公开/公告号CN112375748A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-02-19
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学院动物研究所;
申请/专利号CN202110027659.6
申请日2021-01-11
分类号C12N7/01(20060101);C12N15/86(20060101);G01N33/68(20060101);A61K39/215(20060101);A61P31/14(20060101);C12R1/93(20060101);
代理机构11245 北京纪凯知识产权代理有限公司;
代理人关畅
地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院
入库时间 2023-06-19 09:57:26
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新出现的β属冠状病毒。病毒基因组分析显示,该病毒与同属的SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome-coronavirus)非常接近(89.1%的核苷酸相似性),感染后会引起人类肺炎等症状。新型冠状病毒为单股正链RNA病毒,具有囊膜。在电镜下观察,病毒颗粒呈圆形或椭圆形,具有放射状突起。这种放射状突起是冠状病毒的特征结构,它由囊膜蛋白Spike(S)构成。S蛋白是冠状病毒的重要结构蛋白,在病毒侵入宿主细胞的过程中起着关键作用。S蛋白还是冠状病毒中和抗体的靶点,是疫苗研究的重要靶蛋白。
现已将由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)纳入《中 华人民共和国传染病防治法》规定的“乙类”传染病,并采取“甲类”传染病的预防、控制措施。 COVID-19流行病学特点如下:主要传播途径为经呼吸道飞沫传播,亦可通过接触传播;人 群普遍易感,老年人及有基础疾病者感染后病情较重,儿童及婴幼儿也有发病。基于目前的 流行病学调查,患者潜伏期一般为3-7天,最长不超过14天。临床表现多为发热、乏力、干 咳。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。重症患者表现为呼吸困难、急性呼吸窘迫综合 征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。
由于目前尚无新型冠状病毒肺炎的特异药物,所以对患者主要开展对症治疗和支持治疗。卧床休息,保证充分热量;注意水、电解质平衡,维持内环境稳定;密切监测生命体征、指氧饱和度等。抗病毒治疗方法包括:α-干扰素雾化吸入及服用洛匹那韦/利托那韦。另外,新型冠状病毒感染的肺炎属于中医疫病范畴,病因为感受疫戾之气,可使用中医方案进行辩证治疗。
目前针对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的疫苗和药物还处于临床试验或更早期的阶段,亟须进行全面评价和进一步优化。本申请发明人前期以水疱性口炎病毒(VesicularStomatitis Virus,VSV)为载体,将VSV病毒的糖蛋白G替换成新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的囊膜蛋白S,构建了复制型的重组病毒rVSV-SARS-CoV-2。此重组病毒表面表达新型冠状病毒囊膜蛋白S,可以模拟新冠病毒入侵细胞的过程,并能激发机体产生针对SARS-CoV-2的免疫反应,通过喷鼻免疫可以在食蟹猴体内产生高滴度的新冠病毒中和抗体,并产生针对新冠病毒的保护。近期也有两篇文献:Replication-Competent Vesicular StomatitisVirus Vaccine Vector Protects against SARS-CoV-2-Mediated Pathogenesis inMice(Cell Host Microbe. 2020 Sep 9;28(3):465-474)和A single dose ofrecombinant VSV-ΔG-spike vaccine provides protection against SARS-CoV-2challenge(bioRxiv 2020.06.18.160655)报道用VSV作为载体,表达SARS-CoV-2的囊膜蛋白S作为抗原,在小动物模型中能产生针对SARS-CoV-2的免疫反应和保护。这两篇文献使用的复制型重组病毒与本申请发明人在前期发明中构建的rVSV-SARS-CoV-2相同,其诱导的免疫反应和保护效果也相近,都仍需进一步提高。
发明内容
为了研制免疫保护效果更好的新型冠状病毒疫苗,本发明提供了基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用。
第一方面,本发明保护一种重组病毒。
本发明保护的重组病毒为如下1)或2):
1)将水疱性口炎病毒的糖蛋白G替换为嵌合囊膜蛋白S后得到的病毒;所述嵌合囊膜蛋白S为将SARS-CoV囊膜蛋白S的RBD(受体结合结构域,Receptor binding domain)替换为SARS-CoV-2囊膜蛋白S的RBD后得到的蛋白;
2)将水疱性口炎病毒的糖蛋白G替换为嵌合囊膜蛋白S后得到的病毒;所述嵌合囊膜蛋白S为将SARS-CoV囊膜蛋白S的RBD替换为SARS-CoV-2囊膜蛋白S的RBD,且将SARS-CoV囊膜蛋白S氨基酸序列的第1261-1279位删除后得到的蛋白;
所述SARS-CoV囊膜蛋白S的RBD的氨基酸序列为SARS-CoV囊膜蛋白S氨基酸序列的第315-536位;
所述SARS-CoV-2囊膜蛋白S的RBD的氨基酸序列为SARS-CoV-2囊膜蛋白S氨基酸序列的第319-541位。
上述重组蛋白中,所述SARS-CoV-2囊膜蛋白S氨基酸序列为序列表中的序列4。
所述SARS-CoV囊膜蛋白S氨基酸序列为序列表中的序列6。
进一步的,所述嵌合囊膜蛋白S的氨基酸序列为a)或b)或c):
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质;
b)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质;
c)与序列2所示的氨基酸序列具有85%或85%以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
更进一步的,所述重组病毒为将水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的病毒。所述嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列为序列表中的序列1。
第二方面,本发明保护一种重组病毒。
本发明保护的重组病毒是将重组病毒载体转染病毒包装细胞,然后进行细胞培养后得到的;所述重组病毒载体为如下A)或B):
A)将水疱性口炎病毒载体中的水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的载体;
B)在A)所述的重组病毒载体中插入报告基因序列后得到的载体。
进一步的,所述嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列为序列表中的序列1。
所述报告基因可为现有技术中常用的报告基因,如eGFP基因(序列表中的序列14所示)、Luciferase基因。
更进一步的,所述A)中,所述重组病毒载体为将序列1所示的DNA分子插入rVSVΔG载体的酶切位点MluI和NotI之间后得到的载体。
所述rVSVΔG载体包括T7启动子序列、缺失糖蛋白G编码基因序列的水疱性口炎病毒Indiana毒株全基因组序列和HDV终止子序列,其核苷酸序列为序列表中的序列7。
所述病毒包装细胞可为现有技术中常用的用于病毒包装的细胞系,如293T细胞、Vero细胞和BHK细胞,具体可为Vero细胞。
所述重组病毒是将所述重组病毒载体、表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒及表达T7RNA聚合酶的质粒共同转染所述病毒包装细胞,然后进行细胞培养后得到的。
所述表达VSV的N蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的N蛋白编码基因序列(序列表中的序列8),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达VSV的P蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的P蛋白编码基因序列(序列表中的序列9),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达VSV的L蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的L蛋白编码基因序列(序列表中的序列10),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达VSV的M蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的M蛋白编码基因序列(序列表中的序列11),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达VSV的G蛋白的质粒具体为将VSV基因组中的G蛋白编码基因序列(序列表中的序列12),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。所述表达T7 RNA聚合酶的质粒具体为将T7RNA聚合酶编码基因序列(序列表中的序列13),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)后得到的质粒。
所述SARS-CoV-2具体为SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1毒株(GenBank:NC_045512.2);
所述SARS-CoV具体为SARS-CoV BJ01毒株(GenBank:AY278488.2);
所述水疱性口炎病毒具体为水疱性口炎病毒Indiana毒株(GenBank:KF935251.1)。
上述重组病毒载体也属于本发明的保护范围。
第三方面,本发明保护上述重组病毒或上述重组病毒载体的新用途。
本发明保护上述重组病毒或上述重组病毒载体在如下X1)-X3)中任一种中的应用:
X1)制备新型冠状病毒疫苗;
X2)制备预防和/或治疗新型冠状病毒导致的疾病的产品;
X3)筛选新型冠状病毒入侵抑制剂。
上述应用中,所述筛选新型冠状病毒入侵抑制剂具体体现在用于检测新型冠状病毒疫苗诱导产生的中和抗体滴度。
第四方面,本发明保护一种用于预防和/或治疗新型冠状病毒导致的疾病的产品。
本发明保护的用于预防和/或治疗新型冠状病毒导致的疾病的产品的活性成分为上述重组病毒或上述重组病毒载体。
上述任一所述应用或产品中,所述产品为新型冠状病毒疫苗。
上述任一所述应用或产品中,所述新型冠状病毒具体为SARS-CoV-2。
所述新型冠状病毒导致的疾病具体为新型冠状病毒导致的COVID-19。
本发明所涉及的概念如下:
疫苗是将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物,经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后,免疫系统便会产生一定的保护物质,如抗体等;当动物再次接触到这种病原菌时,动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆,制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。
水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)为单股负链不分节段RNA病毒,基因组长约11Kb,结构简单。从3'到5'依次转录出5条mRNA,分别编码5种蛋白:核衣壳蛋白N(nucleocapsid protein)、磷蛋白P(phosphoprotein)、基质蛋白M(matrix protein)、糖蛋白G(glycoprotein)、大聚合酶L(large protein)。G蛋白是I型整合膜蛋白,在病毒粒子表面以三聚体形式存在,行使与靶细胞受体结合及膜融合的功能。在感染了VSV的动物体内,所产生的抗体绝大部分针对G蛋白。VSV是弹状病毒科的代表模式毒种,被广泛用作研究囊膜病毒入侵细胞、复制和装配等机制。VSV病毒引起的水疱性口炎是接触性传染的良性疾病,主要感染啮齿类动物牛、猪和马,也能感染人类和其它动物。人只偶然感染,但常不显症状或仅轻微发热。人群中具有VSV抗体的比率极低,只有经常暴露接触VSV的人群血清阳性率较高,比如一些科研人员,接触病畜的兽医的农场工人。VSV的中和抗体靶点是G蛋白,一旦G蛋白被替换成外源病毒的囊膜蛋白,重组病毒将不受人体预存免疫(pre-existingimmunity)的影响。不受预存免疫影响和不具明显致病性是VSV作为疫苗载体的前提条件。
在现有的各种活病毒疫苗载体中,水疱性口炎病毒(Vesicular StomatitisVirus,VSV)具有人群中血清阳性率低;能诱导粘膜免疫;基因组简单,易于规模化生产等突出的优点,被认为是最具有开发潜力的病毒疫苗载体之一。成功的从DNA恢复出有感染性的VSV病毒,使得对VSV进行遗传操作变为可能。带有合适胞质尾的外源病毒功能囊膜蛋白可以有效包装进病毒的囊膜,形成各种包装异源囊膜蛋白的嵌合重组VSV。重组VSV各转录单元之间的非编码区可耐受长达4.5kb外源基因的插入并获得高效表达。这些特性赋予了VSV作为活病毒疫苗载体的应用潜力。
作为一种新兴的活载体疫苗,VSV具有以下优点:(1)易于培养:VSV在大多数哺乳动物细胞上都可获得很高滴度,容易大量制备。(2)高效性:在VSV-HA感染的小鼠模型中,10个感染性病毒颗粒诱导的免疫应答和10
本发明制备的VSV重组病毒不同于VSV假病毒,其最大区别在于本发明制备的VSV重组病毒感染细胞后可以复制,而VSV假病毒只能感染细胞却不能复制。另外,两者制备方法及应用范围也不同。虽然二者都可以用于病毒抑制剂的筛选和病毒感染机制的基础研究,但本发明制备的VSV重组病毒还可以用于制备疫苗,而VSV假病毒不能用于制备疫苗。
SARS冠状病毒(SARS-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)相似性很高,都属于β属冠状病毒,使用相同的细胞受体ACE2,S蛋白的受体结合结构域(RBD)是主要的抗原表位。但是,研究发现VSV重组SARS冠状病毒rVSV-SARS-CoV诱导的中和抗体水平远高于VSV重组新型冠状病毒rVSV-SARS-CoV-2。为了进一步提高VSV重组新型冠状病毒载体疫苗的免疫保护效果,本发明将SARS冠状病毒囊膜蛋白S的RBD替换为新型冠状病毒的RBD,构建出复制型的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD。该重组病毒表面表达新型冠状病毒和SARS冠状病毒囊膜蛋白S的嵌合蛋白,其中主要抗原表位为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RBD,因此嵌合S蛋白激发免疫反应主要针对新型冠状病毒。而且把新型冠状病毒的主要抗原表位RBD嵌合到免疫原性更强的SARS冠状病毒的S蛋白上后,可以在小鼠和猕猴动物模型内诱导比野生型新型冠状病毒S蛋白更高滴度的中和抗体,从而有更好的保护效果。该重组病毒对新型冠状病毒的疫苗研制具有重要意义。
附图说明
图1为嵌合囊膜蛋白S的嵌合示意图。
图2为VSV-SARS-CoV/2-RBD构建示意图。
图3为S蛋白在重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD上的表达水平检测。
图4为rVSV-SARS-CoV/2-RBD的生长曲线。
图5为重组病毒rVSV-SARS-CoV-2和rVSV-SARS-CoV接种人ACE2转基因小鼠hACE2-KI/NIFDC产生的中和抗体。
图6为重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2接种Balb/c小鼠产生的中和抗体。
图7为重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2接种人ACE2转基因小鼠hACE2-KI/NIFDC产生的中和抗体。
图8为重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2接种猕猴产生的中和抗体。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
下述实施例中的rVSVΔG载体记载于文献“Single dose of a rVSV-basedvaccine elicits complete protection against severe fever withthrombocytopenia syndrome virus. NPJ Vaccines. 2019 Jan 25;4:5.”中,公众可从中国科学院动物研究所获得,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。rVSVΔG载体的核苷酸序列为序列表中的序列7,其包括T7启动子序列、缺失糖蛋白G编码基因序列的水疱性口炎病毒Indiana毒株全基因组序列和HDV终止子序列。
下述实施例中的表达VSV的N蛋白的质粒为将VSV基因组中的N蛋白编码基因序列(序列表中的序列8),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。
下述实施例中的表达VSV的P蛋白的质粒为将VSV基因组中的P蛋白编码基因序列(序列表中的序列9),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。
下述实施例中的表达VSV的L蛋白的质粒为将VSV基因组中的L蛋白编码基因序列(序列表中的序列10),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。
下述实施例中的表达VSV的M蛋白的质粒为将VSV基因组中的M蛋白编码基因序列(序列表中的序列11),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。
下述实施例中的表达VSV的G蛋白的质粒为将VSV基因组中的G蛋白编码基因序列(序列表中的序列12),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。
下述实施例中的表达T7 RNA聚合酶的质粒为将T7RNA聚合酶编码基因序列(序列表中的序列13),通过BamHI和EcoRI酶切位点克隆入真核表达质粒pCDNA3.1(+)(北京盛元科萌基因生物科技有限公司)后得到的质粒。
下述实施例中的Vero细胞是ATCC(American type culture collection)的产品,货号为CCL-81。
实施例1、重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的制备
一、重组载体VSV-SARS-CoV/2-RBD的制备
1、嵌合囊膜蛋白S序列的优化
为了研制新型冠状病毒疫苗,将SARS-CoV BJ01毒株(基因库登录号AY278488.2)的囊膜蛋白S氨基酸序列(基因库登录号AAP30030.1)的第1-314位和第537-1259位的编码基因序列,与SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1毒株(基因库登录号 NC_045512.2)的囊膜蛋白S氨基酸序列(基因库登录号YP_009724390.1)的第319-541位的编码基因序列进行人源化优化并嵌合后,得到嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列,其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
嵌合囊膜蛋白S为将SARS冠状病毒(SARS-CoV)囊膜蛋白S的RBD(SARS-CoV囊膜蛋白S氨基酸序列的第315-536位)替换为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)囊膜蛋白S的RBD(SARS-CoV-2囊膜蛋白S氨基酸序列的第319-541位),且将SARS冠状病毒(SARS-CoV)囊膜蛋白S氨基酸序列的第1261-1279位(SARS-CoV囊膜蛋白S胞内区的C端的19个氨基酸)删除,且保持SARS冠状病毒(SARS-CoV)囊膜蛋白S的其他氨基酸序列不变后得到的蛋白(图1),其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
2、重组载体VSV-SARS-CoV/2-RBD的构建
将步骤1中嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列(序列1)插入rVSVΔG载体的酶切位点MluI和NotI之间,得到重组载体,将其命名为重组载体VSV-SARS-CoV/2-RBD。
二、重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的制备
将步骤一中的重组载体VSV-SARS-CoV/2-RBD以及辅助质粒(表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒、表达T7 RNA聚合酶的质粒)共同转染Vero细胞,制备得到重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD。重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的结构示意图如图2所示。具体步骤如下:
1、将Vero细胞传代至培养皿中,第二天细胞密度达到70%-80%时,把完全培养基换成含有2%(体积分数)胎牛血清(FBS,Thermo Fisher,货号为10091)的DMEM培养基(ThermoFisher,货号为SH30243.01B),得到Vero细胞培养体系。
2、完成步骤1后,将36μL FuGENE 6(Promaga公司,货号为E2692)与Opti-MEM培养基(Thermo Fisher,货号为51985091)室温孵育5分钟,与步骤一中的重组载体质粒VSV-SARS-CoV/2-RBD(1.59μg)、表达VSV的N蛋白的质粒(1.286μg)、表达VSV的P蛋白的质粒(639ng)、表达VSV的L蛋白的质粒(159.9ng)、表达VSV的M蛋白的质粒(159.9ng)、表达VSV的G蛋白的质粒(159.9ng)、表达T7 RNA聚合酶的质粒(8.1μg)混匀,室温孵育15分钟,得到孵育后溶液(总体积为600μL)。
3、完成步骤2后,将步骤2中孵育后的溶液加入步骤1中的Vero细胞培养体系中,6小时后换新鲜培养基。转染3天之后收取细胞上清,该上清中含有重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD。用所获得的上清感染新的Vero细胞,实现重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的扩增。重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD为将水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为嵌合囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的病毒。
三、对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2的制备
1、重组载体VSV-SARS-CoV-2的制备
将序列3所示的SARS-CoV-2的囊膜蛋白S的编码基因序列插入rVSVΔG载体的酶切位点MluI和NotI之间,得到重组载体,将其命名为重组载体VSV-SARS-CoV-2。SARS-CoV-2的囊膜蛋白S的氨基酸序列如序列表中的序列4所示。
2、重组病毒rVSV-SARS-CoV-2的制备
按照步骤二中的方法,将步骤1中的重组载体VSV-SARS-CoV-2以及辅助质粒(表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒、表达T7 RNA聚合酶的质粒)共同转染Vero细胞,制备得到重组病毒rVSV-SARS-CoV-2。重组病毒rVSV-SARS-CoV-2为将水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为SARS-CoV-2的囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的病毒。
四、对照重组病毒rVSV-SARS-CoV的制备
1、重组载体VSV-SARS-CoV的制备
将序列5所示的SARS-CoV的囊膜蛋白S的编码基因序列插入rVSVΔG载体的酶切位点MluI和NotI之间,得到重组载体,将其命名为重组载体VSV-SARS-CoV。SARS-CoV的囊膜蛋白S的氨基酸序列如序列表中的序列6所示。
2、重组病毒rVSV-SARS-CoV的制备
按照步骤二中的方法,将步骤1中的重组载体VSV-SARS-CoV以及辅助质粒(表达VSV的N蛋白的质粒、表达VSV的P蛋白的质粒、表达VSV的L蛋白的质粒、表达VSV的M蛋白的质粒、表达VSV的G蛋白的质粒、表达T7 RNA聚合酶的质粒)共同转染Vero细胞,制备得到重组病毒rVSV-SARS-CoV。重组病毒rVSV-SARS-CoV为将水疱性口炎病毒基因组序列中的糖蛋白G的编码基因序列替换为SARS-CoV的囊膜蛋白S的编码基因序列后得到的病毒。
实施例2、重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的抗原表达鉴定
为了鉴定rVSV-SARS-CoV/2-RBD表达嵌合S蛋白的情况,收集实施例1制备的rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2感染的Vero细胞上清,采用超速离心方法,39,000转4℃离心3小时(Beckman SW41转头),获得病毒沉淀,重悬病毒沉淀后得到浓缩的病毒。然后采用Western Blot方法(抗RBD蛋白的抗体,北京义翘神州科技有限公司,兔抗SARS-CoV-2 RBD多抗,货号40592-T62)检测S蛋白在纯化的病毒颗粒和感染的Vero细胞上清中的表达情况。以未感染的Vero细胞作为对照。
结果如图3所示。结果显示:在rVSV-SARS-CoV/2-RBD感染的Vero细胞上清和纯化的病毒颗粒上都能检测到S蛋白的表达,条带大小约为180KD,说明嵌合S蛋白成功的包装进了重组病毒中。对照病毒rVSV-SARS-CoV-2除了检测到180KD条带外,还有一条110KD条带,分别对应S和S1蛋白。
实施例3、重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD的生长曲线
将Vero细胞按照1:3的比例传代于10cm细胞培养皿中。第二天细胞长到80%左右密度时加入实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2,M.O.I.=0.01,感染2个小时后换液成含有2%(体积分数)FBS的DMEM培养基。感染后每隔12小时取样,一直取到感染后108个小时。通过免疫荧光法测定不同感染时间上清液中的病毒滴度。
免疫荧光法测病毒滴度的操作方法具体如下:将Vero细胞按照每孔1.0万个细胞传代于96孔板中。第二天细胞长到80%-90%左右密度时加入待测病毒上清。对病毒上清进行10倍梯度稀释,即30 µl病毒原液与270 µl病毒稀释液混匀,以此类推,共稀释6-7个梯度。病毒稀释液为含有2%(体积分数)FBS的DMEM培养基。每个孔中加入100 µl病毒液,每个稀释度设3孔重复。将细胞放置于37℃细胞培养箱中,感染2小时后换液为含有20 mM NH
结果如图4所示。结果显示:对比两种重组病毒的生长曲线,rVSV-SARS-CoV/2-RBD扩增更快,在感染后36小时即达到10
实施例4、免疫实验
一、人ACE2转基因小鼠免疫实验
试验动物:人ACE2转基因小鼠hACE2-KI/NIFDC模型(在C57BL/6小鼠背景上基于CRISPR/Cas9技术将人hACE2基因cDNAs插入到小鼠mACE2启动子之下获得的人源化动物模型)。该模型记载于文献“A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis.Cell Host Microbe. 2020;28(1):124-133.e4.”中。
试验方法:将实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV-2和rVSV-SARS-CoV通过肌肉注射途径接种hACE2-KI/NIFDC小鼠(剂量为8×10
中和抗体滴度检测方法的具体步骤如下:将Vero细胞按照每孔1.0万个细胞传代于96孔板中。第二天细胞长到80%-90%左右时准备试验。首先将血清按照5倍稀释法进行稀释,例如1:10、1:50、1:250、1:1250。同时把rVSV-eGFP-SARS-CoV-2病毒稀释至2×10
结果如图5所示。结果显示:rVSV-SARS-CoV免疫的小鼠,所诱导的中和抗体水平远高于rVSV-SARS-CoV-2所诱导的中和抗体,为其的5倍左右。
二、小鼠免疫实验
试验动物:BALB/c小鼠(斯贝福(北京)生物技术有限公司,雌性,6-8周龄)。
试验方法:将实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2通过肌肉注射和滴鼻途径接种BALB/c小鼠(肌肉注射3×10
结果如图6所示。结果显示:rVSV-SARS-CoV-2免疫的小鼠,在14天,28天均未检测到中和抗体。而用rVSV-SARS-CoV/2-RBD免疫后,无论是肌肉注射还是滴鼻途径免疫都能产生针对SARS-CoV-2的中和抗体。其中肌肉注射组在免疫后28天中和抗体平均滴度为121.7,滴鼻组中和抗体平均滴度为112。
三、人ACE2转基因小鼠免疫实验
试验动物:人ACE2转基因小鼠hACE2-KI/NIFDC模型。
试验方法:将实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2通过肌肉注射和滴鼻途径接种hACE2-KI/NIFDC小鼠(肌肉注射8×10
结果如图7所示。结果显示:rVSV-SARS-CoV-2免疫的小鼠,仅有肌肉注射组可检测到中和抗体,其中28天的中和抗体平均滴度为301.2。而用rVSV-SARS-CoV/2-RBD免疫后,无论是肌肉注射还是滴鼻都能产生针对SARS-CoV-2的中和抗体,其中肌肉注射组在免疫后28天的中和抗体平均滴度为717.1,滴鼻组中和抗体平均滴度为339.9。由此可见rVSV-SARS-CoV/2-RBD所诱导的中和抗体水平明显优于rVSV-SARS-CoV-2。
四、猕猴免疫实验
试验动物:3只20岁的老年猕猴(相当于80岁老人)(雌性,北京中科灵瑞生物技术股份有限公司)。
试验方法:将实施例1制备的重组病毒rVSV-SARS-CoV/2-RBD和对照重组病毒rVSV-SARS-CoV-2通过滴鼻途径接种3只20岁的老年猕猴,接种剂量为1×10
结果如图8所示。结果显示:rVSV-SARS-CoV/2-RBD免疫组中有一只产生很高滴度的中和抗体,滴度为2174.6。而rVSV-SARS-CoV-2免疫组中产生的最高中和抗体滴度为1075.7。总体而言rVSV-SARS-CoV/2-RBD免疫组的免疫效果好于rVSV-SARS-CoV-2免疫组。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcggctagcg acctggacag gtgcaccacc ttcgacgacg tgcaggcccc caactacacc 120
cagcacacca gcagcatgag gggcgtgtac taccccgacg agatcttcag gagcgacacc 180
ctgtacctga cccaggacct gttcctgccc ttctacagca acgtgaccgg cttccacacc 240
atcaaccaca ccttcgacaa ccccgtgatc cccttcaagg acggcatcta cttcgccgcc 300
accgagaaga gcaacgtggt gaggggctgg gtgttcggca gcaccatgaa caacaagagc 360
cagagcgtga tcatcatcaa caacagcacc aacgtggtga tcagggcctg caacttcgag 420
ctgtgcgaca accccttctt cgccgtgagc aagcccatgg gcacccagac ccacaccatg 480
atcttcgaca acgccttcaa ctgcaccttc gagtacatca gcgacgcctt cagcctggac 540
gtgagcgaga agagcggcaa cttcaagcac ctgagggagt tcgtgttcaa gaacaaggac 600
ggcttcctgt acgtgtacaa gggctaccag cccatcgacg tggtgaggga cctgcccagc 660
ggcttcaaca ccctgaagcc catcttcaag ctgcccctgg gcatcaacat caccaacttc 720
agggccatcc tgaccgcctt cagccccgcc caggacacct ggggcaccag cgctgcagcc 780
tacttcgtgg gctacctgaa gcccaccacc ttcatgctga agtacgacga gaacggcacc 840
atcaccgacg ccgtggactg cagccagaac cccctggccg agctgaagtg cagcgtgaag 900
agcttcgaga tcgacaaggg catctaccag accagcaact tccgggtgca gcctacagag 960
tctattgtgc ggttcccaaa catcacaaac ctgtgccctt tcggcgaggt gttcaacgcc 1020
acccggttcg cctctgtgta cgcctggaac cggaagcgga tctctaactg cgtggccgac 1080
tactccgtgc tgtacaactc cgcctctttc tctacattca agtgctacgg cgtgtcccct 1140
acaaagctga acgacctgtg cttcaccaac gtgtacgccg actctttcgt gattagaggc 1200
gacgaggtga ggcagattgc ccccggccag acaggcaaga tcgccgacta caactacaag 1260
ctgcccgacg acttcacagg ctgcgtgatc gcctggaact ctaacaacct ggactctaag 1320
gtgggcggca actacaacta cctgtacaga ctgttccgga agtctaacct gaagccattc 1380
gagagggaca ttagcaccga gatttaccag gccggctcta ccccatgcaa cggcgtggag 1440
ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggcttcc agcctacaaa cggcgtgggc 1500
taccagcctt accgggtggt ggtgctgtct ttcgagctgc tccacgcccc cgccacagtg 1560
tgcggcccaa agaagagcac aaacctcgtg aagaacaagt gcgtgaactt caacttcaac 1620
ggcctgaccg gcaccggcgt gctgacacct agcagcaaga ggttccagcc cttccagcag 1680
ttcggcaggg acgtgagcga cttcaccgac agcgtgaggg accccaagac cagcgagatc 1740
ctggacatca gcccttgcag cttcggcggc gtgagcgtga tcacacctgg caccaacgcc 1800
agcagcgagg tggccgtgct gtaccaggac gtgaactgca ccgacgtgag caccgccatc 1860
cacgccgacc agctgacacc tgcctggagg atctacagca ccggcaacaa cgtgttccag 1920
acccaggccg gctgcctgat cggcgccgag cacgtggaca ccagctacga gtgcgacatc 1980
cctatcggcg ccggcatctg cgccagctac cacaccgtga gcctgctgag gagcaccagc 2040
cagaagagca tcgtggccta caccatgagc ctgggcgccg acagcagcat cgcctacagc 2100
aacaacacca tcgccattcc taccaacttc agcatcagca tcaccaccga ggtgatgccc 2160
gtgagcatgg ccaagaccag cgtggactgc aacatgtaca tctgcggcga cagcaccgag 2220
tgcgccaacc tgctgctcca gtacggcagc ttctgcaccc agctgaacag ggccctgagc 2280
ggcatcgccg ccgagcagga caggaacacc agggaggtgt tcgcccaggt gaagcagatg 2340
tacaagaccc caaccctgaa gtacttcggc ggcttcaact tcagccagat cctgcccgac 2400
cccctgaagc ccaccaagag gagcttcatc gaggacctgc tgttcaacaa ggtgaccctg 2460
gccgacgccg gcttcatgaa gcagtacggc gagtgcctgg gcgacatcaa cgccagggac 2520
ctgatctgcg cccagaagtt caacggcctg accgtgctgc cacctctgct gaccgacgac 2580
atgatcgccg cctacaccgc cgccctggtg agcggcaccg ccaccgccgg ctggaccttc 2640
ggcgccggcg ccgccctcca gatccccttc gccatgcaga tggcctacag gttcaacggc 2700
atcggcgtga cccagaacgt gctgtacgag aaccagaagc agatcgccaa ccagttcaac 2760
aaggccatca gccagatcca ggagagcctg accaccacca gcaccgccct gggcaagctc 2820
caggacgtgg tgaaccagaa cgcccaggcc ctgaacaccc tggtgaagca gctgagcagc 2880
aacttcggcg ccatcagcag cgtgctgaac gacatcctgt ctagactgga caaggtggag 2940
gccgaggtgc agatcgacag gctgatcacc ggcaggctgc agagcctgca gacctacgtg 3000
acccagcagc tgatcagggc cgccgagatc agggccagcg ccaacctggc cgccaccaag 3060
atgagcgagt gcgtgctggg ccagagcaag agggtggact tctgcggcaa gggctaccac 3120
ctgatgagct tcccccaggc cgccccccac ggcgtggtgt tcctgcacgt gacctacgtg 3180
cccagccagg agaggaactt caccaccgcc cccgccatct gccacgaggg caaggcctac 3240
ttccccaggg agggcgtgtt cgtgttcaac ggcaccagct ggttcatcac ccagaggaac 3300
ttcttcagcc cccagatcat caccaccgac aacaccttcg tgagcggcaa ctgcgacgtg 3360
gtgatcggca tcatcaacaa caccgtgtac gaccccctgc agcccgagct ggacagcttc 3420
aaggaggagc tggacaagta cttcaagaac cacaccagcc ccgacgtgga cctgggcgac 3480
atcagcggca tcaacgccag cgtggtgaac atccagaagg agatcgacag gctgaacgag 3540
gtggccaaga acctgaacga gagcctgatc gacctgcagg agctgggcaa gtacgagcag 3600
tacatcaagt ggccctggta cgtgtggctg ggcttcatcg ccggcctgat cgccatcgtg 3660
atggtgacca tcctgctgtg ctgcatgacc agctgctgca gctgcctgaa gagactcaaa 3720
aggtcaatgc taatgggtaa tccagatgac cgtataccga gggacacata tacattagag 3780
tga 3783
<210> 2
<211> 1260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Ala Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp
20 25 30
Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly
35 40 45
Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr
50 55 60
Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr
65 70 75 80
Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile
85 90 95
Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe
100 105 110
Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn
115 120 125
Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn
130 135 140
Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met
145 150 155 160
Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala
165 170 175
Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg
180 185 190
Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly
195 200 205
Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr
210 215 220
Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe
225 230 235 240
Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr
245 250 255
Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met
260 265 270
Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser
275 280 285
Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile
290 295 300
Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu
305 310 315 320
Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu
325 330 335
Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys
340 345 350
Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala
355 360 365
Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn
370 375 380
Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly
385 390 395 400
Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
405 410 415
Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp
420 425 430
Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu
435 440 445
Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile
450 455 460
Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu
465 470 475 480
Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr
485 490 495
Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu
500 505 510
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
515 520 525
Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly
530 535 540
Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln
545 550 555 560
Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys
565 570 575
Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser
580 585 590
Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr
595 600 605
Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln
610 615 620
Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln
625 630 635 640
Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr
645 650 655
Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr
660 665 670
Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr
675 680 685
Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile
690 695 700
Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro
705 710 715 720
Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly
725 730 735
Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys
740 745 750
Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg
755 760 765
Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro
770 775 780
Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp
785 790 795 800
Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn
805 810 815
Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met Lys Gln Tyr Gly Glu Cys
820 825 830
Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn
835 840 845
Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Asp Met Ile Ala Ala
850 855 860
Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala Thr Ala Gly Trp Thr Phe
865 870 875 880
Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr
885 890 895
Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln
900 905 910
Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu
915 920 925
Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val
930 935 940
Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser
945 950 955 960
Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu
965 970 975
Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg
980 985 990
Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala
995 1000 1005
Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys
1010 1015 1020
Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His
1025 1030 1035 1040
Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His
1045 1050 1055
Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala
1060 1065 1070
Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val
1075 1080 1085
Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro
1090 1095 1100
Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1105 1110 1115 1120
Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu
1125 1130 1135
Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr
1140 1145 1150
Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val
1155 1160 1165
Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn
1170 1175 1180
Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln
1185 1190 1195 1200
Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu
1205 1210 1215
Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys
1220 1225 1230
Cys Ser Cys Leu Lys Arg Leu Lys Arg Ser Met Leu Met Gly Asn Pro
1235 1240 1245
Asp Asp Arg Ile Pro Arg Asp Thr Tyr Thr Leu Glu
1250 1255 1260
<210> 3
<211> 3822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgttcgtgt tcctcgtgct cctgcctctg gtgtctagcc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
cggacccagc tccctcccgc ctacacaaac tctttcaccc ggggcgtgta ctaccccgac 120
aaggtgttcc ggtctagcgt gctccactct acacaggacc tgttcctccc tttcttcagc 180
aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg tctggcacaa acggcacaaa gcggttcgac 240
aaccccgtgc tccctttcaa cgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gtctaacatt 300
atccggggct ggattttcgg caccacactc gactctaaga cacagtccct cctgattgtg 360
aacaacgcca caaacgtggt gattaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccctttc 420
ctgggcgtgt actaccacaa gaacaacaag tcttggatgg agtctgagtt cagagtgtac 480
tctagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc ctttcctcat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgaga gagttcgtgt tcaagaacat tgacggctac 600
ttcaagattt actctaagca caccccaatt aacctcgtga gggacctccc tcagggcttc 660
tccgccttag aaccactggt ggacctccct attggcatta acatcacacg cttccagaca 720
ctgctcgccc tccaccggtc ttacctgacc ccaggcgact ctagctctgg ctggacagcc 780
ggcgccgccg cctactacgt gggctacctg cagcctagga ccttcctcct gaagtacaac 840
gagaacggca caattaccga cgccgtggac tgcgccctgg acccactgtc cgagacaaag 900
tgcacactga agtccttcac agtggagaag ggcatttacc agacatctaa cttccgggtg 960
cagcctacag agtctattgt gcggttccca aacatcacaa acctgtgccc tttcggcgag 1020
gtgttcaacg ccacccggtt cgcctctgtg tacgcctgga accggaagcg gatctctaac 1080
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac tccgcctctt tctctacatt caagtgctac 1140
ggcgtgtccc ctacaaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgactctttc 1200
gtgattagag gcgacgaggt gaggcagatt gcccccggcc agacaggcaa gatcgccgac 1260
tacaactaca agctgcccga cgacttcaca ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaac 1320
ctggactcta aggtgggcgg caactacaac tacctgtaca gactgttccg gaagtctaac 1380
ctgaagccat tcgagaggga cattagcacc gagatttacc aggccggctc taccccatgc 1440
aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggctt ccagcctaca 1500
aacggcgtgg gctaccagcc ttaccgggtg gtggtgctgt ctttcgagct gctccacgcc 1560
cccgccacag tgtgcggccc aaagaagagc acaaacctcg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctcac aggcacaggc gtgctcaccg agtctaacaa gaagttcctc 1680
cctttccagc agttcggccg cgacattgcc gacaccaccg acgccgtgcg ggaccctcag 1740
acactggaaa ttctcgacat caccccttgc agcttcggcg gcgtgtccgt gatcacccca 1800
ggcacaaaca catctaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg caccgaggtg 1860
ccagtggcca tccacgccga ccagctcacc ccaacatgga gggtgtacag cacaggctct 1920
aacgtgttcc agacccgggc cggctgcctc attggcgccg agcacgtgaa caactcttac 1980
gagtgcgaca tccctattgg cgccggcatt tgcgcctctt accagaccca gacaaactct 2040
ccacggagag cccggtctgt ggcctctcag agcattattg cctacaccat gtctctgggc 2100
gccgagaact ctgtggccta ctctaacaac tctattgcca tccctacaaa cttcacaatt 2160
tctgtgacca ccgagattct cccagtgtct atgaccaaga catctgtgga ctgcaccatg 2220
tacatttgcg gcgactccac cgagtgctct aacctcctgc tccagtacgg ctctttctgc 2280
acccagctca accgcgccct gacaggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatttacaag acccccccaa ttaaggactt cggcggcttc 2400
aacttctctc agattctccc cgacccatcc aagcctagca agcggtcctt cattgaggac 2460
ctcctgttca acaaggtgac actggccgac gccggcttca ttaagcagta cggcgactgc 2520
ctgggcgaca ttgccgcccg ggacctgatt tgcgcccaga agttcaacgg cctcacagtg 2580
ctccccccac tgctcaccga cgagatgatt gcccagtaca catctgccct cctggccggc 2640
acaattacat ctggctggac cttcggcgcc ggcgccgccc tgcagatccc tttcgccatg 2700
cagatggcct accgcttcaa cggcatcggc gtgacacaga acgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc attggcaaga ttcaggactc tctgagcagc 2820
acagccagcg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaacc agaacgccca ggccctgaac 2880
acactggtga agcagctgtc ttctaacttc ggcgccattt ctagcgtgct gaacgacatt 2940
ctgtcgcggc tggacaaggt ggaggccgag gtgcagattg acaggctcat cacaggcaga 3000
ctgcagtctc tgcagacata cgtgacccag cagctgatta gagccgccga gattagagcc 3060
tccgccaacc tggccgccac caagatgagc gagtgcgtgc tcggccagtc taagcgggtg 3120
gacttctgcg gcaagggcta ccacctcatg tctttccctc agtccgcccc tcacggcgtg 3180
gtgttcctcc acgtgacata cgtgcccgcc caggagaaga acttcaccac agcccccgcc 3240
atttgccacg acggcaaggc ccacttccct agggagggcg tgttcgtgtc taacggcacc 3300
cactggttcg tgacccagcg gaacttctac gagcctcaga ttattaccac agacaacaca 3360
ttcgtgagcg gcaactgcga cgtggtgatt ggcattgtga acaacacagt gtacgaccca 3420
ctgcagcctg agttggactc tttcaaggag gaactcgaca agtacttcaa gaaccacaca 3480
tctcctgacg tggacctggg cgacattagc ggcattaacg cctctgtggt gaacattcag 3540
aaggagattg acagactgaa cgaggtggcc aagaacctga acgagtctct cattgacctg 3600
caggagctgg gcaagtacga gcagtacatt aagtggcctt ggtacatttg gctgggcttc 3660
attgccggcc tgatcgccat tgtgatggtg accatcatgc tgtgctgcat gacatcttgc 3720
tgcagctgcc tgaagggctg ctgctcttgc ggctcttgct gcaagttcga cgaggacgac 3780
tctgagcccg tgctgaaggg cgtgaagctc cactacacct ga 3822
<210> 4
<211> 1273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
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tcctctgccg acttggcaca acagttttgt gttggagata acaaatacac tccagatgat 1140
agtaccggag gattgacgac taatgcaccg ccacaaggca gagatgtggt cgaatggctc 1200
ggatggtttg aagatcaaaa cagaaaaccg actcctgata tgatgcagta tgcgaaaaga 1260
gcagtcatgt cactgcaagg cctaagagag aagacaattg gcaagtatgc taagtcagaa 1320
tttgacaaat gaccctataa ttctcagatc acctattata tattatgcta catatgaaaa 1380
aaactaacag atatcatgga taatctcaca aaagttcgtg agtatctcaa gtcctactct 1440
cgtctagatc aggcggtagg agagatagat gagatcgaag cacaacgagc tgaaaagtcc 1500
aattatgagt tgttccaaga ggacggagtg gaagagcata ctaggccctc ttattttcag 1560
gcagcagatg attctgacac agaatctgaa ccagaaattg aagacaatca aggcttgtat 1620
gtaccagatc cggaagctga gcaagttgaa ggctttatac aggggccttt agatgactat 1680
gcagatgagg acgtggatgt tgtattcact tcggactgga aacagcctga gcttgaatcc 1740
gacgagcatg gaaagacctt acggttgaca ttgccagagg gtttaagtgg agagcagaaa 1800
tcccagtggc ttttgacgat taaagcagtc gttcaaagtg ccaaacactg gaatctggca 1860
gagtgcacat ttgaagcatc gggagaaggg gtcatcataa aaaagcgcca gataactccg 1920
gatgtatata aggtcactcc agtgatgaac acacatccgt accaatcaga agccgtatca 1980
gatgtttggt ctctctcaaa gacatccatg actttccaac ccaagaaagc aagtcttcag 2040
cctctcacca tatccttgga tgaattgttc tcatctagag gagaattcat ctctgtcgga 2100
ggtaacggac gaatgtctca taaagaggcc atcctgctcg gtctgaggta caaaaagttg 2160
tacaatcagg cgagagtcaa atattctctg tagactatga aaaaaagtaa cagatatcac 2220
aatctaagtg ttatcccaat ccattcatca tgagttcctt aaagaagatt ctcggtctga 2280
aggggaaagg taagaaatct aagaaattag ggatcgcacc acccccttat gaagaggaca 2340
ctagcatgga gtatgctccg agcgctccaa ttgacaaatc ctattttgga gttgacgaga 2400
tggacaccta tgatccgaat caattaagat atgagaaatt cttctttaca gtgaaaatga 2460
cggttagatc taatcgtccg ttcagaacat actcagatgt ggcagccgct gtatcccatt 2520
gggatcacat gtacatcgga atggcaggga aacgtccctt ctacaaaatc ttggcttttt 2580
tgggttcttc taatctaaag gccactccag cggtattggc agatcaaggt caaccagagt 2640
atcacgctca ctgcgaaggc agggcttatt tgccacatag gatggggaag acccctccca 2700
tgctcaatgt accagagcac ttcagaagac cattcaatat aggtctttac aagggaacga 2760
ttgagctcac aatgaccatc tacgatgatg agtcactgga agcagctcct atgatctggg 2820
atcatttcaa ttcttccaaa ttttctgatt tcagagagaa ggccttaatg tttggcctga 2880
ttgtcgagaa aaaggcatct ggagcgtggg tcctggattc tatcagccac ttcaaatgag 2940
ctagtctagc ttccagcttc tgaacaatcc ccggtttact cagtctctcc taattccagc 3000
ctttcgaaca actaatatcc tgtcttttct atccctatga aaaaaactaa cagagatcga 3060
tctgtttcct tgaccctgca caacagattc ttcatgtttg aaccaaatca acttgtgata 3120
tcatgctcaa agaggcctta attatatttt aatttttaat ttttatgaaa aaaactaaca 3180
gcaatcatgg aagtccacga ttttgagacc gacgagttca atgatttcaa tgaagatgac 3240
tatgccacaa gagaattcct gaatcccgat gagcgcatga cgtacttgaa tcatgctgat 3300
tacaatttga attctcctct aattagtgat gatattgaca atttgatcag gaaattcaat 3360
tctcttccga ttccctcgat gtgggatagt aagaactggg atggagttct tgagatgtta 3420
acatcatgtc aagccaatcc catctcaaca tctcagatgc ataaatggat gggaagttgg 3480
ttaatgtctg ataatcatga tgccagtcaa gggtatagtt ttttacatga agtggacaaa 3540
gaggcagaaa taacatttga cgtggtggag accttcatcc gcggctgggg caacaaacca 3600
attgaataca tcaaaaagga aagatggact gactcattca aaattctcgc ttatttgtgt 3660
caaaagtttt tggacttaca caagttgaca ttaatcttaa atgctgtctc tgaggtggaa 3720
ttgctcaact tggcgaggac tttcaaaggc aaagtcagaa gaagttctca tggaacgaac 3780
atatgcagga ttagggttcc cagcttgggt cctactttta tttcagaagg atgggcttac 3840
ttcaagaaac ttgatattct aatggaccga aactttctgt taatggtcaa agatgtgatt 3900
atagggagga tgcaaacggt gctatccatg gtatgtagaa tagacaacct gttctcagag 3960
caagacatct tctcccttct aaatatctac agaattggag ataaaattgt ggagaggcag 4020
ggaaattttt cttatgactt gattaaaatg gtggaaccga tatgcaactt gaagctgatg 4080
aaattagcaa gagaatcaag gcctttagtc ccacaattcc ctcattttga aaatcatatc 4140
aagacttctg ttgatgaagg ggcaaaaatt gaccgaggta taagattcct ccatgatcag 4200
ataatgagtg tgaaaacagt ggatctcaca ctggtgattt atggatcgtt cagacattgg 4260
ggtcatcctt ttatagatta ttacactgga ctagaaaaat tacattccca agtaaccatg 4320
aagaaagata ttgatgtgtc atatgcaaaa gcacttgcaa gtgatttagc tcggattgtt 4380
ctatttcaac agttcaatga tcataaaaag tggttcgtga atggagactt gctccctcat 4440
gatcatccct ttaaaagtca tgttaaagaa aatacatggc ccacagctgc tcaagttcaa 4500
gattttggag ataaatggca tgaacttccg ctgattaaat gttttgaaat acccgactta 4560
ctagacccat cgataatata ctctgacaaa agtcattcaa tgaataggtc agaggtgttg 4620
aaacatgtcc gaatgaatcc gaacactcct atccctagta aaaaggtgtt gcagactatg 4680
ttggacacaa aggctaccaa ttggaaagaa tttcttaaag agattgatga gaagggctta 4740
gatgatgatg atctaattat tggtcttaaa ggaaaggaga gggaactgaa gttggcaggt 4800
agatttttct ccctaatgtc ttggaaattg cgagaatact ttgtaattac cgaatatttg 4860
ataaagactc atttcgtccc tatgtttaaa ggcctgacaa tggcggacga tctaactgca 4920
gtcattaaaa agatgttaga ttcctcatcc ggccaaggat tgaagtcata tgaggcaatt 4980
tgcatagcca atcacattga ttacgaaaaa tggaataacc accaaaggaa gttatcaaac 5040
ggcccagtgt tccgagttat gggccagttc ttaggttatc catccttaat cgagagaact 5100
catgaatttt ttgagaaaag tcttatatac tacaatggaa gaccagactt gatgcgtgtt 5160
cacaacaaca cactgatcaa ttcaacctcc caacgagttt gttggcaagg acaagagggt 5220
ggactggaag gtctacggca aaaaggatgg agtatcctca atctactggt tattcaaaga 5280
gaggctaaaa tcagaaacac tgctgtcaaa gtcttggcac aaggtgataa tcaagttatt 5340
tgcacacagt ataaaacgaa gaaatcgaga aacgttgtag aattacaggg tgctctcaat 5400
caaatggttt ctaataatga gaaaattatg actgcaatca aaatagggac agggaagtta 5460
ggacttttga taaatgacga tgagactatg caatctgcag attacttgaa ttatggaaaa 5520
ataccgattt tccgtggagt gattagaggg ttagagacca agagatggtc acgagtgact 5580
tgtgtcacca atgaccaaat acccacttgt gctaatataa tgagctcagt ttccacaaat 5640
gctctcaccg tagctcattt tgctgagaac ccaatcaatg ccatgataca gtacaattat 5700
tttgggacat ttgctagact cttgttgatg atgcatgatc ctgctcttcg tcaatcattg 5760
tatgaagttc aagataagat accgggcttg cacagttcta ctttcaaata cgccatgttg 5820
tatttggacc cttccattgg aggagtgtcg ggcatgtctt tgtccaggtt tttgattaga 5880
gccttcccag atcccgtaac agaaagtctc tcattctgga gattcatcca tgtacatgct 5940
cgaagtgagc atctgaagga gatgagtgca gtatttggaa accccgagat agccaagttt 6000
cgaataactc acatagacaa gctagtagaa gatccaacct ctctgaacat cgctatggga 6060
atgagtccag cgaacttgtt aaagactgag gttaaaaaat gcttaatcga atcaagacaa 6120
accatcagga accaggtgat taaggatgca accatatatt tgtatcatga agaggatcgg 6180
ctcagaagtt tcttatggtc aataaatcct ctgttcccta gatttttaag tgaattcaaa 6240
tcaggcactt ttttgggagt cgcagacggg ctcatcagtc tatttcaaaa ttctcgtact 6300
attcggaact cctttaagaa aaagtatcat agggaattgg atgatttgat tgtgaggagt 6360
gaggtatcct ctttgacaca tttagggaaa cttcatttga gaaggggatc atgtaaaatg 6420
tggacatgtt cagctactca tgctgacaca ttaagataca aatcctgggg ccgtacagtt 6480
attgggacaa ctgtacccca tccattagaa atgttgggtc cacaacatcg aaaagagact 6540
ccttgtgcac catgtaacac atcagggttc aattatgttt ctgtgcattg tccagacggg 6600
atccatgacg tctttagttc acggggacca ttgcctgctt atctagggtc taaaacatct 6660
gaatctacat ctattttgca gccttgggaa agggaaagca aagtcccact gattaaaaga 6720
gctacacgtc ttagagatgc tatctcttgg tttgttgaac ccgactctaa actagcaatg 6780
actatacttt ctaacatcca ctctttaaca ggcgaagaat ggaccaaaag gcagcatggg 6840
ttcaaaagaa cagggtctgc ccttcatagg ttttcgacat ctcggatgag ccatggtggg 6900
ttcgcatctc agagcactgc agcattgacc aggttgatgg caactacaga caccatgagg 6960
gatctgggag atcagaattt cgacttttta ttccaagcaa cgttgctcta tgctcaaatt 7020
accaccactg ttgcaagaga cggatggatc accagttgta cagatcatta tcatattgcc 7080
tgtaagtcct gtttgagacc catagaagag atcaccctgg actcaagtat ggactacacg 7140
cccccagatg tatcccatgt gctgaagaca tggaggaatg gggaaggttc gtggggacaa 7200
gagataaaac agatctatcc tttagaaggg aattggaaga atttagcacc tgctgagcaa 7260
tcctatcaag tcggcagatg tataggtttt ctatatggag acttggcgta tagaaaatct 7320
actcatgccg aggacagttc tctatttcct ctatctatac aaggtcgtat tagaggtcga 7380
ggtttcttaa aagggttgct agacggatta atgagagcaa gttgctgcca agtaatacac 7440
cggagaagtc tggctcattt gaagaggccg gccaacgcag tgtacggagg tttgatttac 7500
ttgattgata aattgagtgt atcacctcca ttcctttctc ttactagatc aggacctatt 7560
agagacgaat tagaaacgat tccccacaag atcccaacct cctatccgac aagcaaccgt 7620
gatatggggg tgattgtcag aaattacttc aaataccaat gccgtctaat tgaaaaggga 7680
aaatacagat cacattattc acaattatgg ttattctcag atgtcttatc catagacttc 7740
attggaccat tctctatttc caccaccctc ttgcaaatcc tatacaagcc atttttatct 7800
gggaaagata agaatgagtt gagagagctg gcaaatcttt cttcattgct aagatcagga 7860
gaggggtggg aagacataca tgtgaaattc ttcaccaagg acatattatt gtgtccagag 7920
gaaatcagac atgcttgcaa gttcgggatt gctaaggata ataataaaga catgagctat 7980
cccccttggg gaagggaatc cagagggaca attacaacaa tccctgttta ttatacgacc 8040
accccttacc caaagatgct agagatgcct ccaagaatcc aaaatcccct gctgtccgga 8100
atcaggttgg gccaattacc aactggcgct cattataaaa ttcggagtat attacatgga 8160
atgggaatcc attacaggga cttcttgagt tgtggagacg gctccggagg gatgactgct 8220
gcattactac gagaaaatgt gcatagcaga ggaatattca atagtctgtt agaattatca 8280
gggtcagtca tgcgaggcgc ctctcctgag ccccccagtg ccctagaaac tttaggagga 8340
gataaatcga gatgtgtaaa tggtgaaaca tgttgggaat atccatctga cttatgtgac 8400
ccaaggactt gggactattt cctccgactc aaagcaggct tggggcttca aattgattta 8460
attgtaatgg atatggaagt tcgggattct tctactagcc tgaaaattga gacgaatgtt 8520
agaaattatg tgcaccggat tttggatgag caaggagttt taatctacaa gacttatgga 8580
acatatattt gtgagagcga aaagaatgca gtaacaatcc ttggtcccat gttcaagacg 8640
gtcgacttag ttcaaacaga atttagtagt tctcaaacgt ctgaagtata tatggtatgt 8700
aaaggtttga agaaattaat cgatgaaccc aatcccgatt ggtcttccat caatgaatcc 8760
tggaaaaacc tgtacgcatt ccagtcatca gaacaggaat ttgccagagc aaagaaggtt 8820
agtacatact ttaccttgac aggtattccc tcccaattca ttcctgatcc ttttgtaaac 8880
attgagacta tgctacaaat attcggagta cccacgggtg tgtctcatgc ggctgcctta 8940
aaatcatctg atagacctgc agatttattg accattagcc ttttttatat ggcgattata 9000
tcgtattata acatcaatca tatcagagta ggaccgatac ctccgaaccc cccatcagat 9060
ggaattgcac aaaatgtggg gatcgctata actggtataa gcttttggct gagtttgatg 9120
gagaaagaca ttccactata tcaacagtgt ttggcagtta tccagcaatc atttccgatt 9180
aggtgggagg ctatttcagt aaaaggagga tacaagcaga agtggagtac tagaggtgat 9240
gggctcccaa aagatacccg aatttcagac tccttggccc caatcgggaa ctggatcaga 9300
tctttggaat tggtccgaaa ccaagttcgt ctaaatccat tcaataagat cttgttcaat 9360
cagctatgtc gtacagtgga taatcatttg aagtggtcaa atttgcgaaa aaacacagga 9420
atgattgaat ggatcaatgg gcgaatttca aaagaagacc ggtctatact gatgttgaag 9480
agtgacctac atgaggaaaa ctcttggaga gattaaaaaa tcaggaggag actccaaact 9540
ttaagtatga aaaaaacttt gatccttaag accctcttgt ggtttttatt tttttatctg 9600
gttttgtggt cttcgtgggt cggcatggca tctccacctc ctcgcggtcc gacctgggca 9660
tccgaaggag gacgtcgtcc actcggatgg ctaagggaga gctcggatcc ggctgctaac 9720
aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc 9780
cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga 9840
tcgagatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg tattctatag tgtcacctaa 9900
atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt attaattgta gccgcgttct aacgacaata 9960
tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct tactgaagca gaccctatca tctctctcgt 10020
aaactgccgt cagagtcggt ttggttggac gaaccttctg agtttctggt aacgccgtcc 10080
cgcacccgga aatggtcagc gaaccaatca gcagggtcat cgctagccag atcctctacg 10140
ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg 10200
ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg 10260
gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcacc 10320
attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca 10380
ggagtcgcat aagggagagc gtcgaatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg 10440
catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 10500
tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 10560
ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 10620
tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 10680
atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 10740
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 10800
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 10860
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 10920
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 10980
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 11040
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 11100
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 11160
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 11220
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 11280
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 11340
tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 11400
aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 11460
cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 11520
ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 11580
gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 11640
agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 11700
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 11760
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 11820
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 11880
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 11940
tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 12000
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 12060
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 12120
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 12180
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 12240
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 12300
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 12360
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 12420
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 12480
cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 12540
gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa 12600
tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcaggggg atctcgatcc 12660
cgcgaaatta atacgactca ctatagg 12687
<210> 8
<211> 1269
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atgtctgtta cagtcaagag aatcattgac aacacagtca tagttccaaa acttcctgca 60
aatgaggatc cagtggaata cccggcagat tacttcagaa aatcaaagga gattcctctt 120
tacatcaata ctacaaaaag tttgtcagat ctaagaggat atgtctacca aggcctcaaa 180
tccggaaatg tatcaatcat acatgtcaac agctacttgt atggagcatt aaaggacatc 240
cggggtaagt tggataaaga ttggtcaagt ttcggaataa acatcgggaa agcaggggat 300
acaatcggaa tatttgacct tgtatccttg aaagccctgg acggcgtact tccagatgga 360
gtatcggatg cttccagaac cagcgcagat gacaaatggt tgcctttgta tctacttggc 420
ttatacagag tgggcagaac acaaatgcct gaatacagaa aaaagctcat ggatgggctg 480
acaaatcaat gcaaaatgat caatgaacag tttgaacctc ttgtgccaga aggtcgtgac 540
atttttgatg tgtggggaaa tgacagtaat tacacaaaaa ttgtcgctgc agtggacatg 600
ttcttccaca tgttcaaaaa acatgaatgt gcctcgttca gatacggaac tattgtttcc 660
agattcaaag attgtgctgc attggcaaca tttggacacc tctgcaaaat aaccggaatg 720
tctacagaag atgtaacgac ctggatcttg aaccgagaag ttgcagatga aatggtccaa 780
atgatgcttc caggccaaga aattgacaag gccgattcat acatgcctta tttgatcgac 840
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gacattgagt atacatctct tactacagca ggtttgttgt acgcttatgc agtaggatcc 1020
tctgccgact tggcacaaca gttttgtgtt ggagataaca aatacactcc agatgatagt 1080
accggaggat tgacgactaa tgcaccgcca caaggcagag atgtggtcga atggctcgga 1140
tggtttgaag atcaaaacag aaaaccgact cctgatatga tgcagtatgc gaaaagagca 1200
gtcatgtcac tgcaaggcct aagagagaag acaattggca agtatgctaa gtcagaattt 1260
gacaaatga 1269
<210> 9
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atggataatc tcacaaaagt tcgtgagtat ctcaagtcct actctcgtct agatcaggcg 60
gtaggagaga tagatgagat cgaagcacaa cgagctgaaa agtccaatta tgagttgttc 120
caagaggacg gagtggaaga gcatactagg ccctcttatt ttcaggcagc agatgattct 180
gacacagaat ctgaaccaga aattgaagac aatcaaggct tgtatgtacc agatccggaa 240
gctgagcaag ttgaaggctt tatacagggg cctttagatg actatgcaga tgaggacgtg 300
gatgttgtat tcacttcgga ctggaaacag cctgagcttg aatccgacga gcatggaaag 360
accttacggt tgacattgcc agagggttta agtggagagc agaaatccca gtggcttttg 420
acgattaaag cagtcgttca aagtgccaaa cactggaatc tggcagagtg cacatttgaa 480
gcatcgggag aaggggtcat cataaaaaag cgccagataa ctccggatgt atataaggtc 540
actccagtga tgaacacaca tccgtaccaa tcagaagccg tatcagatgt ttggtctctc 600
tcaaagacat ccatgacttt ccaacccaag aaagcaagtc ttcagcctct caccatatcc 660
ttggatgaat tgttctcatc tagaggagaa ttcatctctg tcggaggtaa cggacgaatg 720
tctcataaag aggccatcct gctcggtctg aggtacaaaa agttgtacaa tcaggcgaga 780
gtcaaatatt ctctgtag 798
<210> 10
<211> 6330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atggaagtcc acgattttga gaccgacgag ttcaatgatt tcaatgaaga tgactatgcc 60
acaagagaat tcctgaatcc cgatgagcgc atgacgtact tgaatcatgc tgattacaat 120
ttgaattctc ctctaattag tgatgatatt gacaatttga tcaggaaatt caattctctt 180
ccgattccct cgatgtggga tagtaagaac tgggatggag ttcttgagat gttaacatca 240
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gaaataacat ttgacgtggt ggagaccttc atccgcggct ggggcaacaa accaattgaa 420
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tttttggact tacacaagtt gacattaatc ttaaatgctg tctctgaggt ggaattgctc 540
aacttggcga ggactttcaa aggcaaagtc agaagaagtt ctcatggaac gaacatatgc 600
aggattaggg ttcccagctt gggtcctact tttatttcag aaggatgggc ttacttcaag 660
aaacttgata ttctaatgga ccgaaacttt ctgttaatgg tcaaagatgt gattataggg 720
aggatgcaaa cggtgctatc catggtatgt agaatagaca acctgttctc agagcaagac 780
atcttctccc ttctaaatat ctacagaatt ggagataaaa ttgtggagag gcagggaaat 840
ttttcttatg acttgattaa aatggtggaa ccgatatgca acttgaagct gatgaaatta 900
gcaagagaat caaggccttt agtcccacaa ttccctcatt ttgaaaatca tatcaagact 960
tctgttgatg aaggggcaaa aattgaccga ggtataagat tcctccatga tcagataatg 1020
agtgtgaaaa cagtggatct cacactggtg atttatggat cgttcagaca ttggggtcat 1080
ccttttatag attattacac tggactagaa aaattacatt cccaagtaac catgaagaaa 1140
gatattgatg tgtcatatgc aaaagcactt gcaagtgatt tagctcggat tgttctattt 1200
caacagttca atgatcataa aaagtggttc gtgaatggag acttgctccc tcatgatcat 1260
ccctttaaaa gtcatgttaa agaaaataca tggcccacag ctgctcaagt tcaagatttt 1320
ggagataaat ggcatgaact tccgctgatt aaatgttttg aaatacccga cttactagac 1380
ccatcgataa tatactctga caaaagtcat tcaatgaata ggtcagaggt gttgaaacat 1440
gtccgaatga atccgaacac tcctatccct agtaaaaagg tgttgcagac tatgttggac 1500
acaaaggcta ccaattggaa agaatttctt aaagagattg atgagaaggg cttagatgat 1560
gatgatctaa ttattggtct taaaggaaag gagagggaac tgaagttggc aggtagattt 1620
ttctccctaa tgtcttggaa attgcgagaa tactttgtaa ttaccgaata tttgataaag 1680
actcatttcg tccctatgtt taaaggcctg acaatggcgg acgatctaac tgcagtcatt 1740
aaaaagatgt tagattcctc atccggccaa ggattgaagt catatgaggc aatttgcata 1800
gccaatcaca ttgattacga aaaatggaat aaccaccaaa ggaagttatc aaacggccca 1860
gtgttccgag ttatgggcca gttcttaggt tatccatcct taatcgagag aactcatgaa 1920
ttttttgaga aaagtcttat atactacaat ggaagaccag acttgatgcg tgttcacaac 1980
aacacactga tcaattcaac ctcccaacga gtttgttggc aaggacaaga gggtggactg 2040
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gagcatctga aggagatgag tgcagtattt ggaaaccccg agatagccaa gtttcgaata 2820
actcacatag acaagctagt agaagatcca acctctctga acatcgctat gggaatgagt 2880
ccagcgaact tgttaaagac tgaggttaaa aaatgcttaa tcgaatcaag acaaaccatc 2940
aggaaccagg tgattaagga tgcaaccata tatttgtatc atgaagagga tcggctcaga 3000
agtttcttat ggtcaataaa tcctctgttc cctagatttt taagtgaatt caaatcaggc 3060
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aactccttta agaaaaagta tcatagggaa ttggatgatt tgattgtgag gagtgaggta 3180
tcctctttga cacatttagg gaaacttcat ttgagaaggg gatcatgtaa aatgtggaca 3240
tgttcagcta ctcatgctga cacattaaga tacaaatcct ggggccgtac agttattggg 3300
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gacgtcttta gttcacgggg accattgcct gcttatctag ggtctaaaac atctgaatct 3480
acatctattt tgcagccttg ggaaagggaa agcaaagtcc cactgattaa aagagctaca 3540
cgtcttagag atgctatctc ttggtttgtt gaacccgact ctaaactagc aatgactata 3600
ctttctaaca tccactcttt aacaggcgaa gaatggacca aaaggcagca tgggttcaaa 3660
agaacagggt ctgcccttca taggttttcg acatctcgga tgagccatgg tgggttcgca 3720
tctcagagca ctgcagcatt gaccaggttg atggcaacta cagacaccat gagggatctg 3780
ggagatcaga atttcgactt tttattccaa gcaacgttgc tctatgctca aattaccacc 3840
actgttgcaa gagacggatg gatcaccagt tgtacagatc attatcatat tgcctgtaag 3900
tcctgtttga gacccataga agagatcacc ctggactcaa gtatggacta cacgccccca 3960
gatgtatccc atgtgctgaa gacatggagg aatggggaag gttcgtgggg acaagagata 4020
aaacagatct atcctttaga agggaattgg aagaatttag cacctgctga gcaatcctat 4080
caagtcggca gatgtatagg ttttctatat ggagacttgg cgtatagaaa atctactcat 4140
gccgaggaca gttctctatt tcctctatct atacaaggtc gtattagagg tcgaggtttc 4200
ttaaaagggt tgctagacgg attaatgaga gcaagttgct gccaagtaat acaccggaga 4260
agtctggctc atttgaagag gccggccaac gcagtgtacg gaggtttgat ttacttgatt 4320
gataaattga gtgtatcacc tccattcctt tctcttacta gatcaggacc tattagagac 4380
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ggggtgattg tcagaaatta cttcaaatac caatgccgtc taattgaaaa gggaaaatac 4500
agatcacatt attcacaatt atggttattc tcagatgtct tatccataga cttcattgga 4560
ccattctcta tttccaccac cctcttgcaa atcctataca agccattttt atctgggaaa 4620
gataagaatg agttgagaga gctggcaaat ctttcttcat tgctaagatc aggagagggg 4680
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<210> 11
<211> 690
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atgagttcct taaagaagat tctcggtctg aaggggaaag gtaagaaatc taagaaatta 60
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<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atgaagtgcc ttttgtactt agctttttta ttcatcgggg tgaattgcaa gttcaccata 60
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gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720
机译: 基于囊泡口炎病毒载体的复制型重组新型冠状病毒,及其制备方法及其应用
机译: 包含修饰的基质蛋白的减毒重组水疱性口炎病毒疫苗载体
机译: 包含修饰的基质蛋白的减毒重组水疱性口炎病毒疫苗载体