一种组织特异性半月板细胞外基质材料及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种组织特异性细胞外基质材料及其制备方法以及在保护半月板损伤后的关节损伤和退化中的应用。本发明通过对猪半月板的内侧1/3部分进行脱细胞化制备mECM，该制备方法能够彻底地清除细胞和细胞内的核酸，同时保留细胞外基质的主要成分，有利于维持细胞稳态；该方法所制备的mECM材料兼具了优异的力学性能和生物相容性，不仅能够修复半月板损伤，还能够有效地减少损伤部位纤维化，该mECM可作为支架材料与骨髓间充质干细胞复合，起到保护半月板损伤后的关节损伤和退化的作用，这对组织再生和患者后期生活质量方面具有重大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种组织特异性半月板细胞外基质材料及其制备方法以及在保护半月板损伤后的关节损伤和退化中的应用。

背景技术

半月板是膝关节内位于股骨髁与胫骨平台之间的由弹性软骨构成的C形组织，其主要作用是缓冲运动过程中胫骨与股骨之间的机械压力，避免直接的机械冲击给关节软骨造成损伤。随着户外活动的增加，半月板损伤的发病率日益升高。半月板损伤后其对关节的保护功能减弱，因此常常并发膝部软组织的损伤，如交叉韧带损伤、关节囊损伤和软骨面损伤等，表现出膝关节有剧痛，不能自动伸直，关节肿胀等临床症状。

目前半月板损伤的临床治疗方式多采用半月板缝合，Henning对这种治疗方式进行关节镜随访评估,结果显示有约40%的病例出现不愈合或者不完全愈合的情况。半月板部分切除术是临床上治疗半月板损伤的另一种重要方式，但半月板行部分切除术后常常出现关节软骨退变，最终导致骨关节炎。可见，目前临床上针对半月板损伤的治疗缺乏理想的方法。

随着组织工程的发展，为半月板损伤修复带来了新的希望，为半月板修复提供一种新的治疗模式。三维支架材料，作为组织工程的重要组成部分，得到了广泛的重视。由于半月板缓冲运动过程中的机械应力需要非常强的机械强度，传统天然材料难以达到这一条件，因此，目前用于半月板组织工程修复的支架材料主要采用人工合成材料，而人工合成材料的生物相容性较差，这大大限制了它们在半月板修复中的应用。更重要的是，目前的支架材料和半月板修复策略忽略了对关节整体功能的保护，尤其是对关节软骨退化的限制，而这对组织再生和患者后期生活质量是极其重要的。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有技术中的不足，而提供一种兼具半月板力学性能和生物相容性的组织特异性半月板细胞外基质材料及其制备方法，所制备的半月板细胞外基质材料能够起到保护半月板损伤后的关节损伤和退化的作用。

本发明的另一目的在于提供一种半月板细胞外基质材料在制备用于保护半月板损伤后的关节损伤和退化的复合材料中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种组织特异性半月板细胞外基质材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）于屠宰场获得月龄6-7个月猪新鲜的半月板，洗净后取内侧1/3部分，小心分割成大小为5-10 mm

（2）将组织小块置于在浓度为0.02mol/L的醋酸溶液中，4℃环境下浸泡48小时；

（3）将组织小块置于-80℃下冻干24小时，然后在室温4小时复温，得到冻干的组织，然后重复以上步骤，制备三个冻干的组织；

（4）将冻干的组织研磨成粉，置于2%SDS与10mmol/L的tris混合体系中，在25℃下搅拌24小时，弃上清液，进行三次循环，得到沉淀；

（5）将沉淀置于0.1％过氧乙酸处理2小时，再次离心弃上清液后，用无菌水和带抑肽酶的PBS依次搅拌、洗涤、沉淀12小时；

（6）将沉淀置于PBS中，用2mol/L的NaOH将溶液pH值调至8～8.5，4℃下搅拌6小时，然后用2 mol/L的HCl将溶液的pH值调至2～2.5；

（7）将调pH后的溶液经冷冻离心机离心，去上清液；

（8）将沉淀装入透析袋（分子量8000-14000）于蒸馏水中透析，每天换水并低温振荡，直至pH接近中性，然后电导在30μs以下，冷冻离心机离心,收集沉淀，倒去废液；

（9）将沉淀溶解于PBS中，用200U/mL的DNA酶和50U/mL的RNA酶溶液在37℃下处理24小时以去除半月板细胞外基质中的核酸，然后PBS反复洗涤；

（10）将洗涤后的溶液经冷冻离心机离心后收集沉淀，所得到的沉淀即为半月板细胞外基质材料，将其冻干后保存于-20℃备用。

优选的，步骤（1）中，所述半月板需在屠杀后12小时内获取。

优选的，步骤（7）中，离心条件为4℃，9000rpm，45min。

优选的，步骤（8）中，离心条件为4℃，9000rpm，40min。

优选的，步骤（10）中，离心条件为4℃，9000rpm，45min。

本发明还提供一种组织特异性半月板细胞外基质材料，所述半月板细胞外基质材料是采用上述制备方法制成的。

半月板是一种非常致密的结缔组织，常规的脱细胞外基质的方法很难实现彻底的脱细胞化，本发明采用的半月板脱细胞外基质的方法可以彻底地清除细胞和细胞内的核酸，同时保留细胞外基质的主要成分，如胶原蛋白（Collagen）、羟脯氨酸（hydroxyproline，OHP）和糖胺多糖（GAGs），有利于维持细胞稳态。

本发明还提供上述半月板细胞外基质材料在制备用于保护半月板损伤后的关节损伤和退化的复合材料中的应用。

本发明还提供一种用于保护半月板损伤后的关节损伤和退化的复合材料，所述复合材料是由上述半月板细胞外基质材料与骨髓间充质干细胞复合而成。

本发明的有益效果：

本发明从仿生学原理得到启发，采用独创的半月板脱细胞外基质的方法，该制备方法相比常规的脱细胞外基质的方法可以彻底地清除细胞和细胞内的核酸，同时保留细胞外基质的主要成分，如胶原蛋白、羟脯氨酸和糖胺多糖，从而有利于维持细胞稳态；通过实验证明，采用该方法制备的半月板细胞外基质（mECM）材料，兼具了优异的力学性能和生物相容性，不仅能够修复半月板损伤，还能够有效地减少损伤部位纤维化。因而，该mECM可作为支架材料，与骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合，起到保护半月板损伤后的关节损伤和退化的作用，这对组织再生和患者后期生活质量方面具有重大意义。

附图说明

图1为实施例1的mECM脱细胞化的实验效果图。

图2为实施例2的mECM促进BMSCs向纤维软骨分化能力的实验效果图。

图3为实施例3的大鼠背部mECM促进BMSCs向软骨分化能力的实验效果图。

图4为实施例4的mECM保护半月板损伤后的关节退化的实验效果图。

图5为实施例4的mECM保护半月板损伤后的骨关节炎的实验效果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1. 制备mECM。

1、通过对新鲜的猪半月板的内侧1/3部分进行脱细胞化制备mECM，具体方法如下：

（1）于屠宰场获得月龄6-7个月猪新鲜的半月板（在屠杀后12小时内获取），洗净后取内侧1/3部分，小心分割成大小为5-10 mm

（2）将组织小块置于在浓度为0.02mol/L的醋酸溶液中，4℃环境下浸泡48小时；

（3）将组织小块置于-80℃下冻干24小时，然后在室温4小时复温，得到冻干的组织，然后重复以上步骤，制备三个冻干的组织；

（4）将冻干的组织研磨成粉，置于2%SDS与10mmol/l的tris混合体系中，在25℃下搅拌24小时，弃上清液，进行三次循环，得到沉淀；

（5）将沉淀置于0.1％过氧乙酸处理2小时，再次离心弃上清液后，用无菌水和带抑肽酶的PBS依次搅拌、洗涤、沉淀12小时；

（6）将沉淀置于PBS中，用2mol/L的NaOH将溶液pH值调至8～8.5，4℃下搅拌6小时，然后用2 mol/L的HCl将溶液的pH值调至2～2.5；

（7）将调pH后的溶液经冷冻离心机离心（9000 rpm, 45min, 4℃），去上清液；

（8）将沉淀装入透析袋（分子量8000-14000）于蒸馏水中透析，每天换水并低温振荡，直至pH接近中性，然后电导在30μs以下，冷冻离心机离心（9000 rpm, 40min，4℃）,收集沉淀，倒去废液；

（9）将沉淀溶解于PBS中，用200U/mL的DNA酶和50U/mL的RNA酶溶液在37℃下处理24小时以去除mECM中的核酸，然后PBS反复洗涤；

（10）将洗涤后的溶液经冷冻离心机离心后收集沉淀（9000 rpm, 45min，4℃），所得到的沉淀即为半月板细胞外基质（mECM），将其冻干后保存于-20℃备用。

2、mECM脱细胞化的验证：

2.1实验方法：

（1）检测DNA含量：使用PicoGreen dsDNA定量试剂盒按照说明书操作检测mECM和新鲜半月板组织中双链DNA含量，以反映本发明脱细胞化和DNA清除的有效性。

（2）检测胶原蛋白（Collagen）、羟脯氨酸（hydroxyproline，OHP）和糖胺多糖（GAGs）含量：mECM和新鲜半月板组织中的胶原蛋白和GAGs含量通过胶原蛋白定量检测试剂盒，羟脯氨酸检测试剂盒和GAGs试剂盒检测。

（3）扫描电镜： mECM和Cowhide collagen在-80℃冻干24小时后，喷金两分钟，接着通扫描电镜对组织形貌结构进行拍照。

2.2实验结果：

如图1a所示，经过本发明特有的脱细胞方法制备的mECM，相对于正常半月板组织的dsDNA含量显著下降，作为细胞核特征物质，dsDNA的显著降低反映了本发明脱细胞处理的有效性。

如图1b-d所示，mECM与半月板组织中胶原蛋白（Collagen）、羟脯氨酸（OHP）和糖胺多糖(GAGs)的含量非常接近，这表明本发明采用的脱细胞方法在除去半月板中细胞的同时，对半月板细胞外基质主要成分影响很小。

如图1e所示，通过在醋酸中膨胀mECM具有疏松的多孔结构，相互连通的孔隙范围为10μm至40μm，这被认为有利于细胞浸润和增殖。

综上，半月板是一种非常致密的结缔组织，常规的脱细胞外基质的方法很难实现彻底的脱细胞化，本发明采用的半月板脱细胞外基质的方法可以彻底的清除细胞和细胞内的核酸，同时保留细胞外基质的主要成分，如胶原蛋白（Collagen）、脯氨酸（hydroxyproline，OHP）和糖胺多糖（GAGs），有利于维持细胞稳态。

实施例2. mECM促进BMSCs向纤维软骨分化能力的实验。

在体外实验，本实施例将BMSCs分别与mECM和常规的牛皮来源的胶原水凝胶（最常用的天然支架材料，Cowhide collagen）混合做三维培养，检查BMSCs在mECM和Cowhidecollagen中的增殖，进一步通过组织染色、qPCR和Western bloting评估mECM诱导BMSCs向纤维软骨分化的诱导能力。

1、实验方法：

（1）BMSCs的分离和培养：三日龄的SD大鼠被安乐死，酒精浸泡两分钟，获取乳鼠的后肢并置于青链霉素溶液两分钟，在无菌环境下剥离肌肉组织获取股骨干。将装有培养基的一毫升注射器针头（22号针头）插入股骨干，冲刷并收集股骨中的BMSCs。将BMSCs培养于完全培养基。每三天更换一次培养基，五天做一次传代。所有后续实验均使用第3代BMSCs进行。

（2）BMSCs的三维培养；将mECM和Cowhide collagen溶解于1mol/l的醋酸，并用1mol/l的氢氧化钠溶液将PH值调节至7左右；将BMSCs（1×105每管）收集离心至15毫升离心管底部，分别滴加0.1ml PH=7的mECM或Cowhide collagen对应实验分组的离心管中，充分混匀后于37℃静置20分钟，待复合物固化后缓慢加入培养基，培养箱培养7天、14天或21天收集样品用于进一步实验。

（3）GAGs检测： PBS清洗三维培养的样品，接着用液氮研磨成匀浆，加入60μg/ml的蛋白酶K在56℃下水浴10小时。使用33258试剂加入组织匀浆孵育15分钟，接着用荧光酶标仪在波长460nm处检测吸光度，以反映三维组织中的DNA含量和细胞数量。使用DMMB试剂加入匀浆中避光孵育30分钟，接着用荧光酶标仪在波长525nm处检测吸光度，以反映三维组织中的总GAGs含量。最后，通过总GAGs的含量除以总DNA含量，反映细胞内GAGs的分泌水平。

（4）qPCR检测：PBS清洗三维培养的样品，接着用液氮研磨成匀浆，用mRNA提取试剂盒提取样品内mRNA，在按照标准的qPCR操作流程检测三维样品内软骨相关基因（CollagenI, Collagen II和aggrecan）表达。

（5）Western blotting检测：

PBS清洗三维培养的样品，接着用液氮研磨成匀浆，使用细胞蛋白提取试剂盒提取总蛋白，测定蛋白液的浓度，使用上样量为50ug样品进行电泳和转模，使用封闭液封闭以后，模块被用以孵育一抗（Collagen I, Collagen II和aggrecan）24小时，孵育荧光二抗两小时后，ODYSSEY双色红外激光成像系统扫膜。

（6）组织学染色：将三维培养的组织蔗糖脱水和石蜡包埋后进行厚度为5μm的组织切片。脱蜡后行HE染色、阿利新蓝染色（Alcian Blue）和甲苯胺蓝染色(Toluidine blue)。

（7）组织学染色：将三维培养的组织蔗糖脱水和石蜡包埋后进行厚度为5μm的组织切片。脱蜡后通过高分进行抗原修复，行免疫组化染色（Collagen I和Collagen II）。最后通过倒置显微镜拍照，通过Image J进行表达量的定量分析。

2. 实验结果：

如图2a所示， HE染色结果可以看到，mECM中的细胞数量随着时间的延长大量增殖，而且比同时间点的Cowhide collagen中细胞的更多。更重要的是，在21天mECM中出现了一些胞质丰富的空泡状细胞类软骨样细胞，它被认为是BMSCss向软骨分化过程中的特征细胞形态。

如图2b所示，在软骨特征性染色（Alcian和Toluidine blue staining）结果中，mECM出现了大量明显的阳性表达，在免疫组化染色中mECM+BMSCs组中相对于Cowhidecollagen+BMSCs组二型胶原（Collagen II）的表达略高，然而纤维软骨的优势基因一型胶原（CollagenI）的表达却显著升高，这个结论也得到了qPCR结果的证实（见图2c），因此说明mECM有利于促进BMSCs向纤维软骨分化。

如图2e所示，在扫描电镜下观测正常半月板组织、BMSCs在mECM和Cowhidecollagen三维培养组织的形貌特征，结果显示mECM+BMSCs中的三维组织的形貌特征更接近正常半月板的结构。

实施例3. 大鼠背部mECM促进BMSCs向软骨分化能力的实验。

本实施例将mECM与BMSCs复合，在体外三维培养一周，通过显微手术移植到大鼠背部，一个月后取出大鼠背部的组织，通过HE、番红和甲苯胺蓝染色检测该组织的组织形态和软骨分化。

1. 实验方法：

（1）三维培养复合体向大鼠背部移植：参照实施例2中的实验方法（2）对BMSCs在mECM进行三维培养，一周后取出三维培养复合物备用；对七周大的雄性大鼠背部中线附近进行备皮、消毒，在沿着背部中线做长度约1cm纵性切口，将体外培养一周的mECM+BMSCs三维培养复合物小心移植到大鼠皮下，缝合皮肤，一个月后对大鼠进行安乐死，小心取出移植物备用。

（2）组织染色：参照实施例2中的实验方法（6）对移植物进行组织染色（HE染色、番红染色和甲苯胺蓝染色）。

2. 实验结果：

如图3所示，HE染色中可以看到移植物中细胞众多，有大量的细胞呈现一种胞质丰富的空泡状的形态，并发现类似软骨陷窝样（软骨的特有结构）的结构。以上结果表明异位移植环境中mECM能够促进BMSCs向软骨细胞分化。

实施例4. mECM保护半月板损伤后的关节退化和骨关节炎的实验。

1. 实验方法：

（1）制作半月板损伤模型：获得18只七周龄雄性SD大鼠，将其分为三组：模型组；mECM+BMSCs组和Cowhide collagen+BMSCs。对所有大鼠下肢进行备皮、消毒，腹腔注射3毫升2%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，在显微镜下在膝关节内侧做长约1.5cm的纵形切口，小心打开关节腔，暴露出半月板，在半月板内侧前角制造一个直径0.6mm的全层缺损。参照实施例2中的实验方法（2）的描述制备支架材料与BMSCs的复合物于4℃保存，将30μL复合物注射到半月板缺损处，静置五分钟后关闭关节囊，缝合肌层和皮肤。从手术后第二周开始大鼠每天置于跑步机运动两个小时。手术八周后，取大鼠的关节液做炎症介质（IL-6, IL-1β和 TNF-α）的酶联免疫吸附实验（ELISA）；安乐死所有大鼠，对关节进行OARSI评分；通过microCT评估关节腔容积和骨质流失；行半月板和关节软骨组织的组织学染色，包括HE染色,番红固绿染色和免疫组化染色（MMP-13），评价半月板修复情况和软骨退化和炎症表达水平。

（2）关节液的ELISA检测：三组SD大鼠连续治疗八周后，注射0.1毫升生理盐水进入关节腔，1分钟后抽出关节液，通过ELISA试剂盒和标准的操作流程，检测关节液中IL-6,IL-1β和 TNF-α的分泌。

（3）大体观测及评分：动物接收连续治疗四周后，安乐死所有的大鼠，截取关节组织，分离胫骨平台和股骨髁进行拍照，并分析关节面的损伤情况和组织评分。

（4）免疫组化染色：将分离出来的关节组织，EDTA脱钙1个月，脱水和进行石蜡包埋切片。脱蜡后通过高分进行抗原修复，行骨关节炎特异指标（MMP-13）的免疫组化染色。最后通过倒置显微镜拍照，通过Image J进行表达量的定量分析。

（5）将三组SD大鼠的整体关节组织分离出来,适当剥离周围皮肤和肌肉组织，保留胫骨和股骨各2cm，行micro-CT扫描，所得数据通过计算机分析骨质增生、骨密度、骨小梁密度和关节腔容积。

2. 实验结果：

（1）mECM复合BMSCs对半月板损伤的保护：

如图4a所示,从半月板的大体观可以看出，在control组大鼠半月板损伤后而未接受治疗，八周后出现严重的半月板退化和损伤；mECM和Cowhide collagen（牛皮胶原，目前最常用的支架材料）复合BMSCs都能在一定程度上修复半月板，而其中mECM对半月板的修复作用更为出色。这个结论也得到了HE染色的证实（见图4b），更重要的是，mECM不仅可以修复半月板损伤，还可有效的减少损伤部位纤维化。如图4c所示，为半月板组织的番红染色，细胞外基质的糖胺多糖可以被番红染液染成红色，在control组中阳性区域（红色）较少，经过组织工程材料修复可以大大增加阳性染色范围，防止糖胺多糖的流失，而mECM的效果相对于Cowhide collagen更加优异。

（2）mECM复合BMSCs对半月板损伤造成的骨关节炎的保护：

如图5a所示，从大体观可以看，半月板损伤后如不及时治疗会对软骨面造成严重的损伤，而mECM和Cowhide collagen复合BMSCs对半月板损伤的治疗可以有效的减轻软骨损伤，尤其是mECM+BMSCs组软骨面得到了极大的保护，这个结果也到了OASRI骨关节炎国际评分的验证。

如图5c-d所示，进一步对关节面进行骨关节炎特异指标MMP-13的免疫组化染色，结果显示，模型组（control）出现了大量的阳性表达，而mECM显著的减轻了MMP-13的表达。

如图5e所示，ELISA检测关节液炎症介质（IL-1β,IL-6和TNF-α）表达,结果显示mECM可以显著降低半月板损伤引起的炎症分泌。

如图5f-h所示，micro-CT结果显示，control组的关节附近出现了大量的骨赘，关节腔的容积显著增大，而mECM可以有效地较少骨赘形成，减少关节腔容积是关节更稳定。

另外，半月板损伤还可导致骨质流失和骨密度降低，mECM可以大大减轻半月板损伤后的骨质流失，增加骨小梁密度，进而避免关节进一步退化。

以上所举例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属技术领域中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。