用于预防宠物先兆性流产的食品添加剂及白术内酯I的应用

摘要

本发明涉及宠物饲养管理技术领域，尤其涉及一种用于预防宠物先兆性流产的食品添加剂及白术内酯I的应用。本发明用于预防宠物先兆性流产的食品添加剂中含有白术内酯I。本发明经研究发现，白术内酯I可以有效地预防先兆性流产的发生，而且具有很高的安全性，本发明的食品添加剂可以与食物自由搭配，有效预防宠物的先兆性流产，有利于宠物安全度过孕期，产下健康的幼崽。

说明书

技术领域

本发明涉及宠物饲养管理技术领域，尤其涉及一种用于预防宠物先兆性流产的食品添加剂及白术内酯I的应用。

背景技术

随着宠物饲养数量的增加，宠物的妊娠期疾病及孕期保健受到越来越多的重视。保胎产品的研发对降低流产率和保障母体健康方面具有重要的临床应用价值，对宠物的繁育起到关键性作用。在该研究领域，国内外目前主要以激素疗法和抗生素疗法治疗，没有有效地预防方法，而激素和抗生素带来的副作用也不容小觑。

引起宠物流产的因素主要分为传染性因素和非传染性因素，其中，随着饲养环境的改善和免疫驱虫的日益普及，传染性因素引起的流产已得到有效控制，而因黄体功能不全造成的先兆流产或不孕则越来越常见。黄体功能不全以分泌期子宫内膜发育延迟、内膜发育与孕卵发育不同步为主要特征，临床主要表现为不孕或反复早期流产，其子宫内膜容受性的降低是主要原因。白术内酯I作为中药白术的有效成分之一，安全性高，可以促进孕酮分泌，进而促进子宫内膜的发育。将其作为一种食品添加剂使用，可以简单有效地预防宠物先兆性流产。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种用于预防宠物先兆性流产的食品添加剂。

本发明的第二发明目的在于提供白术内酯I的应用。

为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于预防宠物先兆性流产的食品添加剂，所述食品添加剂中含有白术内酯I。

可选的，所述食品添加剂中还含有黄芩苷。

可选的，所述食品添加剂中还含有钙源，所述钙源选自碳酸钙、氯化钙、磷酸钙乳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙中的至少一种。

可选的，所述食品添加剂中还含有稀释剂，所述稀释剂选自淀粉、糖粉、乳糖、甘露醇中的至少一种。

可选的，所述食品添加剂中白术内酯I的质量百分比含量为0.5～1.5％，优选0.8～1.2％。

可选的，所述食品添加剂中黄芩苷的质量百分比含量为0.1～1％，优选0.2～0.8％。

可选的，所述食品添加剂中钙源的质量百分比含量为1～5％。

可选的，所述黄芩苷采用以下方法制备得到：将黄芩投入8～12倍水中煮沸30分钟，合并两次煎液，用盐酸调节pH l～2，在80℃下保温30分钟，放置，过滤，收集沉淀，加95％乙醇洗2～3次，然后真空抽滤，滤液在50～60℃下减压蒸发浓缩至干抽滤，得黄芩苷提取物。

本发明还涉及白术内酯I在制备预防宠物先兆性流产的食品或药物中的应用。

可选的，所述宠物包括犬和家猫。

本发明至少具有以下有益的效果：

本发明经研究发现，白术内酯I可以有效地预防先兆性流产的发生，而且具有很高的安全性，本发明的食品添加剂可以与宠物的食物搭配，有效预防宠物的先兆性流产，有利于其健康的度过孕期，产下幼崽。

附图说明

图1为妊娠小鼠潜血阳性的照片；

图2为不同组别小鼠子宫胚胎形态；

图3为白术内酯I对妊娠小鼠体质量变化的影响；

图4为白术内酯I对妊娠小鼠血清孕酮含量变化的影响；

图5为白术内酯I对妊娠小鼠血清前列腺素2α含量变化的影响；

图6为猫卵巢颗粒细胞HE染色示意图；

图7为猫卵巢颗粒细胞吉木萨染色示意图；

图8为猫卵巢颗粒细胞的免疫荧光染色鉴定图；

图9为原代猫卵巢颗粒细胞的生长曲线；

图10为不同时间浓度白术内酯I处理后细胞活力的变化图；

图11为不同时间白术内酯I处理后猫卵巢颗粒细胞孕酮分泌量的变化图；

图12为白术内酯I处理后猫卵巢颗粒细胞变化图；

图13为高剂量组肝脏组织切片的显微镜观察结果；

图14为高剂量组脾脏组织切片的显微镜观察结果；

图15为高剂量组肾脏组织切片的显微镜观察结果；

图16为高剂量组卵巢织切片的显微镜观察结果；

图17为高剂量组子宫组织切片的显微镜观察结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提出一种用于预防宠物先兆性流产的食品添加剂，食品添加剂中含有白术内酯I。传统安胎中药成分复杂，受产地影响，有效成分差异大；且中药适口性差，在宠物上饲喂困难。白术为传统的“安胎圣药”，疗效确切。保胎方剂中白术炮制方法以土炒最佳，土炒白术保胎效果最好。本发明实施例经LC-MS检测生白术、麸炒白术、土炒白术，发现土炒白术中白术内酯I含量最高，本发明实施例经锐意研究发现，白术中的有效成分中白术内酯I对于先兆性流产的预防效果最佳，并且安全性良好，从而完成本发明。经证实白术内酯I作为预防宠物先兆性流产的食品添加剂安全有效，品质可控，且饲喂简单，方便推广应用。

卵泡是卵巢的基本功能单位，而颗粒细胞是附着在卵泡腔卵母细胞周围，构成卵泡的最大细胞群，是卵巢分泌甾体激素的主要功能细胞。颗粒细胞通过间隙链接和旁分泌因子影响卵泡及卵母细胞的生长、发育、成熟。胚胎发育早期，孕酮主要来源于黄体化颗粒细胞，因此颗粒细胞的活性对于妊娠早期具有非常重要的作用。本发明实验例发现白术内酯I有促进猫卵巢颗粒细胞增殖和孕酮分泌的作用。

可选的，食品添加剂中还含有黄芩苷。黄芩在传统保胎方剂中常与白术联用，本发明实施例通过添加黄芩中的有效成分黄芩苷，可进一步提高食品添加剂对于预防先兆性流产的疗效。

可选的，食品添加剂中还含有钙源，钙源选自碳酸钙、氯化钙、磷酸钙乳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙中的至少一种，添加钙源可帮助补充孕期对钙的需求。

可选的，食品添加剂中还含有稀释剂，稀释剂选自淀粉、糖粉、乳糖、甘露醇中的至少一种。

具体的，食品添加剂中白术内酯I的质量百分比含量为0.5～1.5％，优选0.8～1.2％。食品添加剂中黄芩苷的质量百分比含量为0.1～1％，优选0.2～0.8％。食品添加剂中钙源的质量百分比含量为1～5％。

本发明实施例的食品添加剂可由上述原料采用无菌分装的形式直接分装而成，使用时与宠物的食物混合。

本发明实施例的食品添加剂的推荐剂量为每公斤体重0.8～1.2g，优选1g。

具体的，白术内酯I采用市售产品，黄芩苷采用以下方法制备得到：

将黄芩投入8～12倍水中煮沸30分钟，合并两次煎液，用盐酸调节pH l～2，在80℃下保温30分钟，放置，过滤，收集沉淀，加95％乙醇洗2～3次，然后真空抽滤，滤液在50～60℃下减压蒸发浓缩至干抽滤，得黄芩苷提取物。

本发明实施例还涉及白术内酯I在制备预防宠物先兆性流产的食品或药物中的应用，宠物包括猫和狗。白术内酯I的推荐剂量为每公斤体重8～12mg，优选10mg。

急性毒性是新药安全性评价的重要指标。本发明实施例经研究试验证实白术内酯I按临床推荐剂量使用是安全的。亚慢性毒性评价是以连续30d灌服不同剂量白术内酯I后大鼠的反应和相应指标变化为依据的。本发明实施例经试验研究证实白术内酯I按临床推荐剂量使用不会对受试动物产生慢性毒性作用。靶动物安全性试验又称临床安全性试验，是评价药物对靶动物用药是否安全的重要依据。本发明实施例选择母猫作为靶动物试验对象。本发明实施例经试验研究证实表明，推荐剂量的白术内酯I临床使用比较安全。毒性试验结果表明，白术内酯I是安全的药物，按临床推荐剂量使用对宠物机体无毒副作用，用于预防宠物先兆流产安全可靠。

实施例1

一种食品添加剂，其中含有白术内酯1.2g，黄芩苷0.8g，乳糖98g。

制备方法：将上述原料称重、混合，无菌分装，得到食品添加剂粉剂。

实施例2

一种食品添加剂，其中含有白术内酯1.0g，黄芩苷0.5g，葡萄糖酸钙1g、乳糖97.5g。

制备方法：将上述原料称重、混合，无菌分装，得到食品添加剂粉剂。

实验例1

1、仪器和试剂：

试验药物：白术内酯I(AT-I)购自大连美仑生物科技有限公司，产品编号：MB6520，质量标准：≥98％，标准品，4℃密封保存备用。灌胃时可依据试验设计的灌胃剂量及体积，用纯净水配成悬浊液后使用。

BC-2800vet全自动血液细胞分析仪(北京曼程科技有限公司)；奥林帕斯(OLYMPUS)系列的全自动生化分析仪；D228-1电子计数秤，上海高致精密仪器有限公司产品；Synergy H4全功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；

小鼠ELISA试剂盒：小鼠PGF2αELISA试剂盒(批号MB-5673A)，小鼠PROG ELISA试剂盒(批号MB-3304A)，小鼠E2 ELISA试剂盒(批号MB-3302A)，江苏酶标生物科技有限公司。

2、试验动物：

健康昆明系小鼠(雌性70只，雄性35只)7周龄，雌鼠体质量18-22g，雄鼠体质量25-30g，由内蒙古大学动物实验中心提供，合格许可证号为SCXK(蒙)2016-0001号。试验前将小鼠雌雄分开，室温条件下常规饲养10d，自由采食与饮水，每周更换3次垫料，观察健康状况。

3、试验方法：

(1)先兆流产模型建立

选择性成熟小鼠夜间19：00后2：1合笼，次日凌晨7：00前观察小鼠受精情况，出现阴栓为妊娠第0天。在妊娠第7天，用米非司酮4.15mg/kg和米索前列醇50μg/kg灌胃，造先兆流产模型。雌鼠阴道中放入小团棉球，通过潜血检测，棉球中的BLD(隐血)呈现阳性即为造模成功，如图1所示。

(2)试验分组

将妊娠小鼠随机分为：正常妊娠组、AT-I低剂量组、AT-I中剂量组、AT-I高剂量组、黄体酮组、先兆流产模型组、联合作用组，每组10只，组间大鼠体质量无显著差异。

正常妊娠组(10只)：自妊娠第一日灌服生理盐水，剂量与给药组等量；

AT-I低剂量组(10只)：自妊娠第一日灌服AT-I，0.6mg/kg/d；第七日用米非司酮4.15mg/kg和米索前列醇50μg/kg灌胃；

AT-I中剂量组(10只)：自妊娠第一日灌服AT-I，1.2mg/kg/d。第七日用米非司酮4.15mg/kg和米索前列醇50μg/kg灌胃；

AT-I高剂量组(10只)：自妊娠第一日灌服AT-I，2.4mg/kg/d。第七日用米非司酮4.15mg/kg和米索前列醇50μg/kg灌胃；

黄体酮组(10只)：自妊娠第一日灌服黄体酮1mg/kg/d，第七日用米非司酮4.15mg/kg和米索前列醇50μg/kg灌胃；

先兆流产模型组(10只)：自妊娠第一日灌服生理盐水，剂量与给药组等量，第七日用米非司酮4.15mg/kg和米索前列醇50μg/kg灌胃；

联合作用组(10只)：自妊娠第一日灌服AT-I 1.2mg/kg/d+黄芩苷0.8mg/kg/d，第七日用米非司酮4.15mg/kg和米索前列醇50μg/kg灌胃。

4、样本采集与检测：

在妊娠第13天，对小鼠进行眼球采血，3 000r/min离心，取上层血清待测。断颈处死，收集小鼠子宫，计算胚胎数量及流产率。正常胚胎：宫内未见瘀血，胚胎串珠状；流产胚胎：形态不规则，宫内胚胎呈黑褐色。血清储存在-20℃冰箱，检测前回至室温，用ELISA试剂盒检测PGF2α、PROG含量。

5、数据处理

各项试验数据用“平均值±标准差”表示，各组数据间差异显著性比较应用SPSS20.0进行统计分析。采用t检验及单因素ANOVA分析比较组间差异，P<0.05有统计学意义。文中柱状图用统计学软件GraphPad Prism 7.04统计程序进行单因子方差(One-wayANOVA)分析和Tukey's Multiple Comparison test统计分析。

6、试验结果

6.1AT-I对小鼠保胎率的影响

子宫内胚胎典型形态见图2，对妊娠小鼠体质量变化的影响如图3所示，正常妊娠组小鼠体质量变化极显著高于先兆流产组和低剂量组(P<0.01)，其他各剂量组体质量变化均显著低于正常妊娠组(P<0.05)。联合作用组、高剂量组和中剂量组与黄体酮组差异不显著(P>0.05)。

白术内酯I对小鼠活胎率的影响如表1所示，先兆流产模型组平均活胎率为3.82％，显著低于其他各组(P<0.01)，联合作用组、AT-I高剂量组平均活胎率提高至14.5％和13.7％，与黄体酮组平均活胎率15.27％相比，差异不显著(P>0.05)。可知联合作用组效果与黄体酮组相当，且比单独使用白术内酯I效果更好，经济效益更佳，符合传统方剂配伍。

表1

注：同列数据肩标标注相同表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同则表示差异显著。

6.2AT-I对小鼠血清PGF2α、PROG的影响

白术内酯I对妊娠小鼠血清孕酮含量变化的影响如图4结果显示，正常妊娠组PROG含量与中药低剂量组、先兆流产模型组比较，差异极显著(P<0.01)；中药高剂量组和中剂量组孕酮的含量与黄体酮组比较，差异不显著(P>0.05)，证明中高剂量的AT-I可以促进孕酮的分泌，起到与黄体酮处理相仿的效果。

白术内酯I对妊娠小鼠血清前列腺素2α含量变化的影响如图5所示，先兆流产模型组PGF2α的含量与其他各组相比较具有显著差异(P<0.05)，而药物处理组PGF2α的含量与黄体酮组和正常妊娠组相比没有显著差异(P>0.05)，说明AT-I有一定的抗炎效果。

通过对先兆流产模型昆明系小鼠的实验结果进行分析对比，说明白术内酯I对米非司酮和米索前列醇造模的先兆流产昆明系小鼠有保胎作用，与黄芩苷联用后效果更佳，并且对小鼠正常妊娠无不良影响。

实验例2细胞试验研究

1、猫卵巢颗粒细胞原代培养

选用健康母猫绝育术取下的卵巢(含3％青链霉素生理盐水浸泡)37℃保温杯运输，采集后3小时内送到实验室，用含3％青链霉素生理盐水洗净后，在超净台内剪去系膜及脂肪组织，用5mL注射器抽提1-3mL卵泡卵泡液，并在捡卵镜下采集卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes COCs)，反复用含3％青链霉素、12％胎牛血清培养基洗净，吹打，使用含1％青链霉素、12％胎牛血清的DMEM/F12 medium(Gibco)培养基于37℃、5％CO

2、卵巢颗粒细胞HE染色和吉木萨染色鉴定

当猫卵巢颗粒细胞传代培养至第3代，用0.25％胰酶消化细胞，细胞爬片培养24h。用DPBS冲洗盖玻片3次，每次5min。4％多聚甲醛固定细胞爬片20min。取出爬片，DPBS冲洗爬片，苏木素染色2min，流水洗去未结合的染液，然后浸入盐酸酒精中脱去细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料，流水冲洗5min，镜下细胞核被苏木素染成蓝色，胞浆不着色。再5％伊红染色3min，流水冲洗，洗去未结合的染液。梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。光镜下观察细胞形态。

实验结果：HE染色如图6所示和吉木萨染色如图7所示，镜下可见细胞形态完整，边缘清晰，呈三角锥形或不规则星形。

3、猫卵巢颗粒细胞免疫荧光鉴定

当猫卵巢颗粒细胞传代培养至第3代，用0.25％胰酶消化，12孔板中细胞爬片培养24h。弃去培养基，每孔加入3mL 0.01mol/L DPBS(Thermo HyClone)在室温脱色摇床上进行洗涤，洗涤过程中可用自己制作的钩针不断勾起爬片上下震荡洗涤，时间为10min/次，共3次。4％多聚甲醛固定细胞30min，室温脱色摇床上洗涤。每孔加入1mL现配的0.4％TritonX-100(PH＝7.40)，室温避光处理20min。室温脱色摇床上洗涤10min/次，3次。用含有0.1％Triton X-100(Sigma)的3％normal donkey serum(D9663，Sigma)封闭液室温脱色摇床上避光充分封闭1h，洗涤10min/次，3次。一抗AntiFSHR(FSH Receptor)antibody(1：200，bioss)4℃过夜孵育，洗涤后，二抗Alx647(donkey-antirabbit)(1：1 000，Jackson)室温避光孵育2h。DAPI染核10min，脱色摇床上洗涤10min/次，4次。待爬片自然风干后，转移至载玻片上，激光共聚焦直接进行观察。

实验结果：猫卵巢颗粒细胞的免疫荧光染色如图8所示，左图为阳性组：表达FSH受体的猫卵巢颗粒细胞；右图为阴性对照组：未表达FSH受体的猫卵巢颗粒细胞。FSHR免疫荧光化学染色是卵巢颗粒细胞的特异性染色，FSHR阳性染色存在于细胞质，呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。镜下可见FSHR与对照组相比阳性率大于90％。因此，可以表明体外培养的猫卵巢颗粒细胞纯度达到90％以上。(标尺：100μm)

4、猫卵巢颗粒细胞生长曲线的CCK-8检测

取第3代猫卵巢颗粒细胞，用DPBS清洗细胞，加1mL胰蛋白酶消化3min，加培养基(含12％血清)停止消化，然后反复吹打，保证细胞离壁。消化后调整细胞悬液浓度为5x10

原代猫卵巢颗粒细胞的生长曲线如图9所示。

5、不同浓度白术内酯I在不同作用时间对猫卵巢颗粒细胞的细胞毒性检测

如上述操作净化完细胞后，加再含添加不同浓度(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、320μmol/L)的白术内酯I的培养液100μL，37℃分别孵育12h、24h、36h、48h后，加CCK-8作用4h后用酶标仪450nm波长处测量各孔的吸光值(OD值)。

不同时间浓度白术内酯I处理后细胞活力的变化如图10所示，根据CCK-8结果可知，白术内酯I在一定浓度范围内对猫卵巢颗粒细胞有增殖作用，高浓度对细胞有抑制作用。在10μmol/L浓度时作用36h时细胞存活率最高，抑制率最低。因此，白术内酯I对猫卵巢颗粒细胞的最佳作用时间为36小时，最佳作用浓度为10μmol/L，以此浓度进行后续试验。

6、不同处理时间白术内酯I对黄体化颗粒细胞分泌孕酮的影响

采用双抗体夹心ELISA法，颜色的深浅和样品中的待测孕酮呈正相关。在颗粒细胞添加10μmol/l浓度的白术内酯I，37℃分别孵育(0h、12h、24h、48h、72h)，收集上清液进行检测。

不同时间白术内酯I处理后猫卵巢颗粒细胞孕酮分泌量的变化如图11，可知随处理时间增加，白术内酯I可有效促进孕酮分泌，在处理24h时，孕酮分泌增加量极显著。

白术内酯I处理后镜下观察细胞形态，实验结果如图12所示(标尺：100μm)。如图12可见猫卵巢颗粒细胞体积增大，脂褐素含量增加，分泌能力显著提升。

实验例2毒性试验研究

1、仪器和试剂：

BC-2800vet全自动血液细胞分析仪(北京曼程科技有限公司)；奥林帕斯(OLYMPUS)系列的全自动生化分析仪；奥林帕斯(OLYMPUS)光学显微镜；SC-04型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；VetScan HM5五分类血细胞计数仪；lnc.BS-180vet血液生化分析仪(美国Abaxis)；湖南湘仪离心机仪器有限公司。天门冬氨酸氨基转移酶(AST，批号：140216017)、丙氨酸氨基转移酶(ALT，批号：140116022)、谷氨酰转移酶(r-GGT，批号：140916015)、碱性磷酸酶(ALP，批号：140316003)、总胆固醇(TC，批号：141616018)、葡萄糖(GLU，批号：141516018)、白蛋白(ALB，批号：140916013)、总蛋白(TP，批号：140816010)、尿素(UREA，批号：141316019)肌酐(CREA，批号:141016003)试剂片盒均购自内蒙古精壹试剂耗材有限公司。灌胃针、一次性采血针及配套真空采血管购自内蒙古呼和浩特市达音商贸有限公司。

健康昆明系雌性小鼠(约6周龄，体质量18～22g)80只及健康雌性Wistar大鼠(约7周龄，体质量110～130g)24只由内蒙古大学动物实验中心提供，合格许可证号为SCXK(蒙)2016-0001号。试验前室温条件下常规饲养10d，自由采食与饮水，每周更换3次垫料，观察健康状况。

健康成年雌性家猫20只，约2～3岁，已免疫驱虫。

2、试验方法

(1)急性毒性试验

取健康雌性昆明小鼠60只，随机平均分为5组，1～4组为试验组，第5组为对照组，各组小鼠禁食8h后灌胃给药，给药4h后复食，试验组按组间剂量比为1:0.8一次灌胃给药，第1～5组的给药剂量分别为6000、4800、3840、和3072mg/kg，对照组灌服等体积的纯净水，各组小鼠药液灌胃体积为每20g体质量0.4mL。小鼠给药后常规饲养7d，每日观察精神、食欲、饮水及其活动情况，记录中毒症状、死亡时间和数目，并对死亡动物及时剖检、记录眼观病理变化，按改良寇式法计算LD50。如小鼠未出现死亡，且无法继续给药(测不出LD50)，需进行最大耐受量试验。

(2)最大耐受量试验

取雌性小鼠20只，分为试验组与对照组，每组10只，禁食8h(不禁水)。试验组小鼠于12h内分3次灌服0.2g/mL药液，每次灌胃体积为每20g体质量0.8mL(最大灌胃体积)；对照组小鼠灌服等体积的纯净水。灌胃后小鼠常规饲养7d，每日观察小鼠精神、食欲、饮水及其活动情况，记录小鼠的中毒症状、死亡时间及数目，并计算最大耐受量及耐受倍数，之后颈椎脱臼处死小鼠并剖检，观察2组小鼠的肝、脾、肾、卵巢、子宫等器官有无肉眼可见的病理变化。小鼠的最大耐受倍数＝(小鼠耐受药量/小鼠平均体质量)×(家猫平均体质量/家猫每日用药量)，其中家猫平均体质量为3kg，家猫每天用药量为30mg。

(3)亚慢性毒性试验

取雌性大鼠24只，随机平均分为对照组及白术内酯I高、中、低剂量组，灌胃剂量分别为6000、3000、1500mg/kg，每天1次，对照组每日定时灌服等体积纯净水。各组连续灌胃30d(每7d称一次体质量调整灌胃体积)，整个试验期间，每天早晚观察并记录动物的行为情况、外观体征、有无中毒反应以及死亡情况等。给药期结束后各组大鼠心脏采血，检测血常规和血液生化指标。

体质量的测定：于灌药前及给药第7、14、21、28、30d测定大鼠体质量。

血常规及血液生化指标的测定：采用全自动血液细胞分析仪测定血液的主要生理指标，包括血红蛋白(HGB)含量、红细胞数目(RBC)、白细胞数目(WBC)及各类白细胞(淋巴细胞(Lym)、单核细胞(Mon)、中性粒细胞(Neu)、嗜酸性粒细胞(Eo)、嗜碱性粒细胞(Ba))占白细胞总数的比例。生化指标的测定：分离血清后采用自动血液生化指标分析仪测定血液生化指标，包括天冬氨酸氨基转化酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酰转移酶(r-GGT)、碱性磷酸酶(ALP)活性及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA-J)、尿素(UREA)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)含量。

病理变化观察及脏器系数的测定：4组大鼠采血后立即剖检，观察肝、脾、胃、肾、肺等器官的眼观病理变化，并对每组大白鼠的肝、脾、肾、卵巢、子宫器官称质量后用10％福尔马林固定，经不同梯度酒精脱水、浸蜡包埋后切片，HE染色后在光学显微镜下观察各器官组织病理学变化，计算肝、脾、肾、卵巢、子宫等器官的脏器系数(脏器系数＝脏器湿质量/体质量×100％)。

(4)临床安全性试验

选取健康雌性家猫20只，观察饲养7天，随机分为4组，每组5只。家猫给药剂量为拟推荐给药剂量的1倍、2倍、4倍，分别为：低剂量组10mg/kg，中剂量组20mg/kg，高剂量组40mg/kg，每日口服给药1次，连续7天，空白对照组不给药。所有家猫自由采食和饮水；每日观察食欲、精神状态及排便情况。血常规及血液生化指标的测定：用药结束后即试验第7天同时间点对所有家猫静脉采血，采用EDTA-K2抗凝管收集全血，用全自动血液分析仪进行分析，检测指标包括血红蛋白(HGB)，红细胞计数(RBC)，白细胞计数(WBC)及粒细胞(GRA)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MON)分类计数等。血液生化检测：用药结束后即试验第7天对每只家猫进行静脉采血，并收集于未添加抗凝剂的采血管中，3000r/min离心15min，取出血清，采用全自动生化分析仪进行血液生化指标检测。检测指标包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、血清白蛋白(ALB)、总蛋(TP)、总胆固醇(TCH)和甘油三酯(TG)等。

3、数据处理

各项试验数据用“平均值±标准差”表示，各组数据间差异显著性比较应用SPSS20.0进行统计分析。

4、试验结果

4.1急性毒性试验

经口1次灌服给药后，各组小鼠由于灌胃应激，呆立2～3min后，精神状态逐步恢复正常，活动自如，皮毛光滑，排粪，排尿正常且无异常分泌物，无不良反应。连续观察7d，各组小鼠精神、食欲、饮水、活动程度均无异常，经大体剖检和病理检查，主要脏器无异常变化。急性毒性试验的主要测定指标为半数致死量(LD50)的测定，如有动物死亡需要测出LD50；但是有些药物毒性低，如果在给药总剂量大于5000mg/kg时动物死亡数量仍为零，则停止更多次的给予，并测定该药物的最大耐受量。

由本试验可知，由于受给药体积和药物浓度的限制，难以测出LD50，故进行小鼠的最大耐受量试验。

4.2最大耐受量试验

小鼠于12h内分3次经最大体积连续灌服后，试验组累计药量达到24g/kg，两组小鼠均在灌胃后由于灌胃应激出现蜷缩呆立，活动减少的现象，10分钟后活动和饮食情况恢复正常。经7d观察未见死亡和异常状况，剖检后各器官未出现眼观病理变化。经计算，小鼠的最大耐受药量为0.48g/只。灌服白术内酯I小鼠的最大耐受倍数＝0.48/20×3000/0.03＝2400，表明按体质量计算小鼠1d最大耐受量是家猫临床推荐剂量的2400倍，而此剂量下小鼠未出现异常变化，说明白术内酯I按临床推荐剂量使用是安全的。

4.3亚慢性毒性试验

(1)一般状况观察及体质量的测定

试验期间4个处理组大鼠均在前3d有灌胃应激，15分钟后恢复正常状态；整个灌胃期间大鼠精神状态、活动程度和饮食情况均无异常变化，排粪尿正常，无异常分泌物，由表1可知，3个白术内酯I剂量组大鼠体质量与对照组相比差异不显著(P>0.05)，说明白术内酯I对大鼠生长发育无明显影响。

表1不同剂量白术内酯I对大鼠体质量的影响(g)

(2)血常规及血液生化指标检查

由表2、表3可知，各组大鼠血常规和血液生化指标均无显著差异(P>0.05)，说明白术内酯I经口灌服过程中，对大鼠血常规、肝功、肾功无明显影响。

表2不同剂量白术内酯I对大鼠血常规的影响

表3不同剂量白术内酯I对大鼠血液生化指标的影响

(2)病理剖检变化及脏器系数的测定

剖检后对大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃肠和肾脏、子宫、卵巢进行观察，除心脏由于采血受到损伤出血外，其他组织脏器表面和切面没有发现异常。由表4可知，4个处理组大鼠各脏器系数均无显著差异(P>0.05)，表明白术内酯I对大鼠各组织器官未产生实质性损害。

表4不同剂量白术内酯I对大鼠脏器系数的影响(％)

(3)组织病理学的变化

各组织经光学显微镜下观察显示：肝小叶由以中央静脉为中心放射排列的肝板组成且肝细胞完整，肝小叶间的界限可以分清但不明显，小叶内及汇管区未见坏死和炎性细胞浸润，胆管未见异常；脾脏实质没有异常变化，白髓、红髓及小梁、淋巴小结和静脉窦结构清晰可见，未见明显异常变化；肾脏组织形态结构完整，肾单位清晰可见，肾小球及肾小管未见异常变化，肾小囊腔内未见炎性渗出物和细胞浸润，近曲、远曲小管及集合管结构完整，未见异常变化；子宫组织完整，子宫内膜及内膜腺未见异常变化，子宫肌层未见坏死，血管层内未见充血等异常变化；卵巢皮质、髓质形态完整，卵母细胞的细胞核、细胞质、放射冠及颗粒细胞清晰可见，未见异常变化，说明本试验中药对大鼠的主要脏器和靶器官无毒性作用。高剂量组各器官组织切片的显微观察结果如图13-图17所示。

4.4临床安全性试验

(1)一般观察结果

试验期间各组家猫的饮食饮水情况均正常，且药物处理组食量增加，被毛光亮柔顺，行为活动正常，未出现异常兴奋或精神沉郁的情况，排便次数形态正常，未出现急性消瘦、中毒、死亡等情况。

(2)血常规及血液生化指标检查

由表5、表6可知，处理第7天，各组家猫血常规和血液生化指标均无显著差异(P>0.05)，说明白术内酯I经口灌服过程中，对家猫血常规、肝功、肾功无明显影响。

表5白术内酯I对家猫血液学指标的影响

表6白术内酯I对家猫血液生化指标的影响

注：同列数据肩标无“*”标注表示差异不显著(P>0.05)，肩标带“*”则表示差异显著。

本实验例中，急性毒性试验因受药液浓度及灌胃体积的影响，无法计算出该药物的LD50。根据中国新兽药研发规范与申报指南，对无法测出LD50的药物需分析其最大给药量，一般检测动物单次或一天内2～3次服用最大剂量药物后的反应。小鼠经3次最大剂量药液灌服后的累积剂量达到24g/kg，并且2组小鼠1周内未见异常变化，剖检后各脏器均无眼观病理变化。按体质量计算小鼠1d最大耐受量是家猫每天临床推荐剂量的2400倍，而此剂量下小鼠未出现异常变化，说明白术内酯I按临床推荐剂量使用是安全的。

亚慢性毒性评价是以连续30d灌服不同剂量白术内酯I后大鼠的反应和相应指标变化为依据的。试验结果显示，三个剂量组大鼠的体质量、血常规、血液生化指标及脏器系数与对照组相比差异不显著(P>0.05)，各脏器除了由于心脏采血导致部分心肌纤维坏死和间质血管出血外，并无其他异常变化。表明该药物按临床推荐剂量使用不会对受试动物产生慢性毒性作用。

本发明实施例选择母猫作为靶动物试验对象。采用靶动物推荐剂量1倍、2倍、4倍设计三个剂量组和一个对照组，观察到不同剂量组家猫采食量正常，精神状态、被毛光泽度、粪便情况均正常，血液学指标和血液生化指标与对照组比较差异均不显著(P>0.05)。由于各组动物均未出现中毒症状和死亡情况，根据动物福利未对实验猫进行剖检和病理组织学检查。试验表明，推荐剂量的白术内酯I临床使用比较安全。

毒性试验结果表明，白术内酯I是安全的药物，按临床推荐剂量使用对家猫机体无毒副作用，用于预防家猫先兆流产安全可靠。

本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。