacc tgctgctcca gtacggcagc ttctgcaccc agctgaacag ggccctgagc 2280

ggcatcgccg ccgagcagga caggaacacc agggaggtgt tcgcccaggt gaagcagatg 2340

tacaagaccc caaccctgaa gtacttcggc ggcttcaact tcagccagat cctgcccgac 2400

cccctgaagc ccaccaagag gagcttcatc gaggacctgc tgttcaacaa ggtgaccctg 2460

gccgacgccg gcttcatgaa gcagtacggc gagtgcctgg gcgacatcaa cgccagggac 2520

ctgatctgcg cccagaagtt caacggcctg accgtgctgc cacctctgct gaccgacgac 2580

atgatcgccg cctacaccgc cgccctggtg agcggcaccg ccaccgccgg ctggaccttc 2640

ggcgccggcg ccgccctcca gatccccttc gccatgcaga tggcctacag gttcaacggc 2700

atcggcgtga cccagaacgt gctgtacgag aaccagaagc agatcgccaa ccagttcaac 2760

aaggccatca gccagatcca ggagagcctg accaccacca gcaccgccct gggcaagctc 2820

caggacgtgg tgaaccagaa cgcccaggcc ctgaacaccc tggtgaagca gctgagcagc 2880

aacttcggcg ccatcagcag cgtgctgaac gacatcctgt ctagactgga caaggtggag 2940

gccgaggtgc agatcgacag gctgatcacc ggcaggctgc agagcctgca gacctacgtg 3000

acccagcagc tgatcagggc cgccgagatc agggccagcg ccaacctggc cgccaccaag 3060

atgagcgagt gcgtgctggg ccagagcaag agggtggact tctgcggcaa gggctaccac 3120

ctgatgagct tcccccaggc cgccccccac ggcgtggtgt tcctgcacgt gacctacgtg 3180

cccagccagg agaggaactt caccaccgcc cccgccatct gccacgaggg caaggcctac 3240

ttccccaggg agggcgtgtt cgtgttcaac ggcaccagct ggttcatcac ccagaggaac 3300

ttcttcagcc cccagatcat caccaccgac aacaccttcg tgagcggcaa ctgcgacgtg 3360

gtgatcggca tcatcaacaa caccgtgtac gaccccctgc agcccgagct ggacagcttc 3420

aaggaggagc tggacaagta cttcaagaac cacaccagcc ccgacgtgga cctgggcgac 3480

atcagcggca tcaacgccag cgtggtgaac atccagaagg agatcgacag gctgaacgag 3540

gtggccaaga acctgaacga gagcctgatc gacctgcagg agctgggcaa gtacgagcag 3600

tacatcaagt ggccctggta cgtgtggctg ggcttcatcg ccggcctgat cgccatcgtg 3660

atggtgacca tcctgctgtg ctgcatgacc agctgctgca gctgcctgaa gagactcaaa 3720

aggtcaatgc taatgggtaa tccagatgac cgtataccga gggacacata tacattagag 3780

tga 3783

<210> 2

<211> 1260

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Ala Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp

20 25 30

Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly

35 40 45

Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr

50 55 60

Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr

65 70 75 80

Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile

85 90 95

Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe

100 105 110

Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn

115 120 125

Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn

130 135 140

Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met

145 150 155 160

Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala

165 170 175

Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg

180 185 190

Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly

195 200 205

Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr

210 215 220

Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe

225 230 235 240

Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr

245 250 255

Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met

260 265 270

Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser

275 280 285

Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile

290 295 300

Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu

305 310 315 320

Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu

325 330 335

Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys

340 345 350

Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala

355 360 365

Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn

370 375 380

Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly

385 390 395 400

Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp

405 410 415

Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp

420 425 430

Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu

435 440 445

Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile

450 455 460

Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu

465 470 475 480

Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr

485 490 495

Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu

500 505 510

Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn

515 520 525

Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly

530 535 540

Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln

545 550 555 560

Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys

565 570 575

Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser

580 585 590

Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr

595 600 605

Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln

610 615 620

Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln

625 630 635 640

Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr

645 650 655

Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr

660 665 670

Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr

675 680 685

Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile

690 695 700

Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro

705 710 715 720

Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly

725 730 735

Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys

740 745 750

Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg

755 760 765

Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro

770 775 780

Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp

785 790 795 800

Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn

805 810 815

Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met Lys Gln Tyr Gly Glu Cys

820 825 830

Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn

835 840 845

Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Asp Met Ile Ala Ala

850 855 860

Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala Thr Ala Gly Trp Thr Phe

865 870 875 880

Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr

885 890 895

Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln

900 905 910

Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu

915 920 925

Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val

930 935 940

Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser

945 950 955 960

Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu

965 970 975

Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg

980 985 990

Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala

995 1000 1005

Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys

1010 1015 1020

Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His

1025 1030 1035 1040

Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His

1045 1050 1055

Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala

1060 1065 1070

Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val

1075 1080 1085

Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro

1090 1095 1100

Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1105 1110 1115 1120

Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu

1125 1130 1135

Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr

1140 1145 1150

Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val

1155 1160 1165

Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn

1170 1175 1180

Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln

1185 1190 1195 1200

Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu

1205 1210 1215

Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys

1220 1225 1230

Cys Ser Cys Leu Lys Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly Asn Pro

1235 1240 1245

Asp Asp Arg Ile Pro Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu

1250 1255 1260

<210> 3

<211> 3822

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgttcgtgt tcctcgtgct cctgcctctg gtgtctagcc agtgcgtgaa cctgaccaca 60

cggacccagc tccctcccgc ctacacaaac tctttcaccc ggggcgtgta ctaccccgac 120

aaggtgttcc ggtctagcgt gctccactct acacaggacc tgttcctccc tttcttcagc 180

aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg tctggcacaa acggcacaaa gcggttcgac 240

aaccccgtgc tccctttcaa cgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gtctaacatt 300

atccggggct ggattttcgg caccacactc gactctaaga cacagtccct cctgattgtg 360

aacaacgcca caaacgtggt gattaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccctttc 420

ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag tcttggatgg agtctgagtt cagagtgtac 480

tctagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc ctttcctcat ggacctggag 540

ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgaga gagttcgtgt tcaagaacat tgacggctac 600

ttcaagattt actctaagca caccccaatt aacctcgtga gggacctccc tcagggcttc 660

tccgccttag aaccactggt ggacctccct attggcatta acatcacacg cttccagaca 720

ctgctcgccc tccaccggtc ttacctgacc ccaggcgact ctagctctgg ctggacagcc 780

ggcgccgccg cctactacgt gggctacctg cagcctagga ccttcctcct gaagtacaac 840

gagaacggca caattaccga cgccgtggac tgcgccctgg acccactgtc cgagacaaag 900

tgcacactga agtccttcac agtggagaag ggcatttacc agacatctaa cttccgggtg 960

cagcctacag agtctattgt gcggttccca aacatcacaa acctgtgccc tttcggcgag 1020

gtgttcaacg ccacccggtt cgcctctgtg tacgcctgga accggaagcg gatctctaac 1080

tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac tccgcctctt tctctacatt caagtgctac 1140

ggcgtgtccc ctacaaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgactctttc 1200

gtgattagag gcgacgaggt gaggcagatt gcccccggcc agacaggcaa gatcgccgac 1260

tacaactaca agctgcccga cgacttcaca ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac 1320

ctggactcta aggtgggcgg caactacaac tacctgtaca gactgttccg gaagtctaac 1380

ctgaagccat tcgagaggga cattagcacc gagatttacc aggccggctc taccccatgc 1440

aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggctt ccagcctaca 1500

aacggcgtgg gctaccagcc ttaccgggtg gtggtgctgt ctttcgagct gctccacgcc 1560

cccgccacag tgtgcggccc aaagaagagc acaaacctcg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggcctcac aggcacaggc gtgctcaccg agtctaacaa gaagttcctc 1680

cctttccagc agttcggccg cgacattgcc gacaccaccg acgccgtgcg ggaccctcag 1740

acactggaaa ttctcgacat caccccttgc agcttcggcg gcgtgtccgt gatcacccca 1800

ggcacaaaca catctaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg caccgaggtg 1860

ccagtggcca tccacgccga ccagctcacc ccaacatgga gggtgtacag cacaggctct 1920

aacgtgttcc agacccgggc cggctgcctc attggcgccg agcacgtgaa caactcttac 1980

gagtgcgaca tccctattgg cgccggcatt tgcgcctctt accagaccca gacaaactct 2040

ccacggagag cccggtctgt ggcctctcag agcattattg cctacaccat gtctctgggc 2100

gccgagaact ctgtggccta ctctaacaac tctattgcca tccctacaaa cttcacaatt 2160

tctgtgacca ccgagattct cccagtgtct atgaccaaga catctgtgga ctgcaccatg 2220

tacatttgcg gcgactccac cgagtgctct aacctcctgc tccagtacgg ctctttctgc 2280

acccagctca accgcgccct gacaggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag 2340

gtgttcgccc aggtgaagca gatttacaag acccccccaa ttaaggactt cggcggcttc 2400

aacttctctc agattctccc cgacccatcc aagcctagca agcggtcctt cattgaggac 2460

ctcctgttca acaaggtgac actggccgac gccggcttca ttaagcagta cggcgactgc 2520

ctgggcgaca ttgccgcccg ggacctgatt tgcgcccaga agttcaacgg cctcacagtg 2580

ctccccccac tgctcaccga cgagatgatt gcccagtaca catctgccct cctggccggc 2640

acaattacat ctggctggac cttcggcgcc ggcgccgccc tgcagatccc tttcgccatg 2700

cagatggcct accgcttcaa cggcatcggc gtgacacaga acgtgctgta cgagaaccag 2760

aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc attggcaaga ttcaggactc tctgagcagc 2820

acagccagcg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaacc agaacgccca ggccctgaac 2880

acactggtga agcagctgtc ttctaacttc ggcgccattt ctagcgtgct gaacgacatt 2940

ctgtcgcggc tggacaaggt ggaggccgag gtgcagattg acaggctcat cacaggcaga 3000

ctgcagtctc tgcagacata cgtgacccag cagctgatta gagccgccga gattagagcc 3060

tccgccaacc tggccgccac caagatgagc gagtgcgtgc tcggccagtc taagcgggtg 3120

gacttctgcg gcaagggcta ccacctcatg tctttccctc agtccgcccc tcacggcgtg 3180

gtgttcctcc acgtgacata cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac agcccccgcc 3240

atttgccacg acggcaaggc ccacttccct agggagggcg tgttcgtgtc taacggcacc 3300

cactggttcg tgacccagcg gaacttctac gagcctcaga ttattaccac agacaacaca 3360

ttcgtgagcg gcaactgcga cgtggtgatt ggcattgtga acaacacagt gtacgaccca 3420

ctgcagcctg agttggactc tttcaaggag gaactcgaca agtacttcaa gaaccacaca 3480

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ctgacaaatc aatgcaaaat gatcaatgaa cagtttgaac ctcttgtgcc agaaggtcgt 600

gacatttttg atgtgtgggg aaatgacagt aattacacaa aaattgtcgc tgcagtggac 660

atgttcttcc acatgttcaa aaaacatgaa tgtgcctcgt tcagatacgg aactattgtt 720

tccagattca aagattgtgc tgcattggca acatttggac acctctgcaa aataaccgga 780

atgtctacag aagatgtaac gacctggatc ttgaaccgag aagttgcaga tgaaatggtc 840

caaatgatgc ttccaggcca agaaattgac aaggccgatt catacatgcc ttatttgatc 900

gactttggat tgtcttctaa gtctccatat tcttccgtca aaaaccctgc cttccacttc 960

tgggggcaat tgacagctct tctgctcaga tccaccagag caaggaatgc ccgacagcct 1020

gatgacattg agtatacatc tcttactaca gcaggtttgt tgtacgctta tgcagtagga 1080

tcctctgccg acttggcaca acagttttgt gttggagata acaaatacac tccagatgat 1140

agtaccggag gattgacgac taatgcaccg ccacaaggca gagatgtggt cgaatggctc 1200

ggatggtttg aagatcaaaa cagaaaaccg actcctgata tgatgcagta tgcgaaaaga 1260

gcagtcatgt cactgcaagg cctaagagag aagacaattg gcaagtatgc taagtcagaa 1320

tttgacaaat gaccctataa ttctcagatc acctattata tattatgcta catatgaaaa 1380

aaactaacag atatcatgga taatctcaca aaagttcgtg agtatctcaa gtcctactct 1440

cgtctagatc aggcggtagg agagatagat gagatcgaag cacaacgagc tgaaaagtcc 1500

aattatgagt tgttccaaga ggacggagtg gaagagcata ctaggccctc ttattttcag 1560

gcagcagatg attctgacac agaatctgaa ccagaaattg aagacaatca aggcttgtat 1620

gtaccagatc cggaagctga gcaagttgaa ggctttatac aggggccttt agatgactat 1680

gcagatgagg acgtggatgt tgtattcact tcggactgga aacagcctga gcttgaatcc 1740

gacgagcatg gaaagacctt acggttgaca ttgccagagg gtttaagtgg agagcagaaa 1800

tcccagtggc ttttgacgat taaagcagtc gttcaaagtg ccaaacactg gaatctggca 1860

gagtgcacat ttgaagcatc gggagaaggg gtcatcataa aaaagcgcca gataactccg 1920

gatgtatata aggtcactcc agtgatgaac acacatccgt accaatcaga agccgtatca 1980

gatgtttggt ctctctcaaa gacatccatg actttccaac ccaagaaagc aagtcttcag 2040

cctctcacca tatccttgga tgaattgttc tcatctagag gagaattcat ctctgtcgga 2100

ggtaacggac gaatgtctca taaagaggcc atcctgctcg gtctgaggta caaaaagttg 2160

tacaatcagg cgagagtcaa atattctctg tagactatga aaaaaagtaa cagatatcac 2220

aatctaagtg ttatcccaat ccattcatca tgagttcctt aaagaagatt ctcggtctga 2280

aggggaaagg taagaaatct aagaaattag ggatcgcacc acccccttat gaagaggaca 2340

ctagcatgga gtatgctccg agcgctccaa ttgacaaatc ctattttgga gttgacgaga 2400

tggacaccta tgatccgaat caattaagat atgagaaatt cttctttaca gtgaaaatga 2460

cggttagatc taatcgtccg ttcagaacat actcagatgt ggcagccgct gtatcccatt 2520

gggatcacat gtacatcgga atggcaggga aacgtccctt ctacaaaatc ttggcttttt 2580

tgggttcttc taatctaaag gccactccag cggtattggc agatcaaggt caaccagagt 2640

atcacgctca ctgcgaaggc agggcttatt tgccacatag gatggggaag acccctccca 2700

tgctcaatgt accagagcac ttcagaagac cattcaatat aggtctttac aagggaacga 2760

ttgagctcac aatgaccatc tacgatgatg agtcactgga agcagctcct atgatctggg 2820

atcatttcaa ttcttccaaa ttttctgatt tcagagagaa ggccttaatg tttggcctga 2880

ttgtcgagaa aaaggcatct ggagcgtggg tcctggattc tatcagccac ttcaaatgag 2940

ctagtctagc ttccagcttc tgaacaatcc ccggtttact cagtctctcc taattccagc 3000

ctttcgaaca actaatatcc tgtcttttct atccctatga aaaaaactaa cagagatcga 3060

tctgtttcct tgaccctgca caacagattc ttcatgtttg aaccaaatca acttgtgata 3120

tcatgctcaa agaggcctta attatatttt aatttttaat ttttatgaaa aaaactaaca 3180

gcaatcatgg aagtccacga ttttgagacc gacgagttca atgatttcaa tgaagatgac 3240

tatgccacaa gagaattcct gaatcccgat gagcgcatga cgtacttgaa tcatgctgat 3300

tacaatttga attctcctct aattagtgat gatattgaca atttgatcag gaaattcaat 3360

tctcttccga ttccctcgat gtgggatagt aagaactggg atggagttct tgagatgtta 3420

acatcatgtc aagccaatcc catctcaaca tctcagatgc ataaatggat gggaagttgg 3480

ttaatgtctg ataatcatga tgccagtcaa gggtatagtt ttttacatga agtggacaaa 3540

gaggcagaaa taacatttga cgtggtggag accttcatcc gcggctgggg caacaaacca 3600

attgaataca tcaaaaagga aagatggact gactcattca aaattctcgc ttatttgtgt 3660

caaaagtttt tggacttaca caagttgaca ttaatcttaa atgctgtctc tgaggtggaa 3720

ttgctcaact tggcgaggac tttcaaaggc aaagtcagaa gaagttctca tggaacgaac 3780

atatgcagga ttagggttcc cagcttgggt cctactttta tttcagaagg atgggcttac 3840

ttcaagaaac ttgatattct aatggaccga aactttctgt taatggtcaa agatgtgatt 3900

atagggagga tgcaaacggt gctatccatg gtatgtagaa tagacaacct gttctcagag 3960

caagacatct tctcccttct aaatatctac agaattggag ataaaattgt ggagaggcag 4020

ggaaattttt cttatgactt gattaaaatg gtggaaccga tatgcaactt gaagctgatg 4080

aaattagcaa gagaatcaag gcctttagtc ccacaattcc ctcattttga aaatcatatc 4140

aagacttctg ttgatgaagg ggcaaaaatt gaccgaggta taagattcct ccatgatcag 4200

ataatgagtg tgaaaacagt ggatctcaca ctggtgattt atggatcgtt cagacattgg 4260

ggtcatcctt ttatagatta ttacactgga ctagaaaaat tacattccca agtaaccatg 4320

aagaaagata ttgatgtgtc atatgcaaaa gcacttgcaa gtgatttagc tcggattgtt 4380

ctatttcaac agttcaatga tcataaaaag tggttcgtga atggagactt gctccctcat 4440

gatcatccct ttaaaagtca tgttaaagaa aatacatggc ccacagctgc tcaagttcaa 4500

gattttggag ataaatggca tgaacttccg ctgattaaat gttttgaaat acccgactta 4560

ctagacccat cgataatata ctctgacaaa agtcattcaa tgaataggtc agaggtgttg 4620

aaacatgtcc gaatgaatcc gaacactcct atccctagta aaaaggtgtt gcagactatg 4680

ttggacacaa aggctaccaa ttggaaagaa tttcttaaag agattgatga gaagggctta 4740

gatgatgatg atctaattat tggtcttaaa ggaaaggaga gggaactgaa gttggcaggt 4800

agatttttct ccctaatgtc ttggaaattg cgagaatact ttgtaattac cgaatatttg 4860

ataaagactc atttcgtccc tatgtttaaa ggcctgacaa tggcggacga tctaactgca 4920

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tgcatagcca atcacattga ttacgaaaaa tggaataacc accaaaggaa gttatcaaac 5040

ggcccagtgt tccgagttat gggccagttc ttaggttatc catccttaat cgagagaact 5100

catgaatttt ttgagaaaag tcttatatac tacaatggaa gaccagactt gatgcgtgtt 5160

cacaacaaca cactgatcaa ttcaacctcc caacgagttt gttggcaagg acaagagggt 5220

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gaggctaaaa tcagaaacac tgctgtcaaa gtcttggcac aaggtgataa tcaagttatt 5340

tgcacacagt ataaaacgaa gaaatcgaga aacgttgtag aattacaggg tgctctcaat 5400

caaatggttt ctaataatga gaaaattatg actgcaatca aaatagggac agggaagtta 5460

ggacttttga taaatgacga tgagactatg caatctgcag attacttgaa ttatggaaaa 5520

ataccgattt tccgtggagt gattagaggg ttagagacca agagatggtc acgagtgact 5580

tgtgtcacca atgaccaaat acccacttgt gctaatataa tgagctcagt ttccacaaat 5640

gctctcaccg tagctcattt tgctgagaac ccaatcaatg ccatgataca gtacaattat 5700

tttgggacat ttgctagact cttgttgatg atgcatgatc ctgctcttcg tcaatcattg 5760

tatgaagttc aagataagat accgggcttg cacagttcta ctttcaaata cgccatgttg 5820

tatttggacc cttccattgg aggagtgtcg ggcatgtctt tgtccaggtt tttgattaga 5880

gccttcccag atcccgtaac agaaagtctc tcattctgga gattcatcca tgtacatgct 5940

cgaagtgagc atctgaagga gatgagtgca gtatttggaa accccgagat agccaagttt 6000

cgaataactc acatagacaa gctagtagaa gatccaacct ctctgaacat cgctatggga 6060

atgagtccag cgaacttgtt aaagactgag gttaaaaaat gcttaatcga atcaagacaa 6120

accatcagga accaggtgat taaggatgca accatatatt tgtatcatga agaggatcgg 6180

ctcagaagtt tcttatggtc aataaatcct ctgttcccta gatttttaag tgaattcaaa 6240

tcaggcactt ttttgggagt cgcagacggg ctcatcagtc tatttcaaaa ttctcgtact 6300

attcggaact cctttaagaa aaagtatcat agggaattgg atgatttgat tgtgaggagt 6360

gaggtatcct ctttgacaca tttagggaaa cttcatttga gaaggggatc atgtaaaatg 6420

tggacatgtt cagctactca tgctgacaca ttaagataca aatcctgggg ccgtacagtt 6480

attgggacaa ctgtacccca tccattagaa atgttgggtc cacaacatcg aaaagagact 6540

ccttgtgcac catgtaacac atcagggttc aattatgttt ctgtgcattg tccagacggg 6600

atccatgacg tctttagttc acggggacca ttgcctgctt atctagggtc taaaacatct 6660

gaatctacat ctattttgca gccttgggaa agggaaagca aagtcccact gattaaaaga 6720

gctacacgtc ttagagatgc tatctcttgg tttgttgaac ccgactctaa actagcaatg 6780

actatacttt ctaacatcca ctctttaaca ggcgaagaat ggaccaaaag gcagcatggg 6840

ttcaaaagaa cagggtctgc ccttcatagg ttttcgacat ctcggatgag ccatggtggg 6900

ttcgcatctc agagcactgc agcattgacc aggttgatgg caactacaga caccatgagg 6960

gatctgggag atcagaattt cgacttttta ttccaagcaa cgttgctcta tgctcaaatt 7020

accaccactg ttgcaagaga cggatggatc accagttgta cagatcatta tcatattgcc 7080

tgtaagtcct gtttgagacc catagaagag atcaccctgg actcaagtat ggactacacg 7140

cccccagatg tatcccatgt gctgaagaca tggaggaatg gggaaggttc gtggggacaa 7200

gagataaaac agatctatcc tttagaaggg aattggaaga atttagcacc tgctgagcaa 7260

tcctatcaag tcggcagatg tataggtttt ctatatggag acttggcgta tagaaaatct 7320

actcatgccg aggacagttc tctatttcct ctatctatac aaggtcgtat tagaggtcga 7380

ggtttcttaa aagggttgct agacggatta atgagagcaa gttgctgcca agtaatacac 7440

cggagaagtc tggctcattt gaagaggccg gccaacgcag tgtacggagg tttgatttac 7500

ttgattgata aattgagtgt atcacctcca ttcctttctc ttactagatc aggacctatt 7560

agagacgaat tagaaacgat tccccacaag atcccaacct cctatccgac aagcaaccgt 7620

gatatggggg tgattgtcag aaattacttc aaataccaat gccgtctaat tgaaaaggga 7680

aaatacagat cacattattc acaattatgg ttattctcag atgtcttatc catagacttc 7740

attggaccat tctctatttc caccaccctc ttgcaaatcc tatacaagcc atttttatct 7800

gggaaagata agaatgagtt gagagagctg gcaaatcttt cttcattgct aagatcagga 7860

gaggggtggg aagacataca tgtgaaattc ttcaccaagg acatattatt gtgtccagag 7920

gaaatcagac atgcttgcaa gttcgggatt gctaaggata ataataaaga catgagctat 7980

cccccttggg gaagggaatc cagagggaca attacaacaa tccctgttta ttatacgacc 8040

accccttacc caaagatgct agagatgcct ccaagaatcc aaaatcccct gctgtccgga 8100

atcaggttgg gccaattacc aactggcgct cattataaaa ttcggagtat attacatgga 8160

atgggaatcc attacaggga cttcttgagt tgtggagacg gctccggagg gatgactgct 8220

gcattactac gagaaaatgt gcatagcaga ggaatattca atagtctgtt agaattatca 8280

gggtcagtca tgcgaggcgc ctctcctgag ccccccagtg ccctagaaac tttaggagga 8340

gataaatcga gatgtgtaaa tggtgaaaca tgttgggaat atccatctga cttatgtgac 8400

ccaaggactt gggactattt cctccgactc aaagcaggct tggggcttca aattgattta 8460

attgtaatgg atatggaagt tcgggattct tctactagcc tgaaaattga gacgaatgtt 8520

agaaattatg tgcaccggat tttggatgag caaggagttt taatctacaa gacttatgga 8580

acatatattt gtgagagcga aaagaatgca gtaacaatcc ttggtcccat gttcaagacg 8640

gtcgacttag ttcaaacaga atttagtagt tctcaaacgt ctgaagtata tatggtatgt 8700

aaaggtttga agaaattaat cgatgaaccc aatcccgatt ggtcttccat caatgaatcc 8760

tggaaaaacc tgtacgcatt ccagtcatca gaacaggaat ttgccagagc aaagaaggtt 8820

agtacatact ttaccttgac aggtattccc tcccaattca ttcctgatcc ttttgtaaac 8880

attgagacta tgctacaaat attcggagta cccacgggtg tgtctcatgc ggctgcctta 8940

aaatcatctg atagacctgc agatttattg accattagcc ttttttatat ggcgattata 9000

tcgtattata acatcaatca tatcagagta ggaccgatac ctccgaaccc cccatcagat 9060

ggaattgcac aaaatgtggg gatcgctata actggtataa gcttttggct gagtttgatg 9120

gagaaagaca ttccactata tcaacagtgt ttggcagtta tccagcaatc atttccgatt 9180

aggtgggagg ctatttcagt aaaaggagga tacaagcaga agtggagtac tagaggtgat 9240

gggctcccaa aagatacccg aatttcagac tccttggccc caatcgggaa ctggatcaga 9300

tctttggaat tggtccgaaa ccaagttcgt ctaaatccat tcaataagat cttgttcaat 9360

cagctatgtc gtacagtgga taatcatttg aagtggtcaa atttgcgaaa aaacacagga 9420

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agtgacctac atgaggaaaa ctcttggaga gattaaaaaa tcaggaggag actccaaact 9540

ttaagtatga aaaaaacttt gatccttaag accctcttgt ggtttttatt tttttatctg 9600

gttttgtggt cttcgtgggt cggcatggca tctccacctc ctcgcggtcc gacctgggca 9660

tccgaaggag gacgtcgtcc actcggatgg ctaagggaga gctcggatcc ggctgctaac 9720

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cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga 9840

tcgagatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg tattctatag tgtcacctaa 9900

atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt attaattgta gccgcgttct aacgacaata 9960

tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct tactgaagca gaccctatca tctctctcgt 10020

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caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 11160

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 11220

aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 11280

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 11340

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 11400

aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 11460

cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 11520

ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 11580

gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 11640

agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 11700

atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 11760

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 11820

cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 11880

cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 11940

tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 12000

tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 12060

ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 12120

aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 12180

cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 12240

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ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 12420

acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 12480

cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 12540

gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa 12600

tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcaggggg atctcgatcc 12660

cgcgaaatta atacgactca ctatagg 12687

<210> 8

<211> 1269

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atgtctgtta cagtcaagag aatcattgac aacacagtca tagttccaaa acttcctgca 60

aatgaggatc cagtggaata cccggcagat tacttcagaa aatcaaagga gattcctctt 120

tacatcaata ctacaaaaag tttgtcagat ctaagaggat atgtctacca aggcctcaaa 180

tccggaaatg tatcaatcat acatgtcaac agctacttgt atggagcatt aaaggacatc 240

cggggtaagt tggataaaga ttggtcaagt ttcggaataa acatcgggaa agcaggggat 300

acaatcggaa tatttgacct tgtatccttg aaagccctgg acggcgtact tccagatgga 360

gtatcggatg cttccagaac cagcgcagat gacaaatggt tgcctttgta tctacttggc 420

ttatacagag tgggcagaac acaaatgcct gaatacagaa aaaagctcat ggatgggctg 480

acaaatcaat gcaaaatgat caatgaacag tttgaacctc ttgtgccaga aggtcgtgac 540

atttttgatg tgtggggaaa tgacagtaat tacacaaaaa ttgtcgctgc agtggacatg 600

ttcttccaca tgttcaaaaa acatgaatgt gcctcgttca gatacggaac tattgtttcc 660

agattcaaag attgtgctgc attggcaaca tttggacacc tctgcaaaat aaccggaatg 720

tctacagaag atgtaacgac ctggatcttg aaccgagaag ttgcagatga aatggtccaa 780

atgatgcttc caggccaaga aattgacaag gccgattcat acatgcctta tttgatcgac 840

tttggattgt cttctaagtc tccatattct tccgtcaaaa accctgcctt ccacttctgg 900

gggcaattga cagctcttct gctcagatcc accagagcaa ggaatgcccg acagcctgat 960

gacattgagt atacatctct tactacagca ggtttgttgt acgcttatgc agtaggatcc 1020

tctgccgact tggcacaaca gttttgtgtt ggagataaca aatacactcc agatgatagt 1080

accggaggat tgacgactaa tgcaccgcca caaggcagag atgtggtcga atggctcgga 1140

tggtttgaag atcaaaacag aaaaccgact cctgatatga tgcagtatgc gaaaagagca 1200

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gcatcgggag aaggggtcat cataaaaaag cgccagataa ctccggatgt atataaggtc 540

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tcaaagacat ccatgacttt ccaacccaag aaagcaagtc ttcagcctct caccatatcc 660

ttggatgaat tgttctcatc tagaggagaa ttcatctctg tcggaggtaa cggacgaatg 720

tctcataaag aggccatcct gctcggtctg aggtacaaaa agttgtacaa tcaggcgaga 780

gtcaaatatt ctctgtag 798

<210> 10

<211> 6330

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atggaagtcc acgattttga gaccgacgag ttcaatgatt tcaatgaaga tgactatgcc 60

acaagagaat tcctgaatcc cgatgagcgc atgacgtact tgaatcatgc tgattacaat 120

ttgaattctc ctctaattag tgatgatatt gacaatttga tcaggaaatt caattctctt 180

ccgattccct cgatgtggga tagtaagaac tgggatggag ttcttgagat gttaacatca 240

tgtcaagcca atcccatctc aacatctcag atgcataaat ggatgggaag ttggttaatg 300

tctgataatc atgatgccag tcaagggtat agttttttac atgaagtgga caaagaggca 360

gaaataacat ttgacgtggt ggagaccttc atccgcggct ggggcaacaa accaattgaa 420

tacatcaaaa aggaaagatg gactgactca ttcaaaattc tcgcttattt gtgtcaaaag 480

tttttggact tacacaagtt gacattaatc ttaaatgctg tctctgaggt ggaattgctc 540

aacttggcga ggactttcaa aggcaaagtc agaagaagtt ctcatggaac gaacatatgc 600

aggattaggg ttcccagctt gggtcctact tttatttcag aaggatgggc ttacttcaag 660

aaacttgata ttctaatgga ccgaaacttt ctgttaatgg tcaaagatgt gattataggg 720

aggatgcaaa cggtgctatc catggtatgt agaatagaca acctgttctc agagcaagac 780

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tatgtgcacc ggattttgga tgagcaagga gttttaatct acaagactta tggaacatat 5400

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gcacaaaatg tggggatcgc tataactggt ataagctttt ggctgagttt gatggagaaa 5940

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gaggctattt cagtaaaagg aggatacaag cagaagtgga gtactagagg tgatgggctc 6060

ccaaaagata cccgaatttc agactccttg gccccaatcg ggaactggat cagatctttg 6120

gaattggtcc gaaaccaagt tcgtctaaat ccattcaata agatcttgtt caatcagcta 6180

tgtcgtacag tggataatca tttgaagtgg tcaaatttgc gaaaaaacac aggaatgatt 6240

gaatggatca atgggcgaat ttcaaaagaa gaccggtcta tactgatgtt gaagagtgac 6300

ctacatgagg aaaactcttg gagagattaa 6330

<210> 11

<211> 690

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60

gggatcgcac caccccctta tgaagaggac actagcatgg agtatgctcc gagcgctcca 120

attgacaaat cctattttgg agttgacgag atggacacct atgatccgaa tcaattaaga 180

tatgagaaat tcttctttac agtgaaaatg acggttagat ctaatcgtcc gttcagaaca 240

tactcagatg tggcagccgc tgtatcccat tgggatcaca tgtacatcgg aatggcaggg 300

aaacgtccct tctacaaaat cttggctttt ttgggttctt ctaatctaaa ggccactcca 360

gcggtattgg cagatcaagg tcaaccagag tatcacgctc actgcgaagg cagggcttat 420

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gagtcactgg aagcagctcc tatgatctgg gatcatttca attcttccaa attttctgat 600

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<210> 12

<211> 1536

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

atgaagtgcc ttttgtactt agctttttta ttcatcgggg tgaattgcaa gttcaccata 60

gtttttccac acaaccgaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttccaatta ccattattgc 120

ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180

atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240

gtcactactt gtgatttccg ctggtacgga ccggagtata taacacattc catccgatcc 300

ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360

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gcgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg cttgttgatg aatacacagg agaatgggtt 480

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ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggagacaagg cctgcaaaat gcagtactgc 720

aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780

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tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagtttg tagaaggttg gttcagtagt 1380

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<210> 13

<211> 2652

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60

ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120

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ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500

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ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740

attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800

aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860

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tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040

atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100

tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160

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attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340

aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400

aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460

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gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580

atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640

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<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

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ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720

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