一种基于发光菌和球等鞭金藻的抗生素光解产物毒性评价方法

摘要

本发明公开了一种基于费氏弧菌和球等鞭金藻生长效应来评价抗生素光解产物毒性的方法，属于水产养殖领域。本发明根据UVC辐照光解去除水产养殖中抗生素残留，为保障抗生素光解后的安全性，避免对养殖生物造成危害，根据费氏弧菌和球等鞭金藻的生长特性，进行抗生素光解产物的毒性评价，为养殖过程水处理的安全性提供保障。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于发光菌和球等鞭金藻的抗生素光解产物毒性评价方法，属于抗生素光解产物安全性评价技术领域。

背景技术

抗生素在光解后会产生毒性较低的产物或被微生物降解，然而某些抗生素光解后可能会生成毒性更大的产物。同时，抗生素在光解过程中可能会生成·OH和

天然发光细菌在正常的生理条件下能够持续稳定发射可见荧光，这类菌对周围环境的变化相当敏感。费氏弧菌是一种革兰氏阴性、杆状、鞭毛状的非致病性细菌，广泛分布于亚热带和温带海洋环境。当水样中存在各种有毒有害的污染物时，会影响发光细菌的细胞代谢水平、荧光酶的活性等，从而影响其发光。因其灵敏度与标准的毒性评价试验有很好的一致性，并且具有广谱测毒的特点，在毒性试验中被广泛使用。

海洋微藻是海洋水生生态系统中的初级生产者，可以通过光合作用为水体中软体动物、甲壳动物和鱼类等水生生物提供氧气和食物，其种类的多样性及初级生产量直接影响整个水生系统的结构和功能。球等鞭金藻具有无细胞壁、体积小、繁殖快、营养丰富，以及易被贝类幼虫捕捉和消化吸收等特点，常被用作海洋经济双壳类动物幼虫优良的开口饵料。此外，球等鞭金藻细胞内富含多糖及多种重要的多不饱和脂肪酸，是类胡萝卜素等活性物质的潜在来源，也可作为化石燃料的生物替代品。同时，球等鞭金藻易于培养，是进行水生生态毒理学研究的理想模式生物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于发光菌和球等鞭金藻的抗生素光解产物毒性评价方法。

为实现这一目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于发光菌和球等鞭金藻抗生素光解产物毒性评价方法，利用UVC紫外线对养殖尾水进行光照处理，辐照光解去除水产养殖中抗生素残留，得到光解抗生素后的水样，为保障抗生素光解后的安全性，避免对养殖生物造成危害；再根据费氏弧菌和球等鞭金藻的特性，利用光解抗生素后的水样分别对费氏弧菌和球等鞭金藻进行培养，以费氏弧菌的发光抑制率以及球等鞭金藻的生物量、细胞内ROS含量、光合色素含量、脂质过氧化物含量和抗氧化酶活力为参数评价抗生素的光解产物的毒性，为养殖过程水处理的安全性提供保障。在UVC紫外线光降解抗生素的过程中，比较不同光照时间后的水样培养费氏弧菌和球等鞭金藻抗生素光解对费氏弧菌的发光抑制率的影响，以及对球等鞭金藻的生长、细胞内活性氧含量、光合作用、脂质过氧化和抗氧化酶的影响。

基于以上方案，优选的，UVC紫外线由UVC光源装置提供，所述的UVC光源装置为本领域的现有技术，包括UVC-LED(光电二极管)光源，所述的UVC-LED光源的功率为25W，波长为265nm，光照时间为5-30min(如5、10、20、30min)，光照强度0.75-6mw/cm

基于以上方案，优选的，所述的UVC-LED光源由多个UVC-LED灯珠组成，所述UVC-LED灯珠的数量为25颗。

基于以上方案，优选的，将发光菌加入到光解抗生素后的水样中，在黑暗条件下进行发光菌抑制率的测试。使用发光菌复苏液对发光菌冻干粉进行复苏，得到复苏后的发光菌液，再用稀释液(质量浓度2％NaCl溶液)稀释到实验适宜所需浓度。

基于以上方案，优选的，所述发光菌为费氏弧菌、明亮发光杆菌或青海弧菌。

基于以上方案，优选的，将球等鞭金藻接种于光解抗生素后的水样中，再添加f/2培养液，置于25-30℃光照培养箱中培养，培养周期48-96h，光照强度6500±500lx，光暗比12L:12D。

基于以上方案，优选的，所述f/2培养液的体积与光解抗生素后的水样体积比为1:1000。

本发明的优点及有益效果是：

本发明是通过特定的UVC-LED光源对抗生素进行辐照，根据发光菌和球等鞭金藻的特性，分析不同光照时间内，抗生素光解产物的毒性效应变化。进而阐述抗生素的光化学行为对生态环境的影响。

附图说明

图1为恩诺沙星(a)和氟苯尼考(b)对费氏弧菌发光抑制率的影响。

图2为恩诺沙星(a)和氟苯尼考(b)对球等鞭金藻生物量的影响。

图3为恩诺沙星(a)和氟苯尼考(b)对球等鞭金藻光合色素含量的影响。

图4为恩诺沙星(a)和氟苯尼考(b)对球等鞭金藻细胞内ROS的影响。

图5为恩诺沙星和氟苯尼考对球等鞭金藻SOD活力，CAT活力，MDA含量的影响；其中：a1-3分别表示恩诺沙星的SOD活力，CAT活力，MDA含量；b1-3分别表示氟苯尼考的SOD活力，CAT活力，MDA含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术步骤和优点更清晰，以下结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1

本发明根据发光菌和球等鞭金藻的特性，利用不同光照时间内，抗生素光解后水样进行培养，探究抗生素光解产物的毒性效应变化。

一种基于发光菌和球等鞭金藻生长效应来评价抗生素光解产物毒性的方法，包括如下步骤：

(1)模拟养殖废水(30g/L NaCl，13.01g/L MgCl

抗生素降解率％＝C

式中，C

(2)费氏弧菌(Vibrio fischeri)包括费氏弧菌冻干粉和费氏弧菌复苏液，购自浙江清华长三角研究院。根据说明书复苏费氏弧菌，发光抑制率于96孔板中进行。按取费氏弧菌复苏液1mL放入1支费氏弧菌冻干粉西林瓶中，复苏等待10min。取复苏后的发光菌液1mL，利用质量浓度为2％的NaCl溶液制备发光菌稀释液，稀释后体积为20mL，得到复苏菌液。于96孔板中含10mg/L的ENR和FLO的模拟养殖废水溶液，分别取光照时间为0(即模拟养殖废水)、5、10、20、30min时的光解后抗生素溶液180μL和复苏菌液20μL。实验设置阴性质控对照(200μL，2％NaCl溶液)，阳性质控对照(200μL，10mg/L ZnSO

(3)样品板放入酶标仪(带发光检测器)进行第一次测定计数。黑暗条件下，静置15min，放入酶标仪进行第二次测定计数。

利用如下公式进行发光菌抑制率的计算：

C

IR％＝((S

式中：C

(4)球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)藻种购自大连玉洋集团。利用f/2培养基培养球等鞭金藻，将球等鞭金藻接种于灭菌的150mL锥形瓶，接种密度为10

(5)细胞毒性检测

a.生长抑制测定：实验周期为96h，每天取出少量藻液使用紫外分光光度计于680nm处检测各处理组培养液的光密度，并以培养基作为参比确定藻液密度。

b.光合色素含量的测定：收集微藻细胞团，使用饱和碳酸镁配置的90％(体积浓度)丙酮溶液提取微藻细胞内叶绿素、类胡萝卜素。利用以下公式对光合色素的浓度进行计算。

Chlorophylla(C

Chlrorphyllb(C

Carotenoid(mg/L)＝(1000A

式中：Chlorophyll a(Ca)为球等鞭金藻叶绿素a浓度，mg/L；Chlorophyll b(Cb)为球等鞭金藻叶绿素b浓度，mg/L；Carotenoid为球等鞭金藻类胡萝卜素含量，mg/L；A665为波长为665nm处吸光值，A；A652为波长为652nm处吸光值，A；A470为波长为470nm处吸光值，A；

c.细胞内活性氧(ROS)测定：球等鞭金藻细胞内活性氧(ROS)的含量使用2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)测量，使用南京建成试剂盒。

d.脂质过氧化和抗氧化酶活性测定：使用南京建成试剂盒，利用酶标仪对球等鞭金藻细胞内超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，脂质过氧化物(MDA)进行检测。

以水产养殖中常用抗生素恩诺沙星和氟苯尼考光解后产物为研究对象，比较不同光照时间内，发光菌和球等鞭金藻的生长变化，评价两种抗生素在不同光照时长下光解产物毒性变化。综上，得出如下结论：

(1)如图1所示，恩诺沙星和氟苯尼考的光解中间产物对发光菌生长的毒性远高于母体化合物。恩诺沙星光解0min时对费氏弧菌的发光抑制率为46.11％，随着恩诺沙星光解时间的延长发光抑制率增加。光解5min时恩诺沙星的降解率是53.11％，其抑制率高达86.10％，与对照组相比具有显著增加(P＜0.01)。光解30min时恩诺沙星基本完全降解，而发光抑制率高于对照组32.26％。

氟苯尼考光解0min费氏弧菌的发光抑制率为51.02％，随着光照时间增加，各光解处理组的发光抑制率均显著高于0min，其中光解30min时氟苯尼考已经被完全降解，其抑制率高达92.42％。但是光解10min处理组相比于其他处理组，呈现下降趋势，抑制率为65.05％。

(2)如图2所示，恩诺沙星和氟苯尼考的光解中间产物对球等边金藻的生长发育产生不利影响。随着光照时间的增加，恩诺沙星和氟苯尼考光解中间产物均会对球等边金藻的生长产生抑制作用。对于恩诺沙星，暴露球等边金藻96h时光解0min组的生物量高于其他各组，光解10min处理组的生物量高于光解5min处理组的生物量，低于对照组生物量。光解20min处理组和光解30min处理组相互之间无显著差异。对于氟苯尼考，各处理组的生长量相比光解0min组有明显下降，光解5min开始生物量下降约17％，光解30min处理组的生物量比对照组的生物量低，下降约29％。

(3)如图3所示，恩诺沙星和氟苯尼考光解中间产物影响球等边金藻光合色素的合成。对于恩诺沙星，与对照组相比，各处理组中总叶绿素的含量和类胡萝卜素的含量无显著性差异。而氟苯尼考光解5-30min处理组和0min组相比总叶绿素的含量显著性降低15.23％、18.11％、14.81％和27.57％，类胡萝卜素的含量分别降低6.63％、13.81％、11.05％和20.44％。

(4)如图4所示，随着光照时间的增加，恩诺沙星、氟苯尼考光解的中间产物会促进球等鞭金藻细胞产生ROS。

(5)如图5所示，不同光照时间下，恩诺沙星光解产物显著促进球等边金藻的SOD活性；CAT活性在光解5min处理组时达到最大值，自光解5min后CAT活力先下降后出现上升趋势；MDA含量以光照时间依赖性方式增加，但仅对照组与光解30min处理组有极显著性差异(P＜0.01)。不同光照时间下，氟苯尼考光解产物显著促进球等边金藻的SOD、CAT活性，光解10min后呈现下降趋势。各处理组中MDA含量相比对照组均呈现增加趋势。

按照上述方式对评价抗生素光解产物的毒性风险，费氏弧菌和球等鞭金藻均可用于指示UVC-LED光解抗生素的毒性。

以上所述仅为本发明的实施方式，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进、扩展等，均包含在本发明的保护范围内。