一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及基于微流控芯片Digital PCR的检测方法

摘要

本发明属于检验检疫技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及基于微流控芯片Digital PCR的检测方法。所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1~2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述引物探针组合用于扩增非洲猪瘟病毒的B646L基因的保守序列，所述保守序列具体如SEQ ID NO.4所示。当利用该引物探针组合进行基于微流控芯片Digital PCR时，对非洲猪瘟病毒的最低检测限可以低至每微升模板30.1995 copies，且Digital PCR具有很好的重复性，其平均CV值为9.56%。

说明书

技术领域

本发明属于检验检疫技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及基于微流控芯片Digital PCR的检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染家猪或野猪引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病，其特征是病程短、高热和出血性病变，急性感染死亡率高达100％，严重威胁全球养猪业但目前尚未开发出有效的疫苗和治疗方法。ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，主要在巨噬细胞胞质中复制，其基因组约170-193kb，含有150-167个开放阅读框，编码150-200种蛋白质。目前已知功能的病毒编码蛋白约有50个，大部分为病毒的结构蛋白，仍有一半以上的ASFV编码蛋白功能尚不清楚。

目前，非洲猪瘟的诊断方法包括红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、ELISA、聚合酶链反应等。其中红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验的敏感性不高和特异性不强，动物接种试验不安全。实验室常规的ASFV诊断方法是病毒分离(VI)，尽管该方法可靠且敏感，但所需时间长达6天。聚合酶链反应(PCR)是一种替代VI的快速检测ASFV的方法，特别适用于筛选质量较差或降解的带有不可恢复病毒的样本。传统PCR检测非洲猪瘟病毒的方法具有特异、敏感、快速的特点，但有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点。第二代PCR技术，即荧光定量PCR(qPCR)检测技术，通过染料或者探针释放荧光，实时监控每一个PCR循环的荧光变化，最后生成扩增曲线，如果是染料法，最后还可以生成熔解曲线，分析产物的特异性。但其检测灵敏度不高，没法做绝对定量。第三代PCR技术，即数字PCR(Digital PCR)技术，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含零个或一个(至多数个拷贝)的目标分子，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与传统的qPCR技术相比，Digital PCR具有极高的灵敏度、特异性和精确性。因此，本发明的目的是建立一种基于微流控芯片Digital PCR平台的非洲猪瘟病毒的检测技术，以期为非洲猪瘟的防控提供有效的技术支持。

发明内容

本发明的技术目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合及基于微流控芯片Digital PCR的检测方法，从而准确定量出待检测血清中非洲猪瘟病毒拷贝数，该方法检测灵敏度高，检测过程简单，检测时间短。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组合，所述引物探针组合中引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述引物探针组合中探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述引物探针组合用于扩增非洲猪瘟病毒的B646L基因的保守序列，所述保守序列具体如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述探针的5′端修饰有发光的荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。

优选的，所述发光的荧光基团为FAM；所述荧光淬灭基团为MGB。

一种所述引物探针组合在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

利用所述引物探针组合检测非洲猪瘟病毒的方法，即，利用上述引物探针组合进行荧光定量PCR或基于微流控芯片Digital PCR，所述引物对的添加浓度为12.5pmol/L～100pmol/L；所述探针的添加浓度为1.25pmol/L～10pmol/L。

优选的，所述引物对的添加浓度为12.5pmol/L；所述探针的添加浓度为10pmol/L。

优选的，利用上述引物探针组合进行基于微流控芯片Digital PCR时，最低检测限为30～35copies。

本申请经过前期研究，针对非洲猪瘟病毒的B646L基因的保守序列进行引物和探针设计，并利用荧光定量PCR对该引物探针组合的最适添加浓度进行探索。结果显示，利用该引物探针组合进行荧光定量PCR时，对非洲猪瘟病毒的最低检测限为每微升模板1000copies；而当利用该引物探针组合进行基于微流控芯片Digital PCR时，对非洲猪瘟病毒的最低检测限可以低至每微升模板30.1995copies，且Digital PCR具有很好的重复性，其平均CV值为9.56％。本申请为非洲猪瘟病毒检测提供了一种灵敏度高、准确度高、具有高重复性的检测方法，有助于快速、高效的检测非洲猪瘟病毒，为防治和阻断病毒传播奠定基础。

附图说明

图1非洲猪瘟病毒系统进化树；

图2不同标准品浓度条件下的荧光定量PCR扩增曲线；

图3基于微流控芯片Digital PCR和荧光定量PCR标准曲线对比。(a)Digital PCR标准曲线，(b)荧光定量PCR标准曲线；

图4基于微流控芯片Digital PCR和荧光定量PCR检测限对比结果；(a)DigitalPCR的逻辑回归曲线，(b)荧光定量PCR的逻辑回归曲线，(c)Digital PCR扩增曲线，(d)荧光定量PCR扩增曲线；

图5基于微流控芯片Digital PCR和荧光定量PCR重复性对比结果；(a)两种检测方法CV值的对比曲线；(b)两种检测方法平均CV值对比。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细论述。

试剂与耗材

Nuclease-free water(Promega)、引物与探针(上海生工生物科技有限公司)、

本申请其他所用试剂和耗材为普通市售，或本领域技术人员通过公开通途可以获得的。

实施例1引物和探针的设计

根据之前的研究结果，p72是ASFV表达的重要结构蛋白，由ORF B646L基因编码，在非洲猪瘟病毒不同毒株之间具有高度的保守性，因此选取ASFV的B646L基因作为目的基因进行PCR扩增。

将53株不同的ASFV流行毒株的B646L序列进行比对分析，利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建ASFV的系统进化树(如图1所示)，进行系统发育分析，分支上的数字表示bootstrap value>50(1,000次重复)。从进化树中可以看出，中国流行的ASFV毒株与格鲁吉亚、德国和波兰流行毒株亲缘性较近。因此，我们选择53个与中国流行的安徽毒株遗传关系较近的ASFV基因序列(GenBank登录号见表1)，进行Blastn比对，得到了编码ASFV主要结构蛋白p72的B646L基因的高度保守区域序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：

ACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAAACACCCTTAGAGGGCGCCGTTTACACG

利用美国Applied Biosystems公司的PRIMER EXPRESS version 1.5软件针对高保守区域设计引物和探针，将这些引物和探针与ASFV各毒株的全基因序列进行比对，具体比对结果见表1；

表1.引物和TaqMan-MGB探针与53株ASFV流行株和5株其他病毒毒株序列比对

根据比对结果选出与各毒株序列错配最少的引物和探针序列作为后续荧光定量PCR和基于微流控芯片PCR反应的引物对和探针，引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，探针的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列见表2(上海生工生物科技有限公司合成)；

表2 TaqMan-MGB探针序列以及PCR引物序列

为了便于观测反应结果，TaqMan-MGB探针两端分别修饰了FAM荧光分子和MGB荧光淬灭剂分子。当PCR体系中有待扩增序列时，TaqMan-MGB探针会与待检测序列通过互补配对原则相结合，在PCR过程中被Taq酶水解从而使FAM荧光素与MGB荧光淬灭剂分子分离，放出荧光。

实施例2引物和探针浓度优化

为了获得引物和探针的最优添加浓度，利用传统荧光定量PCR对实施例1中引物和探针的使用浓度进行优化。

荧光定量PCR反应体系为10μL，各成分添加量为：

表3不同引物和探针浓度条件下的Ct值测定结果

从上表可以看出，引物浓度12.5pmol/L、探针浓度10pmol/L时，扩增结果的Ct值最低，因此选择该浓度配比(即上下游引物浓度均为12.5pmol/L，探针浓度为10pmol/L)为后续反应的使用浓度。

实施例3引物和探针在荧光定量PCR中的验证

将合成的非洲猪瘟病毒B646L基因(GeneBank Accession:MH766894.1)保守序列插入杆状病毒载体pFastBacI中构建成pFastBacI-P72重组质粒，并将其转化至DH5a感受态细胞中使其大量增殖，通过克隆化，测序得到序列正确的pFastBacI-p72质粒，测定浓度，将pFastBacI-P72作为标准质粒。用微量紫外分光光度计测定品pFastBacI-P72标准质粒浓度，然后计算出10

以上述不同浓度梯度的标准质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，反应体系为：

实施例4 Digital PCR与荧光定量PCR扩增效果对比

阴性对照法即多次检测阴性对照，以阴性对照的测试最大检测值的2倍作为检出限。稀释法即，将标准质粒进行10倍梯度稀释：取水45μL加入上述模板上清液5μL，混匀后取5μL至第2管45μL的水中，依次类推稀释，最终稀释浓度10

Digital PCR反应混合液的组分如下：Master Mix 10.0μL，上游引物1.8μL，下游引物1.8μL，探针TaqMan-MGB 0.5μL，Water 3.9μL，模板2μL，总体积20.0μL(以上体积均含有20％的微量移液器的枪头挂壁损失)。Digital PCR反应程序为：Digital PCR扩增程序为：第一步：96℃热启动，10分钟；第二步：60℃退火，2分钟；98℃，60秒；扩增39个循环；第三步：60℃反应，2分钟；10℃保温。

利用curve expert软件制作标准曲线(图3)；从图3可以看出，Digital PCR标准曲线的R

实施例5基于微流控芯片Digital PCR的最低检测限

利用检出限评估方法中检测范围的评估，将标准质粒进行10倍梯度稀释进行检测，通过线性回归统计处理，对回归方程进行线性检验、非线性logit模型，根据R

实验结果表明，通过逻辑回归分析，得到非线性逻辑回归方程为：

其中，R

由此可以得出，基于微流控芯片Digital PCR的最低检测限达到每个反应30.1995copies，见图4(a)。用相同的引物和探针进行实时荧光定量PCR(qPCR)扩增，通过逻辑回归分析得到qPCR非线性逻辑回归方程为：

由此可以得出，荧光定量PCR的最低检测限为每个反应1000copies。上述结果表明，荧光定量PCR的检测限是Digital PCR的检测限的33倍，基于微流控芯片Digital PCR具有更高的灵敏度。

实施例6重复性分析

检出限评估方法中检测方法的重复性评估10倍稀释的标准品，进行3次重复检测，通过计算检测结果的相对标准偏差(RSD)，评估检测方法的重复性。如图5，实验结果表明，Digital PCR具有很好的重复性，其平均CV值为9.56％,比荧光定量PCR的平均CV值(12.67％)低，他们之间的平均CV值差为26.99％。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

河南中泽生物工程有限公司

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