用于心肌病的AAV心脏基因治疗

摘要

本发明涉及可用于治疗心脏病症的组合物和方法。所公开的组合物和方法基于包含用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的重组AAV载体的AAV治疗，其中所述转基因包含S100家族蛋白和凋亡抑制因子。在一些方面中，对一种或更多种心脏病症的多个来源进行的靶向可在治疗期间提供协同益处。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年6月8日提交的美国临时申请No.62/682,772和于2019年3月21日提交的美国临时申请No.62/822,015的申请日的权益，其各自的全部内容通过引用并入。

背景技术

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是狗中心脏病的第二最常见原因，并且继发体征的医学管理是唯一的治疗选择。患病狗的预后取决于疾病的阶段和品种。杜宾犬(Doberman pinscher)一旦发生充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)就表现出特别迅速且一致的进展，大多数存活少于6个月。扩张型心肌病(DCM)是人心肌病的最常见类型，主要发生在20至60岁的成年人中。其影响心脏的心室和心房(分别为心脏的下腔和上腔)。DCM的大多数形式是来自多种原因的获得性形式，其包括使心肌发炎的冠心病、心脏病发作、高血压、糖尿病、甲状腺疾病、病毒性肝炎和病毒性感染。酒精滥用和某些药物(例如可卡因和安非他明)以及至少两种用于治疗癌症的药物(多柔比星和柔红霉素)也可导致DCM。另外，DCM有多种遗传形式，包括但不限于与迪谢内肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy)和贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy)相关的DCM。在贝克肌营养不良的某些形式的情况下，以及在迪谢内肌营养不良的大多数情况下，心肌病最终可限制患者的存活。

发明概述

心肌病是对象中心脏病的第二最常见原因，并且继发体征的医学管理是唯一的治疗选择。患病对象的预后取决于疾病的阶段和品种。心脏功能严重依赖于钙依赖性信号传导。在心脏病期间，心脏细胞内钙通道的功能失常促进钙循环异常，进一步抑制心脏功能。已显示降低钙循环异常的基因转移策略在小型和大型动物模型中以及在人临床试验中改善心脏病。

在人中，扩张型心肌病是心肌病的最常见类型，并且可来源于多种获得性以及遗传性病症。如在狗和其他动物模型中一样，虽然疾病起因的根源在于钙处理功能障碍，但疾病的最终进展是由线粒体功能障碍和/或牵张诱导的心肌细胞凋亡所驱动的。尽管在早期疾病阶段仅仅解决钙处理问题就可以是有效的，但解决钙处理、线粒体功能障碍和凋亡的组合对于治疗DCM的所有形式以及在疾病进展的所有阶段都是必要的。

本文中公开了用于治疗患有心肌病和充血性心力衰竭的对象的基因递送方法。这些方法包括：表达S100A1以解决钙处理，以及表达ARC(胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(Apoptosis Repressor with Caspase Recruitment Domain))以阻断所有凋亡来源并使线粒体功能正常化。通过所公开的自互补AAV载体方法表达S100A1和ARC转基因是迅速的(即，在数小时内)，这对抵消终末期心力衰竭的影响是至关重要的并且限于心脏。因此，这些方法解决了DCM发作和进展的所有三个驱动因素，并且因此应适用于在疾病进展的任何阶段的任何DCM形式。

本公开内容的一些方面提供了用于将转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体。在一些实施方案中，这样的rAAV载体包含至少两个转基因，一个编码S100家族蛋白，并且一个编码凋亡抑制因子(apoptotic inhibitor)。这样的rAAV载体可从5’至3’依次包含：第一腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)序列、可操作地连接至转基因的启动子和第二AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，两个转基因可操作地连接至同一个单启动子。在另一些实施方案中，每个转基因可操作地连接至单独的启动子。在一些实施方案中，rAAV载体还包含至少一个多腺苷酸化信号(例如，在从单启动子表达的两个转基因的3’，或在从不同启动子表达的一个或两个转基因的3’)。本公开内容的一些方面提供了用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，其中所述载体从5’至3’依次包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、两个或更多个转基因和可操作地连接至所述两个或更多个转基因的启动子、多腺苷酸化信号以及第二AAV反向末端重复(ITR)序列，其中所述两个或更多个转基因包含S100家族蛋白和凋亡抑制因子。

本公开内容的转基因可以是S100家族蛋白和凋亡抑制因子。例如，S100家族蛋白是心脏S100钙结合蛋白A1(cS100A1)或其变体。在另一个实例中，凋亡抑制因子是心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cardiac Apoptosis Repressor with Caspase RecruitmentDomain，cARC)或其变体。

在一些实施方案中，本公开内容的一个或更多个转基因是天然存在的序列。在一些实施方案中，一个或更多个转基因被改造为物种特异性的。在一些实施方案中，对一个或更多个转基因进行密码子优化用于在目的物种(例如，犬)中表达。在某些实施方案中，一个或更多个转基因(例如cARC转基因)是经密码子优化的。

在一些实施方案中，在两个或更多个转基因之间(例如，在cS100A1转基因和cARC转基因之间)存在内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)。在一些实施方案中，编码S100家族蛋白的转基因在编码凋亡抑制因子的转基因的5’。在另一些实施方案中，编码凋亡抑制因子的转基因在编码S100家族蛋白的转基因的5’。

在一些实施方案中，启动子是心脏限制性启动子。心脏限制性启动子可以是来自以下基因之一的启动子：α-肌球蛋白重链基因、6-肌球蛋白重链基因、肌球蛋白轻链2v基因、肌球蛋白轻链2a基因、CARP基因、心脏α-肌动蛋白基因、心脏m2毒蕈碱型乙酰胆碱基因(muscarinic acetylcholine gene)、ANF、心脏肌钙蛋白C、心脏肌钙蛋白I、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、心脏肌质网Ca-ATP酶基因、骨骼α-肌动蛋白；或来源于MLC-2v基因的人工心脏启动子(artificial cardiac promoter)。在一些实施方案中，心脏限制性启动子是cTnT启动子。

本文中还提供了rAAV颗粒，其包含被衣壳化(encapsidated)在AAV衣壳中的本文中所公开的rAAV载体。在一些实施方案中，AAV衣壳包含来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV衣壳包含来源于AAVrh.10血清型的衣壳蛋白。

本发明的另一些方面包括包含本文中所述的rAAV颗粒的组合物。可将这样的组合物施用于对象用于对心脏病进行基因治疗。在一些实施方案中，心脏病在对象中引起心力衰竭。在一些实施方案中，心脏病是心肌病。在另一些实施方案中，心脏病是肥厚型心肌病或扩张型心肌病。在另一些实施方案中，心脏病是急性缺血。

本发明的组合物可通过不同途径施用于对象。在一些实施方案中，组合物通过注射到对象的心脏中来施用。在一些实施方案中，组合物的施用导致转基因在对象的心脏中表达。

在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是伴侣动物。例如，伴侣动物可以是狗、猫、马、猪、牛、绵羊、兔或其他宠物。

本发明的每个要素都可涵盖本发明的多个实施方案。因此，预期，本发明涉及任一个要素或要素的组合的每种限制都可包含在本发明的各个方面中。本发明的应用不限于在以下描述中阐述的或如附图中举例说明的组分之构造和布置的细节。本发明可以有其他实施方案，并且能够以多种方式实践或实施。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分并且为了进一步示出本发明的某些方面而包括在内。通过结合附图参考以下描述可更好地理解本公开内容，其中相同的附图标记表示相同的要素：

图1描绘了示例性AAV构建体的图。在第一AAV反向末端重复(ITR)之后是心脏肌钙蛋白T启动子(cTnT)，然后是物种特异性S100钙结合蛋白A1(cS100A1)的经密码子优化序列，随后是内部核糖体进入位点(IRES)，随后是物种特异性胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cARC)的经密码子优化序列，随后是多腺苷酸化(PA)序列，以及第二AAV ITR。

图2描绘了来自经处理的肌营养不良狗在基线和基因递送之后数周的舒张期MRI成像。数据支持了稳定或略微改善的心脏重构，伴有舒张期左心室容积轻度降低。

图3描绘了来自经处理的肌营养不良狗在基线和基因递送之后数周的收缩期MRI成像。数据支持了在处理之后稳定或略微改善的左心室收缩功能，伴有收缩期容积轻度降低，表明收缩性改善和左心室心输出量提高。

图4示出了在AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后D2.mdx小鼠的射血分数、峰值应变和心输出量。与假注射小鼠相比，在24周的时间内，注射了治疗性AAV的小鼠具有更好的维持射血分数、应变发展和心输出量。

图5示出了在用重组AAVrh.10-S100A1/ARC载体处理的小鼠和对照小鼠中S100A1和ARC的表达水平。蛋白质分析(Western印迹)证实了与对照(假注射)相比，在经处理组织中S100A1和ARC水平二者均升高。

图6示出了在10×和20×放大率下对照和经处理小鼠的心肌细胞。心脏组织学数据表明，与对照心脏相比，经处理小鼠表现出较低的DMD病理学。

图7显示在重组AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后，(两只中的)第一只抗肌萎缩蛋白缺陷型狗(GRMD狗)Calvin显示出改善的心脏功能。两只经注射的狗在处理之后均表现出射血分数和其他心脏参数的改善，其通过心脏MRI测量并通过echo数据确认。

图8示出了第二只GRMD狗Sebastian在AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后显示出改善的心脏功能的数据。

图9A至9C显示AAV-S100A1/ARC处理在GRMD狗Sebastian和Calvin中降低了血清肌酸激酶(creatine kinease，CK)水平并预防了肌肉萎缩。通过双腿的面积(图9A)、最大横截面积(cross-sectional area，CSA)(图9B)和双腿的体积(图9C)测量的肢体肌肉质量的MRI测量结果。结果表明，心脏处理之后骨骼肌质量提高或保持不变。

图10显示GRMD对象在注射AAVrh.10-S100A1/ARC之后骨骼肌中循环肌酸激酶水平(CK)的水平降低，表明正在进行的肌肉损伤降低。

发明详述

本发明涉及用于在对象中对心脏病(例如心肌病)进行心脏基因治疗的组合物和方法。本发明的方法涉及使用重组AAV(rAAV)颗粒来同步递送和表达两个转基因。本发明的转基因包含至少两类蛋白质，其各自具有解决心脏病的不同方面的特定功能。一类转基因在心肌细胞中调节钙信号传导，例如S100家族蛋白。另一类转基因包含凋亡抑制因子。在一些实施方案中，转基因可以是心脏S100钙结合蛋白A1(cS100A1)或其变体，以及心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cARC)或其变体。

本发明的组合物和方法至少部分基于两个转基因(例如S100A1和ARC)在其在对象的心脏中同步递送和表达时的协同作用。S100A1蛋白改善了钙处理的一些方面，包括使肌质网钙瞬变正常化，从而导致收缩功能正常化。ARC蛋白阻断由线粒体机制引发的凋亡和由非线粒体机制引发的凋亡(例如牵张诱导的凋亡)，并改善线粒体功能。换言之，S100A1和ARC通过协同益处解决了心力衰竭的两个单独要素(钙处理功能障碍和凋亡)，从而导致更好的长期治疗结局。此外，本发明的组合物和方法在心力衰竭的任何疾病阶段均有效。

本文中还提供了制备适用于将转基因例如S100A1和ARC或其变体递送到对象的心脏中的rAAV颗粒的方法。这样的rAAV颗粒可包含重组AAV基因组，其包含编码转基因的核酸分子，其中所述核酸分子被AAV衣壳蛋白衣壳化。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体。重组AAV基因组是单链DNA，其还可包含促进AAV基因组整合到宿主基因组中和转基因表达的序列元件。例如，重组AAV基因组可包含组织特异性启动子以确保转基因在靶组织或器官中的表达。这样的rAAV颗粒可用于治疗心脏病症的组合物中。

因此，本公开内容还提供了用于将转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，所公开的rAAV载体包含至少两个转基因，一个编码S100家族蛋白，并且一个编码凋亡抑制因子。这些rAAV载体可从5’至3’依次包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、可操作地连接至转基因的启动子和第二AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，两个转基因可操作地连接至同一个单启动子。在另一些实施方案中，每个转基因可操作地连接至单独的启动子。在一些实施方案中，rAAV载体还包含至少一个多腺苷酸化信号(例如，在从单启动子表达的两个转基因的3’，或在从不同启动子表达的一个或两个转基因的3’)。

本公开内容还提供了用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，其中所述载体从5’至3’依次包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、两个或更多个转基因和可操作地连接至所述两个或更多个转基因的启动子、多腺苷酸化信号以及第二AAV反向末端重复(ITR)序列，其中所述两个或更多个转基因包含S100家族蛋白和凋亡抑制因子。

本文中使用的“转基因”是指已经天然地或通过众多基因工程技术中的任一种从一个生物体转移到另一个生物体的基因或遗传材料。转基因可以是目的蛋白或多肽(例如，S100A1、ARC)或目的RNA(例如，siRNA或微RNA)。在一些实施方案中，一个rAAV载体可包含一个或更多个转基因的编码序列。例如，一个rAAV载体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个转基因的编码序列。在一些实施方案中，本公开内容的rAAV载体包含S100A1和ARC或其变体二者的编码序列。在一些实施方案中，rAAV载体还包含编码Rep蛋白的区域。本公开内容的转基因包含两类蛋白质，其各自具有解决一种或更多种心脏病症的不同方面的特定功能。一类转基因可在心肌细胞中调节钙信号传导，例如S100家族蛋白。另一类转基因可包含凋亡抑制因子。

本文中使用的术语“变体”是指具有偏离天然存在的核酸的特征的核酸，例如，“变体”与野生型核酸具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。例如，转基因变体是与其野生型序列相比包含转基因的一个或更多个核苷酸替换的核酸。这些替换可以是沉默的，即它们不修饰任何编码蛋白质的氨基酸序列(或以其他方式产生变体氨基酸序列)。或者，这些替换可导致编码蛋白质的氨基酸序列的修饰，从而导致编码蛋白质相对于野生型蛋白质序列具有一个或更多个氨基酸替换(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10至15、或15至20个氨基酸替换)。这些替换包括化学修饰以及截短。在一些实施方案中，具有一个或更多个氨基酸替换的蛋白质保留野生型蛋白质功能，或保留与野生型蛋白质功能基本上相同的功能(例如，功能的至少25％、至少50％、至少75％，例如50％至75％、或75％至100％)。该术语还包括野生型核酸序列的功能性片段。

在一些实施方案中，一个或更多个所公开的转基因是天然存在的序列。在一些实施方案中，一个或更多个转基因被改造为物种特异性的。在一些实施方案中，对一个或更多个转基因进行密码子优化用于在目的物种(例如，犬)中表达。在某些实施方案中，cARC转基因是经密码子优化的。

可根据本公开内容使用的S100家族蛋白包括但不限于S100A1、S100A2、S100A3、S100A4、S 100A5、S 100A6、S 100A7(例如，牛皮癣素(psoriasin))、S 100A8(例如，钙粒蛋白A)、S1 00A9(例如，钙粒蛋白B)、S100A10、S100A11、S100A12(例如，钙粒蛋白C)、S100A13、S100A14、S100A15(例如，koebnerisin)、S100A16、S100B、S100P和S100Z，或其变体。

在一些实施方案中，S100家族蛋白可以是S100钙结合蛋白A1(S100A1)。在一些实施方案中，S100A1是心脏S100A1(cS100A1)或其变体。cS100A1蛋白是心肌收缩性的调节因子。在肺动脉高压模型中，cS100A1蛋白水平在右心室肥大组织中降低。此外，S100A1是心脏肥大潜在的遗传程序的调节因子，因为S100A1抑制肥大基因(包括MYH7、ACTA1和S100B)的α1肾上腺素能刺激。在心肌细胞中，S100A1通过调节RyR2、SERCA2、肌联蛋白(titin)和线粒体F1-ATP酶活性来调节钙控制的SR网络、肌节和线粒体功能。作为结果，具有提高的S100A1表达的心肌细胞和心脏显示出提高的收缩和舒张性能，这是由于增强的SR Ca

在一些实施方案中，S100A1 cDNA(转基因)序列与天然存在的S100A1序列具有100％同一性。在另一些实施方案中，S100A1 cDNA序列与天然存在的S100A1序列具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。

在一些实施方案中，S100A1 cDNA序列被改造为物种特异性的。在一些具体的实施方案中，对S100A1 cDNA序列进行密码子优化用于在目的物种中表达。S100A1 cDNA序列的一些非限制性实例在下面列出。

(NCBI参考序列：XM_005622816.2)

(NCBI参考序列：XM_003999773.3)

本申请的一些方面提供了组合物和方法，其包括递送编码凋亡抑制因子(例如抗凋亡剂)的转基因。凋亡抑制因子的一些举例说明性实例包括fink、p35、crmA、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、来自腺病毒的E1B-19K、以及促凋亡剂的拮抗剂(例如反义物、核酶、抗体等)。在一些实施方案中，凋亡抑制因子是胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(ARC)。在另一些实施方案中，凋亡抑制因子是心脏ARC或其变体。在一些实施方案中，可期望分别递送S100家族蛋白和凋亡抑制因子。在某些实施方案中，将编码S100家族蛋白的转基因与一种或更多种小分子凋亡抑制因子同步或相继递送。一些示例性小分子凋亡抑制因子包括c-Myc抑制剂、Bax抑制剂、p53抑制剂、tBid抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂和促凋亡BCL-2家族成员的抑制剂。在一些实施方案中，凋亡抑制因子可以是心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cARC)。

cARC是几乎仅在肌源性细胞(myogenic cell)中表达的一种凋亡调节蛋白。其包含胱天蛋白酶募集域(caspase recruitment domain，CARD)，其通过胱天蛋白酶募集域来阻断一些引发剂胱天蛋白酶的激活。ARC还阻断与凋亡相关的胱天蛋白酶非依赖性事件。由急性缺血和随后的心室重构引起的凋亡被认为是心力衰竭的介质。尽管缺血后心力衰竭可具有多种原因，但最近的注意力已转向理解凋亡或程序性细胞死亡的作用。凋亡的特征在于：线粒体和肌膜下膜保持，核染色质浓缩以及不会触发炎症反应的巨噬细胞或邻近细胞吞噬。已知凋亡的激活是通过涉及胱天蛋白酶的机制发生的，胱天蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的一个家族，其作为无活性的前体合成并通过蛋白水解切割成其活性形式。ARC能够通过阻断胱天蛋白酶来阻断凋亡的激活。

在一些实施方案中，cARC cDNA(转基因)序列与天然存在的cARC序列相同。在另一些实施方案中，cARC cDNA序列与天然存在的cARC序列具有至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、至少约99.5％同一性或至少约99.9％同一性。

在一些实施方案中，cARC cDNA序列被改造为物种特异性的。在一些具体的实施方案中，对cARC cDNA序列进行密码子优化用于在目的物种中表达。在一些具体的实施方案中，对cARC cDNA序列进行密码子优化用于在犬细胞中表达。

编码S100家族蛋白(例如cS100A1)的转基因在所述rAAV核酸载体中可位于编码凋亡抑制因子(例如cARC)的转基因的5’。或者，编码凋亡抑制因子的转基因在所述rAAV核酸载体中可位于编码S100家族蛋白的转基因的5’。

cARC cDNA序列的一些非限制性实例在下面列出。

(NCBI参考序列：NM_001048121.1)

(NCBI参考序列：XM_006941587.2)

重组AAV(rAAV)载体

本发明的一些方面涉及可用于心脏病的基因治疗的重组AAV载体。本文中使用的术语“载体”可指核酸载体(例如，质粒或重组病毒基因组)、野生型AAV基因组或包含病毒基因组的病毒。

野生型AAV基因组是正义或负义的单链脱氧核糖核酸(single-strandeddeoxyribonucleic acid，ssDNA)。基因组包含两个反向末端重复(ITR)(DNA链的每个末端各有一个)以及在ITR之间的两个开放阅读框(open reading frame，ORF)：rep和cap。repORF包含编码AAV生活周期所需的Rep蛋白的四个重叠基因。cap ORF包含编码衣壳蛋白的重叠基因，所述衣壳蛋白为：VP1、VP2和VP3，它们一起相互作用来形成病毒衣壳。VP1、VP2和VP3是由一种mRNA转录物翻译的，该mRNA转录物可以以两种不同的方式剪接。可切除较长或较短的内含子，导致形成两种mRNA同种型：约2.3kb-和约2.6kb-长的mRNA同种型。衣壳形成约60个单独衣壳蛋白亚基的超分子组装体，形成能够保护AAV基因组的无包膜T-1二十面体晶格。成熟的AAV衣壳由VP1、VP2和VP3(分子量分别为约87、73和62kDa)以约1∶1∶10的比例构成。

重组AAV(rAAV)颗粒可包含重组核酸载体(以下称为“rAAV载体”)，其可至少包含：(a)含有编码转基因的序列的一个或更多个异源核酸区域；和(b)含有促进异源核酸区域(任选地与含有促进表达的序列的一个或更多个核酸区域)整合到对象的基因组中的序列的一个或更多个区域。在一些实施方案中，促进异源核酸区域(任选地与含有促进表达的序列的一个或更多个核酸区域)整合到对象的基因组中的序列是在一个或更多个核酸区域(例如，异源核酸区域)侧翼的反向末端重复(ITR)序列(例如，野生型ITR序列或经改造的ITR序列)。ITR序列可来源于任何AAV血清型(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或可来源于多于一种血清型。在一些实施方案中，ITR序列来源于AAV2或AAV6血清型。在一些实施方案中，本文中提供的第一血清型不是AAV2或AAV8血清型。在一些实施方案中，第一血清型的ITR序列来源于AAV3、AAV5或AAV6。在一些实施方案中，ITR序列来源于AAV2、AAV3、AAV5或AAV6。在一些实施方案中，ITR序列与衣壳具有相同的血清型(例如，AAV6 ITR序列和AAV6衣壳，等)。在一些实施方案中，ITR序列来源于AAVrh.10血清型。

ITR序列和包含ITR序列的质粒是本领域已知的并且可商购获得(参见，例如，可从以下获得的产品和服务：Vector Biolabs，Philadelphia，PA；Cellbiolabs，San Diego，CA；Agilent Technologies，Santa Clara，Ca；和Addgene，Cambridge，MA；以及Gene deliveryto skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of atherapeutic protein.Kessler PD，Podsakoff GM，Chen X，McQuiston SA，Colosi PC，Matelis LA，Kurtzman GJ，Byrne BJ.Proc Natl Acad Sci U S A.1996 Nov 26；93(24)：14082-7；和Curtis A.Machida.Methods in Molecular Medicine

在一些实施方案中，本发明的rAAV载体包含cS100A1转基因和ARC转基因二者，用于将其在对象中同步递送和表达。因此，在一些实施方案中，rAAV载体包含含有促进转基因(例如异源核酸)表达的序列的一个或更多个区域，例如可操作地连接至核酸的表达控制序列。许多这样的序列是本领域已知的。表达控制序列的一些非限制性实例包括启动子、绝缘子、沉默子、响应元件、内含子、增强子、起始位点、内部核糖体进入位点(IRES)终止信号和poly(A)信号。本文中考虑了这样的控制序列的任意组合(例如，启动子和poly(A)信号)。在一些实施方案中，rAAV载体包含可操作地连接至转基因的编码序列并且促进该转基因表达的启动子。

本文中使用的“启动子”是指核酸的控制区域，在该区域处，核酸序列的其余部分的转录的起始和速率被控制。启动子驱动其调节的核酸序列的转录，因此，其通常位于基因转录起始位点处或附近。启动子可具有例如100至1000个核苷酸的长度。在一些实施方案中，启动子可操作地连接至核酸或核酸序列(核苷酸序列)。当启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和取向以使得启动子调节该序列(例如以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达)时，认为该启动子是“可操作地连接”至该序列。

可根据本发明使用的启动子可包含可驱动转基因在对象的心脏中表达的任何启动子。在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。本文中使用的“组织特异性启动子”是指仅可在特定组织类型例如心脏中发挥作用的启动子。因此，“组织特异性启动子”不能够驱动转基因在其他组织类型中表达。在一些实施方案中，可根据本发明使用的启动子是心脏限制性启动子。例如，启动子可以是但不限于来自以下基因之一的启动子：α-肌球蛋白重链基因、6-肌球蛋白重链基因、肌球蛋白轻链2v基因、肌球蛋白轻链2a基因、CARP基因、心脏α-肌动蛋白基因、心脏m2毒蕈碱型乙酰胆碱基因、ANF、心脏肌钙蛋白C、心脏肌钙蛋白I、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、心脏肌质网Ca-ATP酶基因、骨骼α-肌动蛋白；或来源于MLC-2v基因的人工心脏启动子。

在所公开的rAAV载体的一些实施方案中，两个或更多个转基因由单启动子可操作地控制。在另一些实施方案中，两个或更多个转基因各自由独特的启动子可操作地控制。

在一些实施方案中，本发明的rAAV载体还包含内部核糖体进入位点(IRES)。IRES是允许在信使RNA(messenger RNA，mRNA)序列的中间进行翻译起始而作为蛋白质合成的更大过程的一部分的核苷酸序列。通常，在真核生物中，由于起始复合物的组装需要5’帽识别，翻译只能在mRNA分子的5’端起始。在一些实施方案中，IRES位于转基因之间。在一些这样的实施方案中，由不同转基因编码的蛋白质被单独翻译(即，相对于作为融合蛋白翻译)。

在一些实施方案中，本公开内容的rAAV载体还包含多腺苷酸化(pA)信号。真核mRNA通常被转录为前体mRNA。对前体mRNA进行加工以产生成熟mRNA，包括多腺苷酸化过程。多腺苷酸化过程在基因转录终止时开始。首先通过一组蛋白质将新生成的前体mRNA的最3’片段切割掉。然后这些蛋白质在RNA的3’端合成poly(A)尾。切割位点通常包含多腺苷酸化信号，例如AAUAAA。poly(A)尾对mRNA的核输出、翻译和稳定性是重要的。

在一些实施方案中，本发明的rAAV载体至少包含：从5’至3’依次是第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、可操作地连接至第一转基因的启动子、可操作地连接至第二转基因的IRES、多腺苷酸化信号和第二AAV反向末端重复(ITR)序列。

在一些实施方案中，rAAV是环形的。在一些实施方案中，rAAV载体是线性的。在一些实施方案中，rAAV载体是单链的。在一些实施方案中，rAAV载体是双链的。在一些实施方案中，rAAV载体是自互补rAAV载体。本文中所述的任何rAAV载体可被例如AAV6衣壳或任何其他血清型(例如，与ITR序列具有相同血清型的血清型)的病毒衣壳衣壳化。

重组AAV(rAAV)颗粒

本文中还提供了rAAV颗粒或包含这样的颗粒的rAAV制剂。rAAV颗粒包含本文中所述的病毒衣壳和rAAV载体，所述载体被病毒衣壳衣壳化。产生rAAV颗粒的方法是本领域已知的并且可商购获得(参见，例如，Zolotukhin et al.Production and purification ofserotype 1，2，and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158-167；以及美国专利申请公布号US 2007/0015238和US 2012/0322861，其通过引用并入本文；以及质粒和试剂盒可从ATCC和Cell Biolabs，Inc.获得)。例如，包含rAAV载体的质粒可与一种或更多种辅助质粒例如包含rep基因(例如，编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因(编码VP1、VP2和VP3，包括本文中所述的经修饰VP3区)的辅助质粒组合，并转染到生产细胞系中，使得rAAV颗粒可被包装并随后纯化。

本文中公开的rAAV颗粒或在rAAV制剂中的颗粒可以是任何AAV血清型，包括任何衍生物或假型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、2/1、2/5、2/8、2/9、3/1、3/5、3/8或3/9)。如本文中所用，rAAV和rAAV颗粒的血清型是指重组病毒的衣壳蛋白的血清型。在一些实施方案中，rAAV颗粒是rAAV6或rAAV9。衍生物和假型的一些非限制性实例包括AAVrh.10、rAAV2/1、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9、AAV2-AAV3杂合体、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV克隆32/83、AAVShH10、AAV2(Y-＞F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41和AAVr3.45。这样的AAV血清型和衍生物/假型，以及产生这样的衍生物/假型的方法是本领域已知的(参见，例如，Mol Ther.2012Apr；20(4)：699-708.doi：10.1038/mt.2011.287.Epub 2012 Jan 24.The AAV vectortoolkit：poised at the clinical crossroads.Asokan A1，Schaffer DV，SamulskiRJ.)。在一些实施方案中，rAAV颗粒是假型化rAAV颗粒，其包含：(a)含有来自一种血清型(例如，AAV2、AAV3)的ITR的rAAV载体，和(b)由来源于另一种血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10)的衣壳蛋白构成的衣壳。用于产生和使用假型化rAAV载体的方法是本领域已知的(参见，例如，Duan et al.，J.Virol.，75：7662-7671，2001；Halbert et al.，J.Virol.，74：1524-1532，2000；Zolotukhin et al.，Methods，28：158-167，2002；和Auricchio et al.，Hum.Molec.Genet.，10：3075-3081，2001)。

用于心脏病的rAAV基因治疗

本发明还涉及包含一种或更多种所公开的rAAV颗粒或制剂的组合物。在一些实施方案中，rAAV制剂包含rAAV颗粒，其包含：含有第一血清型(例如，AAV3、AAV5、AAV6或AAV9)的ITR的rAAV载体和使rAAV载体衣壳化的衣壳蛋白。在一些实施方案中，衣壳蛋白具有第一血清型(例如，AAV3、AAV5、AAV6或AAV9)。在一些实施方案中，制剂与使用包含AAV2 ITR的rAAV载体制备的制剂相比具有至少四倍高的转导效率(例如，在人肝细胞癌细胞系、例如Huh7中)。

如本文中所述，这样的组合物还可包含药用赋形剂、缓冲剂或稀释剂，并且可被配制用于离体施用于宿主细胞或在动物且特别是人中原位施用。这样的组合物还可任选地包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米粒，或者可以以其他方式配制成用于施用于有此需要的对象的细胞、组织、器官或机体。这样的组合物可配制成用于多种治疗中，例如如用于改善、预防和/或治疗病症，例如肽缺乏、多肽缺乏、肽过表达、多肽过表达，包括例如导致如本文中所述的疾病或障碍的状况。

本公开内容的rAAV载体、rAAV颗粒或包含rAAV颗粒的组合物可用于在有此需要的对象中对心脏病进行基因治疗。可使用本发明的方法和组合物治疗的心脏病的一些实例包括但不限于心肌病和急性缺血。在一些实施方案中，心脏心肌病是肥厚型心肌病或扩张型心肌病。由心肌病或其他心脏病引起的心力衰竭包括两个要素：钙处理功能障碍和凋亡。rAAV载体、颗粒和包含rAAV颗粒的组合物当施用于有此需要的对象(例如通过直接注射至心脏)时可用于治疗这样的心力衰竭。rAAV载体、颗粒和包含rAAV颗粒的组合物驱动cS100A1蛋白和ARC蛋白在对象的心肌细胞中同步表达。S100A1将改善钙处理的一些方面，包括使肌质网钙瞬变正常化，从而导致收缩功能正常化。ARC将阻断由线粒体机制引发的凋亡和由非线粒体机制引发的凋亡(例如牵张诱导的凋亡)，以及改善线粒体功能。因此，由本公开内容的转基因表达的两种蛋白质的协同益处可通过靶向心肌病的两个方面来导致更好的长期治疗结局。

因此，本发明的另一些方面涉及向有此需要的对象施用本发明的rAAV颗粒。在一些实施方案中，施用于对象的rAAV颗粒的数量可为以下数量级：约10

如果期望的话，rAAV颗粒和rAAV载体也可与其他药剂(例如蛋白质或多肽或多种药物活性剂)组合施用，包括治疗性多肽、生物活性片段、或其变体的一次或更多次施用。事实上，对也可包含在内的其他组分几乎没有限制，只要另外的药剂在与靶细胞或宿主组织接触之后不引起显著的不利影响即可。因此，rAAV颗粒或制剂可根据特定情况的需要与多种其他可药用药剂一起递送。这样的组合物可从宿主细胞或其他生物来源中纯化，或者作为替代地可如本文中所述化学合成。

包含可药用赋形剂和/或载体溶液的制剂对于本领域技术人员来说是公知的，用于在多种治疗方案中使用本文中所述的特定组合物的合适给药和治疗方案的开发也如此，所述多种治疗方案包括例如经口、肠胃外、静脉内、鼻内、关节内和肌内施用和制剂。

通常来说，这些制剂可包含至少约0.1％或更多的治疗剂(例如，rAAV颗粒或制剂，和/或rAAV载体)，但是活性成分的百分比当然可变化并且可方便地在总制剂的重量或体积的约1％或2％至约70％或80％或更多之间。自然地，每种治疗上有用的组合物中一种或更多种治疗剂的量可以以这样的方式制备：在任何给定的单位剂量的化合物中将获得合适的剂量。当制备这样的药物制剂时，本领域技术人员将考虑以下因素，例如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保存期以及其他药理学考虑因素。另外，可期望多种剂量和治疗方案。

在某些情况下，将期望如下递送在本文中所公开的适当配制的药物组合物中的rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体：皮下，心内，眼内，玻璃体内，肠胃外，皮下，静脉内，脑室内，肌内，鞘内，经口，腹膜内，通过经口或经鼻吸入，或通过直接注射至一种或更多种细胞(例如，心肌细胞和/或其他心脏细胞)、组织或器官。在一些实施方案中，将本发明的rAAV颗粒或包含rAAV颗粒的组合物直接注射到对象的心脏中。直接注射至心脏可包括注射到一种或更多种心肌组织、心脏内衬(cardiac lining)或心脏周围的骨骼肌中，例如使用针导管进行。

适于可注射使用的组合物的药物制剂包括无菌水溶液或分散体。在一些实施方案中，所述制剂是无菌的并且在存在容易注射性的程度上是流体。在一些实施方案中，所述形式在制造和储存条件下是稳定的，并且被保护免受微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、植物油或其他可药用载体，例如由美国食品和药品管理局公认安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)的那些。可维持适当的流动性，例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来进行。

术语“载体”是指与rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括以下那些：石油，例如矿物油；植物油，例如花生油、大豆油和芝麻油；动物油；或合成来源的油。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体。

对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要的话，可以将溶液适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、玻璃体内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等张NaCl溶液中，然后添加到1000ml皮下灌注流体中或注射在建议的输注部位(参见例如″Remington′s PharmaceuticalSciences″第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据所治疗对象的状况，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员决定用于个体对象的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应符合例如FDA生物学标准所所要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。

无菌可注射溶液通过将所需量的rAAV颗粒或制剂、Rep蛋白和/或rAAV载体与上文中列举的数种其他成分(如有需要的话)一起并入合适的溶剂中、然后过滤灭菌来制备。通常，通过将多种经灭菌的活性成分并入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基础分散介质和来自以上列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术由其经预先无菌过滤溶液产生活性成分加上任何另外期望成分的粉末。

rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体组合物的量和施用这样的组合物的时间将在受益于本教导的技术人员的范围内。然而，很可能可以通过单次施用实现治疗有效量的本发明组合物的施用，例如单次注射足够数量的感染性颗粒以为接受这种治疗的患者提供治疗益处。作为替代，在一些情况下，可期望在相对较短或相对延长的时间段内提供rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体组合物的多次或连续施用，这可以由监督这样的组合物的施用的医疗人员决定。

本发明的组合物可包含单独或者与一种或更多种另外的活性成分组合的rAAV颗粒或制剂、和/或rAAV载体，所述另外活性成分可从天然或重组来源获得或者化学合成。在一些实施方案中，rAAV颗粒或制剂与蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米或羟基脲组合施用，在同一组合物中或作为同一治疗方案的一部分施用。

“治疗”疾病如该术语在本文所用是指降低对象经历的疾病或障碍的至少一种体征或症状的频率或严重程度。通常将上述组合物以有效量(即能够产生期望结果的量)施用于对象。期望结果将取决于所施用的活性剂。例如，rAAV颗粒的有效量可以是能够将异源核酸转移至宿主器官、组织或细胞的颗粒量。

可以通过标准药学方法使用培养物中的细胞或实验动物确定LD

本发明的另一些方面涉及用于对象例如人或非人对象、对象中的原位宿主细胞或来源于对象的宿主细胞的方法和制剂。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是伴侣动物。本文中使用的“伴侣动物”是指宠物和其他家养动物。伴侣动物的一些非限制性实例包括狗和猫；牲畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在一些实施方案中，对象是人对象。在一些实施方案中，对象患有或怀疑患有可用基因治疗来治疗的心脏病。在一些实施方案中，对象处于心力衰竭的任何阶段。在一些实施方案中，心力衰竭由心肌病引起。在一些实施方案中，心力衰竭由肥厚型心肌病或扩张型心肌病引起。

以下实施例旨在举例说明本发明的某些实施方案，并且旨在是非限制性的。在本申请通篇引用的所有参考文献(包括文献参考、授权专利、公开的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入。

实施例

实施例1：治疗性靶向心力衰竭的多个方面

在一些方面中，本发明提供了可用于治疗一种或更多种心脏病症(例如，心肌病、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭、心脏病等)的组合物和方法。在一些实施方案中，本申请提供的组合物可通过多次直接注射到心脏中来提供给对象。图1中描绘了可提供给对象的一种示例性AAV构建体。在某些实施方案中，这样的示例性构建体被重组AAV(例如，AAV6)衣壳化，并且包含S100钙结合蛋白A1(S100A1)和胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(ARC)的物种特异性编码序列以解决一种或更多种心脏病症(例如，心肌病)的两个单独方面。图1中的示例性构建体的两个转基因由心脏TnT启动子驱动，并且因此将仅在心肌细胞中表达。

S100A1改善钙处理的一些方面，包括使肌质网钙瞬变正常化，从而导致收缩功能正常化。ARC阻断由线粒体机制引发的凋亡和由非线粒体机制引发的凋亡(例如牵张诱导的凋亡)，以及改善线粒体功能。心力衰竭的这两个单独要素(钙处理功能障碍和凋亡)是分别解决的，但永远不会一起解决。因此，这样的方法的协同益处提供了可导致改善的长期结局的治疗选择。通过靶向心肌病的两个方面，本申请提供的组合物和方法可用于解决多种心脏病症(例如肥厚型或扩张型心肌病)，并且在心力衰竭的任何阶段都是有益的。

本文中在说明书中提及的所有出版物、专利和序列数据库条目均在此通过引用整体并入，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指明通过引用并入一样。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

实施例2：狗中扩张型心肌病的基因治疗

扩张型心肌病(DCM)是狗中获得性心脏病的第二最常见原因，最常见地影响大型犬，例如杜宾犬、大丹犬(great Dane)和爱尔兰猎狼犬(Irish Wolfhound)。在患有该疾病的人中，有手术选择，例如心脏移植和左心室辅助装置。然而，在兽医学中，唯一的治疗选择是对与心力衰竭相关的体征进行医学管理。患病狗的预后取决于疾病的阶段和品种。例如，大多数杜宾犬在发生充血性心力衰竭(CHF)之后存活少于6个月。相比之下，其他品种例如可卡犬(cocker spaniel)则倾向于存活更久。随着心脏病的进展，在心脏细胞内凋节钙运动的通道的功能失常促进钙循环异常，进一步使心脏的收缩和舒张失调。值得注意的是，钙转运异常已在具有天然存在的DCM5的狗中被认识到，并且在继发于许多不同病因的心力衰竭中也发生。

设计为使钙循环异常正常化的基因转移策略在多种形式心脏病的小型和大型动物模型中改善心脏病。事实上，已经在人中进行临床试验以针对心肌病测试该治疗方法，并且初步结果是令人鼓舞的。初步研究正在评价设计为使患有DCM并表现出CHF的杜宾犬的钙处理正常化的基因递送的效力。使用杜宾犬是因为DCM在该品种中广泛存在，并且该疾病在该品种中一旦CHF发生则倾向于快速且一致地进展。解决DCM的新模式将对所有易患该特发性疾病的犬品种(包括杜宾犬、拳师犬(boxer)、大丹犬、德国牧羊犬(German shepherd)、金毛寻回犬(golden retriever)等)具有重大影响。值得注意的是，在对来自患有自然发生心脏病的最常见形式(犬退行性瓣膜病和DCM)的狗的样品中心肌蛋白水平的先前研究发现多种蛋白质(包括S100A1)水平异常(S100A1降低)。

这些发现表明，靶向S100A1的基因递送可有效治疗DCM以及继发于退行性瓣膜病发生的心肌衰竭。另外，在病变心肌中凋亡(程序性细胞死亡)更为常见，并且ARC是强效且多功能的凋亡抑制因子。目前，兽医心力衰竭的护理标准是对流体超负荷和充血的医学管理。针对异常心肌调节分子的基因递送技术提供了机械靶标，其可使兽医临床医师在第一次就特别地解决心肌疾病进程。此外，与当前载体生产技术和载体的心肌内基因递送相关的成本使得该治疗的成本对于许多主人而言是可接受的，并且预期成本会随时间降低。

使用AAV 2/6载体的基因转移的微创方法导致在正常狗中心肌细胞转导＞75％(参见Bish LT，Sleeper MM，Brainard B，et al.Percutaneous transendocardialdelivery of self-complementary adeno-associated virus 6 achieves globalcardiac gene transfer in canines.Mol.Ther.16，1953-9(2008))。将六只正常的杂种狗用编码受磷蛋白(Phospholamban)的显性阴性形式(dn-PLN)(与天然受磷蛋白竞争因此降低其对SERCA2a的抑制作用的假磷酸化形式)的AAV2或AAV6载体来处理(n＝4)或者用AAV2/6dn-PLN和S100A1来处理(n＝2)。所有狗在处理之后2年内都保持健康，具有正常的心血管功能，这表明该治疗不引起心肌炎或显著改变心脏功能，因此支持该治疗方法的安全性。实际上，已经注射了40多只正常和患病的狗(参见下文)，并且迄今为止的结果表明该注射技术具有良好的耐受性。此外，对宾夕法尼亚大学Matthew J.Ryan兽医院的20只随机犬病例进行采样用于针对rAAV2/6的抗体，并且发现在20只狗的19只中效价处于处理的可接受范围内，表明先前的免疫应答不会排除很大比例的治疗候选物。为了确定该治疗方法对于DCM的治疗是否有效，然后对患有严重形式的迅速进展幼年型DCM的葡萄牙水犬(Portuguesewater dog)进行处理。值得注意的是，注射了AAV2/6dn-PLN的狗表现出磷酸化PLN显著降低，这支持了该方法在该疾病模型中使钙循环正常化的潜在能力。此外，与仅包含dn-PLN的载体的递送相比，用包含dn-PLN和S100A1二者的载体进行的基因递送在更大程度上减慢继发于DCM的CHF的发生。与单独dn-PLN治疗相比，组合载体将CHF的发作平均延迟了4周。出于该原因，在初步研究中使用组合载体方法确定基因治疗在延长患有成年型DCM和充血性心力衰竭的杜宾犬的寿命中是否有效。

研究具有盲法、安慰剂对照的设计。根据已经处理的DCM和CHF的最近12例杜宾犬病例，平均存活为148天(标准偏差为160天)。通过使用效能为0.8，alpha(双侧)为0.05，并且病例与对照之比为1，要求每组中样品量为13只狗以检测6个月存活的差异。使用参数样本量检验确定此计算。招募了26只患有DCM和对照CHF的杜宾犬。为了符合招募，狗必须具有小于1∶20的针对AAV2/6的循环中和抗体效价，并且没有心脏之外的疾病。另外，排除患有伴随性先天性心脏病或具有原发性二尖瓣疾病证据的狗。在基线(招募时)，使用抗体效价、CBC和化学检查用于筛选目的。对狗进行3-分钟心电图(ECG)和完整超声心动图(ECHO)，并且主人完成之前验证的生命质量问卷。针对间隔持续时间和心律不齐的存在评价ECG。ECHO包括2D、M模式和多普勒研究(包括组织多普勒)。胸部射线照片用于对疾病分期(狗在临床上补偿充血性心力衰竭的病史)。

满足招募要求的狗被随机分配到安慰剂分支(用盐水进行心脏注射)或基因治疗组(用AAV2/6-ARC-s100a1进行心脏注射)。在整个研究期间，在所有狗中对DCM和充血性心力衰竭的标准医学管理持续进行(匹莫苯丹(pimobendan)、血管紧张素抑制剂和利尿剂治疗)。使用盐水代替空衣壳作为假治疗，以使得如果与安慰剂组相比处理组显示出显著性改善，对照狗就可接受基因递送。在治疗之后2、4、6、9和12个月，重复进行ECG、ECHO、生命质量问卷和实验室分析。以每两个月为间隔进行统计学分析。

图2和图3分别描绘了在经处理的肌营养不良狗中舒张期(舒张)和收缩期(收缩)数据。在每个图中都可观察到心内膜和心外膜的轮廓。如表1中观察到的，数据表明在处理之后在数周内稳定或略微改善的功能。下表1示出了在时间1(处理之前)和时间2(处理之后)获取的数据的左心室质量(LVM[g])、舒张末期容积(EDV[ml])、收缩末期容积(ESV[ml])、每搏量(SV[ml])、射血分数(EF[％])和心输出量(CO[l/分钟])的结果。

表1

实施例3：在将载体递送到小鼠和狗中之后对营养不良表型的评估

在迪谢内肌营养不良(抗肌萎缩蛋白缺陷型)的小鼠和狗模型中评估了S100A1/ARC自互补载体的心脏AAV基因递送。早些时候，比较了AAV8(包括其多个变体)、AAV9和AAVrh.10血清型感染犬心脏的能力，并且发现AAVrh.10是最有效的。出于该原因，在本实施例中描述的所有实验都使用了AAVrh.10。

使在DBA/2J背景下的Mdx(抗肌萎缩蛋白缺型型)小鼠(“D2.mdx”)在4周龄时注射重组AAVrh.10-S100A1/ARC载体(以下称为“治疗性AAV”)并在24周之后处死。D2.mdx小鼠概括了迪谢内肌营养不良肌病的数种人特征，例如下后肢肌肉质量降低、肌纤维萎缩、纤维化和炎症提高、以及肌无力。在这24周的时间内，与假注射小鼠相比，注射了治疗性AAV的小鼠具有更好的维持射血分数、应变发展和心输出量(参见图4)，如通过心脏MRI测量的。蛋白质分析(Western印迹)证实，与对照(假注射)相比，在经处理的组织中S100A1和ARC水平二者均升高(参见图5)。此外，心脏组织学表明，与对照心脏相比，经处理的心脏表现出低得多的病理学(参见图6)。

两只GRMD(抗肌萎缩蛋白缺陷型)狗在其心脏射血分数第一次降低时注射了治疗性载体，心脏射血分数降低是表明心肌病发作的一种症状。来自狗对象的自然史研究的较早发现显示，射血分数一旦开始下降，则其在接下来的一年内继续进行性下降。在射血分数开始这种稳定降低之后，狗通常不能存活超过8至12个月。

如图7和图8中所示，两个对象在用AAVrh.10-S100A1/ARC处理之后数月均显示出射血分数和其他心脏参数的改善，如通过心脏MRI测量并通过echo测量结果证实的。在处理之后近12个月，第一个对象表现出在正常范围内的稳定射血分数。同样，在处理之后近7个月，第二个对象表现出稳定、正常的射血分数。

不仅心脏功能得到改善，而且狗的运动能力也不断改善，如通过在运动期间对对象进行拍摄定性评价的。与这种改善的运动能力一致的是，对象肢体的MRI测量结果显示，在AAV处理之后骨骼肌质量提高或不变(图9A至9C)。另外，处理之后骨骼肌中循环肌酸激酶水平(CK)的水平降低(图10)，表明进行中的肌肉损伤降低。

实髓例4：另外的狗对象的处理

迄今为止，已经用AAVrh.10-S100A1/ARC处理了两只杜宾犬对象，其中两只狗在处理时都经历了心力衰竭。第一只狗在处理时已接近死亡，表现出心脏射血分数仅为10％。在处理之后24小时内，射血分数提高至25％(数据未显示)。在处理之后4个月狗的首次随访时，射血分数稳定保持在26％。该对象在处理之后仍存活了5个月。

第二只经处理的杜宾犬在处理之前具有32％的射血分数，该分数虽然低但没有立即死亡危险。在处理之后24小时内，狗的射血分数提高至49％(数据未显示)，其在正常范围内。据报道，第二只狗在处理之后5周表现良好。该对象在处理之后4个月进行了首次随访。

根据这些初步发现，AAVrh.10-S100A1/ARC处理能够将犬的心脏功能恢复到正常范围。

等同方案

虽然本文中已对数个本发明实施方案进行了描述和举例说明，但是本领域普通技术人员将容易想到多种其他方法和/或结构来实现本文中所述功能和/或获得本文中所述结果和/或一个或更多个优点，并且认为这样的变化和/或修改中的每一个均在本文中所述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文中所述的所有参数、尺寸、材料和构造均意在为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验就确定本文中所述的具体本发明实施方案的许多等同方案。因此，应理解，前述实施方案仅作为实例示出，并且在所附权利要求书及其等同文件的范围内，本发明实施方案可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明的多个实施方案涉及本文中所述的每一个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并非互相不一致，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合也包含在本公开内容的本发明范围内。

本文中定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的一般含义。

本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其各自被引用的主题通过引用并入，在一些情况下，其可涵盖文件的全部内容。

除非明确指出相反，否则本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。

如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应理解为意指这样连接的要素，即在一些情况下共同存在而在另一些情况下分别存在的要素中的“任一个或二者”。用“和/或”列举的多个要素应以相同方式理解，即这样连接的要素中的“一个或更多个”。除了由“和/或”子句具体指明的要素之外，其他要素也可任选地存在，无论与具体指明的那些要素相关还是无关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言例如“包含/包括”结合使用时，对“A和/或B”的提及可在一个实施方案中仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指A和B二者(任选地包括其他要素)；等等。

如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，“或/或者”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或/或者”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，并且任选地包括另外的未列出项目。仅明确指出相反的术语，例如“仅之一”或“恰好之一”，或者当用于权利要求书中时“由......组成”，是指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性术语(例如“任一”、“之一”、“仅之一”或“恰好之一”)时，本文中使用的术语“或/或者”应仅被解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，而非二者”)。“基本上由......组成”当在权利要求书中使用时应具有其在专利法领域中所使用的一般含义。

如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，短语“至少一个/种”在提及一个或更多个要素的列表时应理解为意指从要素列表中的任意一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但并不一定包括要素列表内具体列举的各个和每个要素的至少一个，并且也不排除要素列表中要素的任意组合。该定义还允许可任选地存在要素列表中除短语“至少一个/种”所提及的具体指出的要素之外的要素，无论与具体指出的那些要素相关还是无关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个A，任选地包括多于一个A，但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个B，任选地包括多于一个B，但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指至少一个A，任选地包括多于一个A，和至少一个B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等等。

还应理解，除非明确指出相反，否则在本文中要求保护的包括多于一个步骤或操作的任何方法中，该方法的步骤或操作的顺序不必限于记载该方法的步骤或操作的顺序。

在权利要求书中以及上述说明书中，所有过渡性短语例如“包含”、“包括”、“携有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual ofPatent Examining Procedures)第2111.03节中所述，仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭式或半封闭式的过渡性短语。应理解，在本文件中使用开放式过渡性短语(例如，“包含/包括”)描述的实施方案也在替代实施方案中被考虑为“由该开放式过渡性短语描述的特征组成”和“基本上由该开放式过渡性短语描述的特征组成”。例如，如果本公开内容描述“包含A和B的组合物”，则本公开内容还考虑替代实施方案：“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”。

序列表

<110> 佛罗里达大学研究基金会有限公司

<120> 用于心肌病的AAV心脏基因治疗

<130> U1197.70084WO00

<140> 尚未分配

<141> 与其同时

<150> US 62/822,015

<151> 2019-03-21

<150> US 62/682,772

<151> 2018-06-08

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 285

<212> DNA

<213> 灰狼（Canis lupus）

<400> 1

atgggctctg agctggagac agcgatggag actctcatca atgtgttcca tgcccactcg 60

ggcaaggagg gaaacaagta caagctgagc aagaaggagc taaaggagct gctgcagact 120

gagctctccg gcttcctgga cgcccagaag gatgcggatg ctgtggacaa ggtgatgaaa 180

gagctagatg agaatggaga tggggaggtg gacttccagg agtatgtggt gctggtggct 240

gccctcacag tggcctgtaa caacttcttc tgggaaaaca gttga 285

<210> 2

<211> 285

<212> DNA

<213> 家猫（Felis catus）

<400> 2

atgggctcag agctggagac ggcgatggag actctcatca acgtgttcca cgcccactcg 60

ggcaaggagg gagacaagta caagctgagc aagaaggagc taaaagagct gctgcagacc 120

gagctctctg gcttcctgga cgcccagaag gatgccgacg ctgtggacaa ggtgatgaaa 180

gagctagacg agaatggaga tggggaggtg gacttccaag agtatgtggt gctggtggct 240

gccctcacag tggcctgtaa caactttttc tgggagaaca gttga 285

<210> 3

<211> 1479

<212> DNA

<213> 灰狼

<400> 3

atgcaggaag cgccagccgc gctgcccacg gagccgggcc ccagccccgt gcctgccttc 60

ctcggcaagc tgtgggcgct ggtgggcgac ccggggaccg accacctcat ccgctggagc 120

ccgagcggga ccagtttcct cgtcagcgac cagagccgct tcgccaagga agtgctgccc 180

cagtacttca agcacagcaa catggcgagc ttcgtgcggc agctcaacat gtacggtttt 240

cggaaggtgg tgagcatcga gcagggcggc ctgctcaggc cggagcgcga ccacgtcgag 300

ttccagcacc cgagcttcgt ccgcggccga gagcaactcc tggagcgcgt gcggcgcaag 360

gtgcccgcgc tgcgcagcga cgacggccgc tggcgccccg aggacctggg ccggctgctg 420

ggcgaggtgc aggctttgcg gggagtgcag gagatcaccg aggcgcggct gcgggagctc 480

aggcagcaga acgagatctt atggagggag gtggtgactc tgcggcagag ccacggtcag 540

cagcatcgcg tcattggcaa gctgatccag tgcctctttg ggccacttca gacagggtcc 600

agcggcgcag gagctaagag aaagctgtct ctgatgctgg atgaggggag ctcatgccca 660

acaccggcca aattcaacac ctgtccttta cctggtgccc tcttgcagga tccctacttt 720

atccagtcgc ccctcccaga gaccaccttg ggcctcagca gctctcatag gaccaggggc 780

cctatcatct ctgacatcca tgaagactct ccctcccctg atgggaccag gctttctcct 840

tccagtggtg gcaggaggga gaagggcctg gcactgctca aagaagagcc ggccagccca 900

gggggggaag gcgaggccgg gctggccctg gccccaaacg agtgtgactt ctgcgtgaca 960

gccccccccc cactgtccgt ggctgtggtg caggccatcc tggaagggaa ggggaacttc 1020

agccccgagg ggcccaggaa tgcccaacag cctgaaccaa ggggtcccag ggaggtacct 1080

gacaggggga ctctgggcct ggacaggggg gcacgaagcc cagagaatct gctgcctccc 1140

atgctgcttc gggccccccc tgaaagtgtg gagcctgcag ggcccctgga tgtgctgggc 1200

cccagccatc aagggcgaga atggaccctg atggacttgg acatggagct gtccctgatg 1260

cagcccttgg gtccagagag gagtgagact gagctggcgg tcaaggggtt aaattctccg 1320

gggccaggga aggactccac acttggggca ccactcctgc tcgatgtcca agcggctttg 1380

ggaggcccag ctctcagcct tcctggagct ttaaccattt acagcacccc tgagagccga 1440

gccaactacc taggcccagg ggccaatccc tccccctga 1479

<210> 4

<211> 549

<212> DNA

<213> 家猫

<400> 4

atgggcaatg cgcaggagcg gccctcagag acgatcgatc gcgagcggaa acgcctagtg 60

gagacgctgc aggacgactc cgggctgctg ctggatgcac tgctggcgcg cggcgtgctc 120

accgggcctg agtatgaggc gttggacgcg ctgcctgatg ccgagcgcag ggtgcgtcgc 180

ctgctgctgc tggtacaaag caagggcgag gccgcctgcc aggagctgct gcactgcgcc 240

cagcgtacta cgcgcgcgcc agacccggcc tgggactggc agcacgtggg cactggctac 300

cgggaacgca gctacgactc tccatgccct ggccactgga cgcctgaggc acctgacttg 360

aggaccgctt gccccgaaac gcccagagct tcagactgcg acgaggctgg ggtttcaggg 420

ggctcggagg cagtatccgg aaccctcgag gaactcgatc cggaagtgga agctgaagtc 480

tctgaagggg ctgagccaga gccagagcca gagcccgact ttgaggcggg tgatgagtct 540

gaagattcc 549