对人T细胞受体α恒定区基因具有特异性的优化的工程化核酸酶

摘要

本发明包括识别和切割人T细胞受体(TCR)α恒定区基因的第一外显子内的识别序列的工程化核酸酶。与第一代大范围核酸酶TRC 1‑2x.87EE相比，工程化大范围核酸酶可以表现出至少一个优化的特性，例如增强的(即增加的)特异性或切割效率。本发明还包括使用这样的工程化核酸酶制造遗传修饰的细胞的方法，以及这样的细胞在药物组合物中的用途以及在治疗诸如癌症的疾病的方法中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤学、癌症免疫治疗、分子生物学和重组核酸技术的领域。特别地，本发明涉及对人T细胞受体α恒定区基因中的识别序列具有特异性的优化的工程化核酸酶。本发明还涉及这种重组大范围核酸酶在生产遗传修饰的T细胞的方法中的用途以及使用这种细胞在受试者中治疗包括癌症的疾病的方法。

本申请包含序列表，该序列表已通过EFS-Web以ASCII格式提交，其全部内容通过引用并入本文。于2019年4月11日创建的所述ASCII副本被命名为P109070028WO00-SEQ，其大小为2700字节。

T细胞过继免疫疗法是一种有前途的癌症治疗方法。该策略利用经过遗传修饰以增强其对特定肿瘤相关抗原的特异性的分离的人T细胞。遗传修饰可涉及嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的表达，以将抗原特异性移植到T细胞上。与外源性T细胞受体相反，嵌合抗原受体从单克隆抗体的可变域中获得其特异性。因此，表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)以主要组织相容性复合物非限制性方式诱导肿瘤免疫反应性。T细胞过继免疫疗法已被用作许多癌症的临床疗法，包括B细胞恶性肿瘤(例如急性淋巴母细胞白血病，B细胞非霍奇金淋巴瘤，急性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、晚期神经胶质瘤、卵巢癌、间皮瘤、黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌等。

尽管其具有作为癌症治疗的潜在用途，但CAR T细胞的过继免疫疗法部分地受到细胞表面上内源性T细胞受体表达的限制。向同种异体患者施用后，表达内源性T细胞受体的CAR T细胞可以识别主要和次要的组织相容性抗原，这可能导致移植物抗宿主病(GVHD)的发展。结果，临床试验主要集中在自体CAR T细胞的使用上，其中将患者的T细胞分离，进行遗传修饰以掺入嵌合抗原受体，然后重新输注入同一患者。自体方法对所施用的CAR T细胞提供免疫耐受；但是，这种方法受到患者诊断出癌症后产生患者特异性CAR T细胞所需的时间和费用的限制。

因此，开发使用来自第三方、健康供体的T细胞制备的“现成的”CAR T细胞将是有利的，所述CAR T细胞具有减少的内源性T细胞受体的表达并且在施用时不引发GVHD。这种产品可以在诊断之前生成和验证，并可以在必要时尽快供给患者。因此，需要开发缺乏内源性T细胞受体的同种异体CAR T细胞以防止GVHD的发生。

基因组DNA的遗传修饰可以使用位点特异性的、稀有切割的核酸内切酶进行，这些酶经改造以识别目标基因座中的DNA序列。归巢核酸内切酶是一组天然存在的核酸酶，其识别通常在植物和真菌基因组中发现的15-40个碱基对的切割位点。它们经常与寄生DNA元件，例如1组自剪接内含子和内含肽相关。它们通过在染色体中产生双链断裂而自然促进宿主基因组中特定位置处的同源重组或基因插入，这募集了细胞DNA修复机制(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49-95)。归巢核酸内切酶通常分为四个家族：LAGLIDADG(SEQID NO:2)家族、GIY-YIG家族、His-Cys盒家族和HNH家族。这些家族通过结构基序表征，其影响催化活性和识别序列。例如，LAGLIDADG(SEQ ID NO:2)家族的成员的特征在于具有保守的LAGLIDADG(SEQ ID NO:2)基序的一个或两个拷贝(参见Chevalier等(2001),NucleicAcids Res.29(18):3757-3774)。具有单个拷贝的LAGLIDADG(SEQ ID NO：2)基序的LAGLIDADG(SEQ ID NO：2)归巢核酸内切酶形成同源二聚体，而具有两个拷贝的LAGLIDADG(SEQ ID NO：2)基序的成员被发现为单体。

I-CreI(SEQ ID NO：1)是归巢核酸内切酶LAGLIDADG(SEQ ID NO：2)家族的成员，该酶识别并切割藻类莱茵衣藻的叶绿体染色体中22个碱基对的识别序列。遗传选择技术已用于改变野生型I-CreI切割位点偏好(Sussman等(2004),J.Mol.Biol.342:31-41；Chames等(2005),Nucleic Acids Res.33:e178；Seligman等(2002),Nucleic Acids Res.30:3870-9,Arnould等(2006),J.Mol.Biol.355:443-58)。最近，描述了一种合理设计单LAGLIDADG(SEQ ID NO：2)归巢核酸内切酶的方法，该方法能够全面地重新设计I-CreI和其他归巢核酸内切酶以靶向广泛不同的DNA位点，包括哺乳动物、酵母、植物、细菌和病毒基因组中的位点(WO 2007/047859)。

如WO 2009/059195中首先描述的，I-CreI及其工程衍生物通常为二聚体，但可以使用将第一亚基的C末端与第二亚基的N末端连接的短肽接头将其融合为单个多肽(Li等(2009),Nucleic Acids Res.37:1650-62；Grizot等(2009),Nucleic Acids Res.37:5405-19)。因此，可以从单个转录物表达功能性“单链”大范围核酸酶。

已经公开了使用核酸酶来破坏内源TCR的表达，包括使用小发夹RNA、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、megaTAL和CRISPR系统(例如，Osborn等(2016),Molecular Therapy 24(3):570-581；Eyquem等(2017),Nature 543:113-117；U.S.专利号8,956,828；U.S.公开号US2014/0301990；U.S.公开号US2012/0321667)。

先前还公开了工程化大范围核酸酶在人TCRα恒定区基因中切割DNA靶标的具体用途。例如，国际公开号WO 2014/191527公开了I-OnuI大范围核酸酶的变体，其也经工程化以靶向TCRα恒定区基因的外显子1内的识别序列(‘527公开的SEQ ID NO：3)。尽管‘527公开讨论了嵌合抗原受体可以在TCR敲除细胞中表达，但作者并未公开将CAR编码序列插入到大范围核酸酶切割位点中。

此外，在国际公开号WO 2017/062439和WO 2017/062451中，申请人公开了工程化大范围核酸酶，其对TCRα恒定区基因的外显子1中的识别序列具有特异性。这些包括对外显子1中的TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)具有特异性的“TRC 1-2大范围核酸酶”。‘439和‘451公开还公开了将CAR编码序列或外源TCR编码序列靶向性插入TCR 1-2大范围核酸酶切割位点中的方法。

在本发明中，申请人对现有技术中所教导的核酸酶和方法进行了改进。通过广泛的实验，申请人已经产生了新颖的第二代TRC 1-2大范围核酸酶，它们包含独特的、不可预测的残基组合，并且出乎意料地优于‘439和‘451申请中所教导的第一代TRC 1-2大范围核酸酶。例如，本发明的第二代TRC 1-2大范围核酸酶具有改善的(即增加的)特异性和减少的脱靶切割，从mRNA表达后在细胞中表现出减少的持续时间，在用于产生CAR T细胞时在体外功能上优越(例如增强/增加的TCR敲除、增强/增加的CAR敲入、增强/增加的CAR T扩增、改善的CAR T细胞表型等)，并在用于全面的CAR T细胞制造过程中时产生改善的CAR T细胞群体。

发明内容

本发明提供了工程化大范围核酸酶，其识别和切割人T细胞受体(TCR)α恒定区基因(SEQ ID NO：3)的第一外显子内的识别序列。这样的大范围核酸酶可用于破坏TCRα恒定区基因，并因此破坏细胞表面TCR的表达和/或功能。大范围核酸酶切割可通过非同源末端连接的诱变作用或通过经由同源重组促进将外源多核苷酸引入基因中而破坏基因功能。在一些实施方式中，引入的外源多核苷酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，使得大范围核酸酶可用于产生缺乏内源TCR的同种异体CAR T细胞。在一些实施方式中，与第一代大范围核酸酶TRC 1-2x.87EE相比，当前公开的工程化大范围核酸酶表现出至少一个优化的特征。此类优化的特征包括改善的(即增加的)特异性而导致减少的脱靶切割，减少的细胞中的持续时间(例如从mRNA表达后)和/或增强的(即增加的)TCRα恒定区基因的修饰效率。此外，与已经用TRC1-2x.87EE大范围核酸酶进行遗传修饰的细胞相比，已经用目前公开的工程化大范围核酸酶进行遗传修饰的细胞表现出改善的特性，包括减少的脱靶切割及其效应，减少的大范围核酸酶在细胞中的持续时间，增强的(即增加的)CAR T表达，以及较低的分化。另外，与其中已经引入了TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶(或编码其的核酸)的那些细胞群体相比，已引入当前公开的大范围核酸酶(或编码其的核酸)的细胞群体具有更大百分比的修饰细胞和更大百分比的较低分化的细胞。

本发明进一步提供了方法，其包括将工程化的大范围核酸酶蛋白或编码工程化的大范围核酸酶的基因递送至真核细胞，以产生遗传修饰的真核细胞。因此，进一步提供了遗传修饰的真核细胞及其群体，以及包含该遗传修饰的真核细胞及其群体的药物组合物。还提供了通过施用遗传修饰的T细胞或其群体来治疗癌症的免疫疗法的方法，其中所述T细胞表达肿瘤特异性抗原的受体(例如CAR或外源TCR)。

因此，一方面，本发明提供了工程化大范围核酸酶，其识别并切割人TCRα恒定区基因(SEQ ID NO：3)的外显子1中的TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)。工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基结合识别序列的第一识别半位点并包含第一高变(HVR1)区，并且其中所述第二亚基结合识别序列的第二识别半位点并包含第二高变(HVR2)区，该区与对应于当前公开的TRC 1-2L.1592(其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示)的残基24-79的氨基酸序列具有至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性，或者与对应于当前公开的TRC1-2L.1775大范围核酸酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示)的残基24-79的氨基酸序列具有至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性。

在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基24-79的氨基酸序列，具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸置换。

在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO：7的残基24、26、42、44、46、48、50、70、71、72和73的残基。

在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO：8的残基24、26、38、42、46、48、50和70的残基。

在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。

在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO：7的残基48、50、71、72和73的残基。

在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO：8的残基48和50的残基。

在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、48、50、68、70、71、72、73、75和77的残基。

在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQ ID NO：7或8的残基66的残基处包含Y、R、K或D。

在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO：7或8的残基24-79。

在特定实施方式中，第二亚基包含与对应于SEQ ID NO：7或8的残基7-153的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基包含与对应于SEQ ID NO：7的残基7-153的氨基酸序列具有至少93％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基包含与对应于SEQ ID NO：8残基7-153的氨基酸序列具有至少94％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基7-153的氨基酸序列，具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸置换。

在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO：7或8的残基19的残基处包含G、S或A。

在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO：7或8的残基80的残基处包含E、Q或K。

在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基80的残基。

在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基139的残基。

在特定实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO：7或8的残基7-153。

在一些这样的实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO：7或8的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％、至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基215-270的氨基酸序列，具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸置换。

在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO：7的残基219和231的残基。

在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。

在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO：7或8的残基257的残基处包含Y、R、K或D。

在特定实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO：7或8的残基215-270。

在一些实施方式中，第一亚基包含与对应于SEQ ID NO：7或8的残基198-344的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基包含与对应于SEQ ID NO：7或8的残基198-344的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ IDNO：7或8的残基198-344的氨基酸序列，具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸置换。

在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO：7或8的残基210的残基处包含G、S或A。

在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO：7或8的残基271的残基处包含E、Q或K。

在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基271的残基。

在特定实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO：7或8的残基198-344。

在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶的第一亚基与对应于SEQ ID NO：7或8的残基198-344的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性，而第二亚基包含与对应于SEQ ID NO：7或8的残基7-153的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方式中，所述工程化大范围核酸酶的第一亚基与对应于SEQ ID NO：7或8的残基198-344的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性，而所述第二亚基包含与对应于SEQ ID NO：7或8的残基7-153的氨基酸序列具有至少93％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一亚基和/或所述第二亚基分别相对于SEQ ID NO：7和8的残基198-344和残基7-153可包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸置换。

在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含接头，其中所述接头共价接合所述第一亚基和所述第二亚基。

在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列具有至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQID NO：8的氨基酸序列具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。

在特定实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列。

在一些实施方式中，与如SEQ ID NO：9所示的TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶相比，工程化大范围核酸酶表现出以下优化特征中的至少一种：改善(即，增加)的特异性，减少的细胞内持续时间，和提高(即增加)的人TCRα恒定区基因的修饰效率。

在特定实施方式中，识别并切割人TCRα恒定区基因内包含SEQ ID NO：5的识别序列的工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基包含：(a)与SEQ IDNO：7或8的残基198-344具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列；和(b)与对应于SEQ ID NO：7或8的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的HVR1区；其中第二亚基包含：(a)与SEQ ID NO：7或8的残基7-153具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列；和(b)与对应于SEQ ID NO：7或8的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的HVR2区。

在特定实施方式中，识别并切割人TCRα恒定区基因内包含SEQ ID NO：5的识别序列的工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基包含：(a)与SEQ IDNO：7或8的残基198-344具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列；和(b)HVR1区，其与对应于SEQ ID NO：7或8的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性，并且包含对应于SEQ IDNO：7或8的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基；且其中所述第二亚基包含：(a)与SEQ ID NO：7或8的残基7-153具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列；和(b)HVR2区，其与对应于SEQ ID NO：7或8的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性，且包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在这些实施方式中，HVR2区可进一步包含对应于SEQ IDNO：7的残基48、50、71、72和73的残基和/或对应于SEQ ID NO：8的残基48和50的残基。

在特定实施方式中，识别并切割人TCRα恒定区基因内包含SEQ ID NO：5的识别序列的工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基包含：(a)与SEQ IDNO：7或8的残基198-344具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列；和(b)HVR1区，其与对应于SEQ ID NO：7或8的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性，并且包含对应于SEQ IDNO：7或8的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基；其中所述第二亚基包含：(a)与SEQ ID NO：7或8的残基7-153具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列；和(b)HVR2区，其与对应于SEQ IDNO：7或8的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性，并包含对应于SEQ ID NO：7或8的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、48、50、68、70、71、72、73、75和77的残基。

在其他实施方式中，识别并切割人TCRα恒定区基因内包含SEQ ID NO：5的识别序列的工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基包含：(a)与SEQ IDNO：7或8的残基198-344具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列；(b)具有对应于SEQ ID NO：7或8的残基215-270的氨基酸序列的HVR1区；其中所述第二亚基包含：(a)与SEQ ID NO：7或8的残基7-153具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列；和(b)具有对应于SEQ ID NO：7或8的残基24-79的氨基酸序列的HVR2区。

在另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其包含编码本文所述的工程化大范围核酸酶的核酸序列。

在一些实施方式中，多核苷酸是mRNA。

在其他实施方式中，mRNA是编码本文描述的工程化大范围核酸酶和至少一种另外的多肽或核酸的多顺反子mRNA。

在另一方面，本发明提供了包含本文所述的多核苷酸的重组DNA构建体。

在某些实施方式中，重组DNA构建体编码病毒载体。在特定的实施方式中，病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。在具体的实施方式中，病毒载体是重组AAV载体。

在另一方面，本发明提供了包含本文所述的多核苷酸的病毒载体。

在某些实施方式中，病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或AAV载体。在特定的实施方式中，病毒载体是重组AAV载体。

在另一方面，本发明提供了一种产生遗传修饰的真核细胞的方法，其包含插入到所述真核细胞的染色体中的外源目的序列。该方法包括将一种或多种核酸引入真核细胞中，所述核酸包括：(a)编码本文所述的工程化大范围核酸酶的第一核酸，其中所述工程化大范围核酸酶在所述真核细胞中表达；和(b)包含所述目的序列的第二核酸；其中工程化大范围核酸酶在染色体中在包含SEQ ID NO：5的识别序列处产生切割位点；且其中所述目的序列在切割位点处插入染色体中。

在该方法的某些实施方式中，所述第二核酸还包含与切割位点侧翼的序列同源的序列，并且通过同源重组将所述目的序列在切割位点处插入。

在该方法的某些实施方式中，所述第二核酸不包含与在切割位点侧翼的序列同源的序列，并且所述目的序列通过非同源插入而在切割位点处插入。

在该方法的某些实施方式中，与未修饰的对照细胞相比，内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的细胞表面表达降低。

在该方法的一些实施方式中，真核细胞是人T细胞或由其衍生的细胞，或人NK细胞或由其衍生的细胞。

在该方法的一些实施方式中，所述目的序列包含嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的编码序列。在该方法的特定实施方式中，嵌合抗原受体或外源性T细胞受体包含对肿瘤特异性抗原具有特异性的细胞外配体结合结构域。

在该方法的一些实施方式中，至少所述第一核酸通过mRNA引入真核细胞中。

在该方法的某些实施方式中，至少所述第二核酸通过病毒载体引入真核细胞中。在该方法的特定实施方式中，病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或AAV载体。在该方法的具体实施方式中，病毒载体是重组AAV载体。

在另一方面，本发明提供了一种产生遗传修饰的真核细胞的方法，其包含插入所述真核细胞的染色体中的外源目的序列。该方法包括：(a)将本文所述的工程化大范围核酸酶引入真核细胞中；和(b)将包含所述目的序列的核酸引入所述真核细胞中；其中所述工程化大范围核酸酶在染色体中包含SEQ ID NO：5的识别序列处产生切割位点；且其中所述目的序列在切割位点处插入染色体中。

在该方法的某些实施方式中，核酸还包含与切割位点侧翼的序列同源的序列，并且所述目的序列通过同源重组在切割位点处插入。

在该方法的某些实施方式中，核酸不包含与在切割位点侧翼的序列同源的序列，并且通过非同源插入将所述目的序列在切割位点处插入。

在该方法的某些实施方式中，与未修饰的对照细胞相比，内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的细胞表面表达降低。

在该方法的一些实施方式中，真核细胞是人T细胞或由其衍生的细胞，或人NK细胞或由其衍生的细胞。

在该方法的一些实施方式中，目的序列包含嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的编码序列。在该方法的特定实施方式中，嵌合抗原受体或外源性T细胞受体包含对肿瘤特异性抗原具有特异性的细胞外配体结合结构域。

在该方法的某些实施方式中，通过病毒载体将核酸引入真核细胞中。在该方法的特定实施方式中，病毒载体是腺病毒载体，慢病毒载体，逆转录病毒载体或AAV载体。在该方法的具体实施方式中，病毒载体是重组AAV载体。

在另一方面，本发明提供了一种通过破坏真核细胞染色体中的靶序列来产生遗传修饰的真核细胞的方法。该方法包括将编码本文所述的工程化大范围核酸酶的核酸引入真核细胞中，其中所述工程化大范围核酸酶在所述真核细胞中表达，并且其中所述工程化大范围核酸酶在染色体中在包含SEQ ID NO：5的识别序列处产生切割位点，并且其中靶序列通过切割位点处的非同源末端连接所破坏。

在该方法的某些实施方式中，与未修饰的对照细胞相比，内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的细胞表面表达降低。

在该方法的一些实施方式中，真核细胞是人T细胞或由其衍生的细胞，或人NK细胞或由其衍生的细胞。

在该方法的一些实施方式中，核酸通过mRNA引入真核细胞。

在另一方面，本发明提供了一种通过破坏真核细胞染色体中的靶序列来产生遗传修饰的真核细胞的方法。该方法包括将本文所述的工程化的大范围核酸酶引入真核细胞中，其中所述工程化的大范围核酸酶在染色体中在包含SEQ ID NO：5的识别序列处产生切割位点，并且其中所述靶序列通过切割位点处的非同源末端连接所破坏。

在该方法的某些实施方式中，与未修饰的对照细胞相比，内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的细胞表面表达降低。

在该方法的一些实施方式中，真核细胞是人T细胞或由其衍生的细胞，或人NK细胞或由其衍生的细胞。

在另一方面，本发明提供了一种遗传修饰的真核细胞，其基因组中包含修饰的人T细胞受体α恒定区基因，其中所述修饰的人T细胞受体α恒定区基因包含插入T细胞受体α恒定区内的SEQ ID NO：5内的外显子1中的外源目的序列，且其中所述遗传修饰的真核细胞是使用本文所述的工程化大范围核酸酶通过本文所述的方法制备的。

在某些实施方式中，遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人T细胞或由其衍生的细胞，或遗传修饰的人NK细胞或由其衍生的细胞。

在某些实施方式中，目的序列包含嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的编码序列。在特定的实施方式中，嵌合抗原受体或外源性T细胞受体包含对肿瘤特异性抗原具有特异性的细胞外配体结合结构域。

在特定实施方式中，与未修饰的对照细胞相比，内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的细胞表面表达在遗传修饰的真核细胞上降低。

在特定的实施方式中，与如SEQ ID NO：9所示的TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶相比，遗传修饰的真核细胞包含工程化大范围核酸酶的减少的脱靶效应，和/或细胞中工程化大范围核酸酶的减少的持续时间。

在另一方面，本发明提供了一种遗传修饰的真核细胞，其包含在包含SEQ ID NO：5的识别序列处具有被破坏的靶序列的染色体，其中所述靶序列通过切割位点处的非同源末端连接所破坏，并且其中所述遗传修饰的真核细胞是使用本文所述的工程化大范围核酸酶通过本文所述的方法制备的。

在某些实施方式中，遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人T细胞或由其衍生的细胞，或遗传修饰的人NK细胞或由其衍生的细胞。

在特定的实施方式中，当与未修饰的对照细胞相比时，在遗传修饰的真核细胞上内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的细胞表面表达降低。

在特定实施方式中，与如SEQ ID NO:9所示的TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶相比，遗传修饰的真核细胞包含减少的工程化大范围核酸酶的脱靶效应，和/或在细胞中减少的持续时间。

在另一方面，本发明提供了遗传修饰的真核细胞的群体，其包含多个本文所述的遗传修饰的真核细胞。

在一些实施方式中，群体中至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或高达100％的细胞是本文所述的遗传修饰的真核细胞。

在特定的实施方式中，群体的遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人T细胞或由其衍生的细胞，或遗传修饰的NK细胞或由其衍生的细胞。

在某些实施方式中，群体的遗传修饰的真核细胞包含细胞表面嵌合抗原受体或外源性T细胞受体。在这些实施方式的一些中，嵌合抗原受体或外源性T细胞受体包含对肿瘤特异性抗原具有特异性的细胞外配体结合结构域。

在特定的实施方式中，与未修饰的对照细胞相比，群体的遗传修饰的真核细胞具有降低的内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的细胞表面表达。

在另一方面，本发明提供了可用于在有需要的受试者中治疗疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的如本文所述的遗传修饰的真核细胞或其群体。

在某些实施方式中，遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人T细胞或由其衍生的细胞，或遗传修饰的NK细胞或由其衍生的细胞，或群体由遗传修饰的人T细胞或由其衍生的细胞或遗传修饰的NK细胞或由其衍生的细胞组成。

在一些实施方式中，存在于遗传修饰的T细胞或其群体中的外源目的序列包含嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的编码序列。在某些特定的实施方式中，嵌合抗原受体或外源性T细胞受体包含对肿瘤特异性抗原具有特异性的细胞外配体结合结构域。

在一些实施方式中，与未修饰的对照细胞相比，遗传修饰的真核细胞上内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的细胞表面表达降低。

在另一方面，本发明提供了脂质纳米颗粒或脂质纳米颗粒制剂，其包含编码本文所述的至少一种工程化大范围核酸酶的mRNA。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒具有增加递送和T细胞的摄取的组成。

在另一方面，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的如本文所述的遗传修饰的真核细胞或其群体。

在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用本文所述的药物组合物。

在某些实施方式中，该方法是用于在有此需要的受试者中治疗癌症的免疫疗法。在一些这样的实施方式中，遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人T细胞或由其衍生的细胞，或遗传修饰的人NK细胞或由其衍生的细胞，并且存在于该遗传修饰的真核细胞中的外源目的序列包含嵌合抗原受体或外源性T细胞受体的编码序列，该受体包含对肿瘤特异性抗原具有特异性的细胞外配体结合结构域，并且与未修饰的对照细胞相比，内源性T细胞受体的细胞表面表达(例如α-/βT细胞受体)在遗传修饰的真核细胞上减少。

在该方法的一些实施方式中，癌症选自上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病。

在该方法的某些实施方式中，癌症选自B细胞起源的癌症、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤。

在该方法的特定实施方式中，B细胞起源的癌症选自B谱系急性淋巴母细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病，B细胞非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

在方法的特定实施方式中，受试者可以是哺乳动物，例如人。

在另一方面，本发明提供了用作药物的如本文所述的遗传修饰的细胞或其群体。本发明还提供了如本文所述的遗传修饰的细胞或其群体在制备用于治疗有需要的受试者的疾病的药物中的用途。在一个这样的方面，该药物可用于治疗癌症。

在另一方面，本发明提供了如本文所述的遗传修饰的细胞或其群体，其用于治疗疾病，优选地用于治疗癌症。

附图说明

图1.人T细胞受体α恒定区基因中的TRC 1-2识别序列。被本发明的工程化大范围核酸酶靶向的TRC 1-2识别序列包含两个识别半位点。每个识别半位点包含9个碱基对，由4个碱基对的中心序列隔开。TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)包含称为TRC1和TRC2的两个识别半位点。

图2.本发明的工程化大范围核酸酶包含两个亚基，其中包含HVR1区的第一亚基结合第一识别半位点(例如TRC1)，而包含HVR2区的第二亚基结合第二识别位点半站点(例如TRC2)。在其中工程化大范围核酸酶是单链大范围核酸酶的实施方式中，可以将包含HVR1区的第一亚基定位为N端或C端亚基。同样，可以将包含HVR2区的第二亚基定位为N端或C端亚基。

图3.在CHO细胞中用于评估本发明的工程化大范围核酸酶的报道基因(reporter)试验的示意图。产生了CHO细胞系，其中报道基因盒被稳定地整合到细胞的基因组中。报道基因盒按5'至3'顺序包含：SV40早期启动子；GFP基因的5'侧2/3；本发明的工程化大范围核酸酶的识别序列(例如TRC 1-2识别序列)；CHO 23/24大范围核酸酶的识别序列(WO/2012/167192)；和GFP基因的3'侧2/3。在没有DNA断裂诱导物的情况下，用该盒稳定转染的细胞不表达GFP。通过编码每种大范围核酸酶的质粒DNA或mRNA的转导来引入大范围核酸酶。当在任一大范围核酸酶识别序列处诱导DNA断裂时，GFP基因的重复区域彼此重组以产生功能性GFP基因。然后可以通过流式细胞术确定表达GFP的细胞的百分比，作为大范围核酸酶的基因组切割频率的间接测量。

图4.在CHO细胞报道基因试验中，工程化大范围核酸酶识别和切割TRC 1-2识别序列的效率。TRC 1-2L.1592，TRC 1-2L.1775和TRC 1-2L.1843大范围核酸酶经过工程化以靶向TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)，并在CHO细胞报道基因试验中进行了功效筛选。显示的结果提供了观察到的表达GFP的细胞的百分比，其表明每种大范围核酸酶切割靶标识别序列或CHO 23/24识别序列的功效。阴性对照(bs)和第一代TRC 1-2x.87EE进一步包含在试验中以进行比较。A)评估TRC 1-2L.1592的CHO报道基因试验。B)评估TRC 1-2L.1775的CHO报道基因试验。C)评估TRC 1-2L.1843的CHO报道基因试验。

图5.在CHO细胞报道基因试验中，工程化大范围核酸酶识别和切割TRC Off1识别序列(SEQ ID NO：16)和TRC Off2识别序列(SEQ ID NO：17)的效率。将编码本发明的TRC 1-2大范围核酸酶的mRNA转染到CHO报道基因细胞中，该报道基因细胞含有GFP直接重复序列之间的反选择的Off1识别序列或Off2识别序列，以及CHO 23-24识别序列。在每个试验中，将第二代大范围核酸酶与第一代TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶进行了比较。A)通过TRC 1-2L.1592和TRC 1-2x.87EE切割脱靶识别序列。B)通过TRC 1-2L.1775和TRC 1-2x.87EE切割脱靶识别序列。C)通过TRC 1-2L.1843和TRC 1-2x.87EE切割脱靶识别序列。

图6.在CHO细胞报道基因试验中，工程化大范围核酸酶识别和切割TRC 1-2识别序列的效率。TRC 1-2x.87EE(第一代)，TRC 1-2L.1108(中间体)和TRC 1-2L.1469(中间体)大范围核酸酶经工程化以靶向TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO:5)，并在核转染后第2、5和7天在CHO细胞报道基因试验中进行功效筛选以确定毒性。显示的结果提供了在7天的分析期中观察到的表达GFP的细胞的百分比，其表明每种大范围核酸酶切割靶识别序列或CHO 23/24识别序列的作为时间的函数的功效。

图7.在CHO细胞报道基因试验中，工程化大范围核酸酶识别和切割TRC 1-2识别序列的效率。将第二代TRC1-2L.1592，TRC1-2L.1775和TRC1-2L.1843大范围核酸酶优化用于靶向TRC1-2识别序列(SEQ ID NO：5)，并且在核转染后第2、5和7天在CHO细胞报道基因试验中筛选功效以确定毒性。该分析还包括第一代TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶和中间体TRC1-2L.1469大范围核酸酶用于比较。显示的结果提供了在7天的分析过程中观察到的表达GFP的细胞的百分比，表明每种大范围核酸酶切割靶标识别序列或CHO 23/24识别序列的作为时间函数的功效。

图8.在CHO细胞报道基因试验中，工程化大范围核酸酶识别和切割TRC Off1和Off2识别序列的效率。在CHO细胞报道基因试验中，第一代TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶，中间体TRC 1-2L.1469大范围核酸酶和第二代TRC 1-2L.1592、TRC 1-2L.1775和TRC 1-2L.1843大范围核酸酶在包含TRC Off1(SEQ ID NO：16)或Off2(SEQ ID NO：17)识别序列的CHO GFFP报道细胞中在核转染后第2、5和7天筛选功效以确定毒性。显示的结果提供了在7天的分析期中观察到的GFP表达细胞的百分比。A)Off1识别序列的切割。B)Off2识别序列的切割。

图9.作为对潜在有效脱靶位点数量的度量的寡核苷酸捕获数据的图形可视化。基于在该位点处捕获的探针寡核苷酸的独特序列阅读片段的数量，绘制由特定核酸酶产生的每个脱靶切割。对于每种测试的大范围核酸酶(带圆圈)，预期位点(即TRC 1-2识别序列)具有最高的阅读片段计数。

图10.寡核苷酸捕获数据的图形可视化，其中脱靶位点根据其在X轴上的比对阅读片段数进行了绘制，且与预期位点相比的错配碱基对的数量由颜色表示，深色表示脱靶和预期的结合位点之间更接近的总体匹配。方框表示最高置信度的区域。

图11.总结了使用第一代TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶，中间体TRC 1-2L.1469大范围核酸酶或第二代TRC 1-2L.1592、TRC 1-2L.1775和TRC 1-2L.1843大范围核酸酶生成的CAR T细胞的体外分析的表格。筛选了大范围核酸酶的基因编辑效率、编辑后扩增和分化潜力。从获自三个不同的健康人类供体的细胞制备CAR T细胞，并由三个不同的操作者进行实验。

图12.从三个不同的健康人类供体获得的T细胞群体中产生的寡核苷酸捕获数据的图形可视化。

图13.使用第一代TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶或第二代TRC 1-2L.1592、TRC 1-2L.1775和TRC 1-2L.1843大范围核酸酶生成的CAR T细胞的体外分析。A)编辑后第0、4和8天的细胞总数。B)在编辑后第0、4和8天的已编辑细胞(即TCR阴性)的总数。C)编辑后第0、4和8天的TCR阴性/CAR阳性细胞的总数。

图14.与携带抗原的靶细胞共培养后CAR T细胞的扩增。将CAR T细胞与CD19+肿瘤系Raji或Nalm6以1：1和1：2的E：T比率共培养5天后评估其扩增。细胞输入编号由虚线标识。

图15.与携带抗原的靶细胞共培养后的CAR T细胞扩增。将CAR T细胞与Raji CD19+肿瘤细胞系以1：2的E：T比共培养5天后，评估其扩增。A)与Raji细胞共培养后，培养中CAR阳性细胞的总数。B)CAR T细胞与Raji细胞共培养后，培养物中剩余的CD19阳性细胞的总数。

图16.与携带抗原的靶细胞共培养2天后，CAR T细胞细胞因子分泌到培养上清液中。CAR T细胞与CD19+肿瘤细胞系Raji或Nalm6以1：1和1：2的E：T比共培养后，评估细胞因子的分泌。CD19阴性的K562骨髓性白血病细胞用作对照。A)IL-2分泌。B)TNF-α分泌。C)INF-γ分泌。D)颗粒酶B的分泌。E)穿孔素分泌。

图17.CAR T细胞中大范围核酸酶表达的蛋白质印迹分析。细胞用编码TRC 1-2x.87EE或TRC 1-2L.1592大范围核酸酶的mRNA电穿孔，然后用重组AAV6载体转导，该载体带有编码设计用于在TRC 1-2位点处插入的抗CD19 CAR的供体模板。在电穿孔后6小时、24小时、48小时、96小时和168小时，通过蛋白质印迹分析确定大范围核酸酶蛋白表达。激活来自同一供体的模拟细胞，并在与核酸酶处理组相同的培养基中培养和在核酸酶处理组电穿孔后24小时收获。

图18.在使用TRC 1-2x.87EE或TRC 1-2L.1592大规模CAR T制造过程运行中的第0、3、8(CD3阳性细胞耗竭之前和之后)和13天的活细胞的总数。

图19.在使用TRC 1-2x.87EE或TRC 1-2L.1592的大规模CAR T制造过程运行的第8天存活CD3阴性细胞的总数。

图20.在使用TRC 1-2x.87EE或TRC 1-2L.1592大规模CAR T制造过程运行的第8天(CD3阳性细胞耗竭之前和之后)和第13天CAR阳性的CD3阴性细胞的百分比。

SEQ ID NO：1列出了来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的野生型I-CreI大范围核酸酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2列出了LAGLIDADG基序的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3列出了人T细胞受体α恒定区基因(NCBI基因ID号28755)的核酸序列。

SEQ ID NO：4列出了由人T细胞受体α恒定区基因编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5列出了TRC 1-2识别序列的有义链的核酸序列。

SEQ ID NO：6列出了TRC 1-2识别序列的反义链的核酸序列。

SEQ ID NO：7列出了TRC 1-2L.1592大范围核酸酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8列出了TRC 1-2L.1775大范围核酸酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9列出了TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10列出了TRC 1-2L.1592大范围核酸酶TRC1结合亚基的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11列出了TRC 1-2L.1775大范围核酸酶TRC1结合亚基的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12列出了TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶TRC1结合亚基的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13列出了TRC 1-2L.1592大范围核酸酶TRC2结合亚基的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14列出了TRC 1-2L.1775大范围核酸酶TRC2结合亚基的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15列出了TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶TRC2结合亚基的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16列出了Off1识别序列的核酸序列。

SEQ ID NO：17列出了Off2识别序列的核酸序列。

SEQ ID NO：18列出了多肽接头的氨基酸序列。

具体实施方式

1.1参考和定义

本文所指的专利和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识。本文中引用的已发布的美国和非美国专利，许可的申请，已公开的美国、非美国和PCT申请，共同拥有和共同待决的未公开的美国专利申请，已公开的外国申请，以及科学、技术和医学参考，包括GenBank数据库序列、公共基因和蛋白质数据库登录号或代码(以及与其相关的核酸和/或氨基酸序列)在此以如同各自具体地和单独地指示为通过参考并入一样的程度通过参考并入。

本发明可以以不同的形式实施，并且不应被解释为限于在本文中阐述的实施方式。而是，提供这些实施例以使得本公开将是透彻和完整的，并将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。例如，关于一个实施方式阐明的特征可以被并入其他实施方式中，并且关于特定实施方式阐明的特征可以从该实施方式中删除。另外，根据本公开内容，本文提出的实施方式的多种变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，其不背离本发明。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员截至优先权日通常所理解的相同含义。本文在本发明的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于限制本发明。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容均通过引用并入本文。

如本文所用，“一/一个(a/an)”或“该”可以表示一个或多于一个。例如，“一个”细胞可以表示单个细胞或多个细胞。

如本文中所使用，除非另有明确指示，否则词语“或”以“和/或”的包括性含义而不是“任一/或(either/or)”的排他性的含义使用。

如本文所用，术语“核酸内切酶”是指切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。

如本文所用，关于双链DNA，术语“切割”或“裂解”是指核酸内切酶介导的靶序列内的识别序列主链内的磷酸二酯键的水解，其导致靶序列内的双链断裂，在本文中称为“切割位点”。取决于内切核酸酶，切割可产生具有平末端的双链片段或具有5'或3'碱基突出端的片段。

如本文所用，术语“大范围核酸酶”是指在大于12个碱基对的识别序列处结合双链DNA的核酸内切酶。在一些实施方式中，本公开的大范围核酸酶的识别序列是22个碱基对。大范围核酸酶可以是衍生自I-CreI的核酸内切酶，并且可以指相对于天然I-CreI在例如DNA结合特异性、DNA切割活性、DNA结合亲和力或二聚化特性方面已被修饰的I-CreI的工程化变体。产生I-CreI的这种修饰变体的方法是本领域已知的(例如WO 2007/047859，其全部内容通过引用并入本文)。如本文所用，大范围核酸酶作为异二聚体结合双链DNA。大范围核酸酶也可以是“单链大范围核酸酶”，其中一对DNA结合结构域使用肽接头接合成单个多肽。术语“归巢核酸内切酶”与术语“大范围核酸酶”同义。当在本文所述的靶细胞中，特别是在人T细胞中表达时，本公开的大范围核酸酶基本上是非毒性的，使得细胞可以转染并在37℃下维持，而没有观察到对整体细胞存活力的显著有害影响或当使用本文所述的方法测量时，大范围核酸酶切割活性的显著降低。

如本文所用，术语“单链大范围核酸酶”是指包含通过接头连接的一对核酸酶亚基的多肽，使得该亚基在功能上像异二聚体一样相互作用以切割双链识别位点。单链大范围核酸酶具有以下组织：N末端亚基–接头–C末端亚基。两个大范围核酸酶亚基通常在氨基酸序列上是不同的，并且识别在识别序列内的不相同的DNA半位点。因此，单链大范围核酸酶通常切割假回文或非回文识别序列。单链大范围核酸酶可以被称为“单链异二聚体”或“单链异二聚体大范围核酸酶”，尽管其实际上不是二聚的。为了清楚起见，除非另有说明，否则术语“大范围核酸酶”可以指二聚或单链大范围核酸酶。

如本文所用，术语“接头”是指用于将两个大范围核酸酶亚基连接成单个多肽的外源肽序列。接头可以具有在天然蛋白质中发现的序列，或者可以是未在任何天然蛋白质中发现的人工序列。接头可以是柔性的并且缺乏二级结构，或者可以倾向于在生理条件下形成特定的三维结构。接头可包括但不限于美国专利号8,445,251、9,340,777、9,434,931和10,041,053所涵盖的任何接头，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，接头可以与SEQ ID NO：18具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性，SEQ IDNO：18示出了SEQ ID NO：7或8的残基154-195。在一些实施方式中，接头可具有包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列，其示出了SEQ ID NO：7或8的残基154-195。

如本文所用，就蛋白质而言，术语“重组”或“工程化”是指由于将遗传工程技术应用于编码蛋白质的核酸以及表达该蛋白质的细胞或生物而具有改变的氨基酸序列。关于核酸，术语“重组”或“工程化”是指由于应用遗传工程技术而具有改变的核酸序列。遗传工程技术包括但不限于PCR和DNA克隆技术；转染、转化和其他基因转移技术；同源重组；定点诱变；和基因融合。根据该定义，具有与天然存在的蛋白质相同的氨基酸序列但通过克隆和在异源宿主中表达产生的蛋白质不被认为是重组的。

如本文所用，术语“野生型”是指相同类型基因的等位基因群体中最常见的天然存在的等位基因(即多核苷酸序列)，其中由野生型等位基因编码的多肽具有其原始功能。术语“野生型”也指由野生型等位基因编码的多肽。野生型等位基因(即多核苷酸)和多肽与突变体或变体等位基因和多肽是可区分的，其相对于野生型序列包含一个或多个突变和/或置换。尽管野生型等位基因或多肽可以在生物体中赋予正常表型，但突变体或变体等位基因或多肽在某些情况下可以赋予改变的表型。野生型核酸酶与重组或非天然存在的核酸酶是可区分的。术语“野生型”还可以指具有特定基因的野生型等位基因的细胞、生物体和/或受试者，或用于比较目的的细胞、生物体和/或受试者。

如本文所用，术语“遗传修饰的”是指其中或在其祖先中通过重组技术有意修饰基因组DNA序列的细胞或生物体。如本文所用，术语“遗传修饰的”涵盖术语“转基因的”。

如本文关于重组蛋白质所用，术语“修饰”是指相对于参考序列(例如野生型或天然序列)，重组序列中氨基酸残基的任何插入、删除或置换。

如本文所用，术语“识别序列”或“识别位点”是指被核酸内切酶结合并切割的DNA序列。在大范围核酸酶的情况下，识别序列包含由四个碱基对隔开的一对反向的9个碱基对“半位点”。在单链大范围核酸酶的情况下，蛋白质的N端结构域接触第一半位点，而蛋白质的C端结构域接触第二半位点。大范围核酸酶的切割产生四个碱基对3’“突出端”。“突出端”或“粘性末端”是短的单链DNA片段，其可以通过双链DNA序列的核酸内切酶切割产生。在衍生自I-CreI的大范围核酸酶和单链大范围核酸酶的情况下，突出端包含22个碱基对识别序列的碱基10-13。

如本文所用，术语“靶位点”或“靶序列”是指细胞的染色体DNA的区域，其包含核酸酶的识别序列。

如本文所用，术语“DNA结合亲和力”或“结合亲和力”是指大范围核酸酶与参考DNA分子(例如识别序列或任意序列)非共价缔合的趋势。结合亲和力通过解离常数Kd测量。如本文所用，相对于参考核酸酶，如果核酸酶对参考识别序列的Kd按统计学显著的百分比变化或生物学显著的量(例如至少2x或者2x至10x)增加或减少，则核酸酶具有“改变的”结合亲和力。

如本文所用，术语“特异性”是指核酸酶仅在称为识别序列的特定碱基对序列处或仅在特定的识别序列组处识别和切割双链DNA分子的能力。该识别序列组共有某些保守位置或序列基序，但是可以在一个或多个位置上简并。高度特异性的核酸酶能够切割仅一个或非常少数的识别序列。特异性可以通过本领域已知的任何方法来确定。

如本文所用，如果核酸酶结合并切割在生理条件下不与参考核酸酶(例如野生型)结合和切割的识别序列，或者如果相对于参考核酸酶，识别序列的切割速率按生物学显著的量(例如至少2x或者2x-10x)增加或减少，则核酸酶具有“改变的”特异性。

在一些实施方式中，与TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)相比，本文公开的工程化大范围核酸酶对包含SEQ ID NO：5(即TRC 1-2)的靶识别序列具有改善的(即增加的)特异性。因此，在某些实施方式中，与TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶相比，本文公开的工程化大范围核酸酶表现出减少的脱靶切割。可以使用本领域已知的任何方法来测量大范围核酸酶的脱靶切割，包括例如本文所述的寡核苷酸捕获分析、T7核酸内切酶I(T7E)试验、数字PCR，特定脱靶位点的靶向测序、外显子组测序、全基因组测序、抗生蛋白链菌素上的直接原位断裂标记富集和下一代测序(BLESS)、通过测序实现的全基因组范围的无偏DSB鉴定(GUIDE-seq)和线性扩增介导的高通量全基因组易位测序(LAM-HTGTS)(参见例如Zischewski等(2017)Biotechnology Advances 35(1):95-104，其全部内容通过引用并入全文)。

如本文所用，术语“同源重组”或“HR”是指天然的细胞过程，其中使用同源DNA序列作为修复模板来修复双链DNA断裂(参见例如Cahill等(2006),Front.Biosci.11:1958-1976)。同源DNA序列可以是递送至细胞的内源染色体序列或外源核酸。

如本文所用，术语“非同源末端连接”或“NHEJ”是指天然的细胞过程，其中通过两个非同源DNA片段的直接接合来修复双链DNA断裂(参见例如Cahill等(2006),Front.Biosci.11:1958-1976)。通过非同源末端连接进行的DNA修复是易错的，并经常导致修复位点处DNA序列的非模板化添加或删除。在一些情况下，在靶标识别序列处的切割导致在靶标识别位点处的NHEJ。核酸酶诱导的基因编码序列中靶位点的切割和然后通过NHEJ的DNA修复可将破坏基因功能的突变(例如移码突变)引入编码序列中。因此，工程化核酸酶可用于有效敲除细胞群体中的基因。如本文所用，“破坏靶序列”是指引入干扰基因功能并阻止由此编码的多肽/表达产物的表达和/或功能的突变(例如移码突变)。

如本文所用，“同源臂”或“与大范围核酸酶切割位点侧翼的序列同源的序列”是指核酸分子的5’和3’端侧翼的序列，其促进核酸分子插入到由大范围核酸酶产生的切割位点中。通常，同源臂的长度可以是至少50个碱基对，优选至少100个碱基对，和多达2000个碱基对或更多，并且可以与它们在基因组中的相应序列具有至少90％，优选至少95％或更高的序列同源性。

如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指将对抗原的特异性赋予或移植到免疫效应细胞(例如人T细胞)上的工程化受体。嵌合抗原受体通常包含至少细胞外配体结合结构域或部分以及胞内结构域，所述胞内结构域包含一个或多个信号传导结构域和/或共刺激结构域。

在一些实施方式中，细胞外配体结合结构域或部分为衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的形式，其提供对于特定表位或抗原(例如优先存在于细胞(例如癌细胞或其他致病细胞或颗粒)的表面上的表位或抗原)的特异性。在一些实施方式中，scFv通过接头序列连接。在各种实施方式中，细胞外配体结合结构域对任何目的抗原或表位具有特异性。在一些实施方式中，scFv是鼠的、人源化的或完全人的。

嵌合抗原受体的细胞外结构域还可包含自身抗原(参见Payne等(2016),Science353(6295):179-184)，该抗原可被B淋巴细胞上的自身抗原特异性B细胞受体识别，从而在抗体介导的自身免疫性疾病中指导T细胞特异性地靶向并杀死自身反应性B淋巴细胞。这样的CAR可以被称为嵌合自身抗体受体(CAAR)，并且它们的用途被本发明涵盖。

嵌合抗原受体的细胞外结构域还可以包含目的抗原的天然存在的配体，或保留结合目的抗原的能力的天然存在的配体的片段。

细胞内刺激结构域可以包含一个或多个在抗原结合后将激活信号传递至免疫效应细胞的细胞质信号传导结构域。这样的细胞质信号传导结构域可以包含但不限于CD3。细胞内刺激结构域还可包含一个或多个在配体结合后传递增殖和/或细胞存活信号的细胞内共刺激结构域。这样的细胞内共刺激结构域可以是本领域已知的任何结构域，并且可以包含但不限于CD27，CD28，CD8，4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能-相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3和与CD83、N1、N6或其任何组合特异性结合的配体。

嵌合抗原受体可以进一步包含其他结构元件，包含通过铰链或间隔区序列与细胞外配体结合结构域连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以源自任何膜结合的或跨膜的蛋白质。例如，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基(即构成CD3复合物的α、β、γ或ζ多肽)，IL2受体p55(a链)，p75(β链)或γ链，Fc受体(例如Fcγ受体III)或CD蛋白的亚基链(例如CD8α链)。可选地，跨膜结构域可以是合成的，并且可以主要包含疏水残基(例如亮氨酸和缬氨酸)。

铰链区是指具有将跨膜结构域连接至细胞外配体结合结构域的功能的任何寡肽或多肽。例如，铰链区可包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。铰链区可以衍生自天然存在分子的全部或部分，例如衍生自CD8、CD4或CD28的细胞外区域的全部或部分，或衍生自抗体恒定区的全部或部分。可选地，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或者可以是完全合成的铰链序列。在特定实例中，铰链结构域可包含人CD8α链、FcγRIIIa受体或IgG1的一部分。

如本文所用，“外源性T细胞受体”或“外源TCR”是指其序列被引入可能或可能不内源表达TCR的免疫效应细胞(例如人T细胞)的基因组中的TCR。外源TCR在免疫效应细胞上的表达可赋予对特定表位或抗原(例如优先存在于癌细胞或其他引起疾病的细胞或颗粒的表面上的表位或抗原)的特异性。这样的外源性T细胞受体可包含α和β链，或者可选地，可包含γ链和δ链。可用于本发明的外源TCR可对任何目的抗原或表位具有特异性。

如本文所用，术语“减少的表达”是指与对照细胞相比，遗传修饰的T细胞的细胞表面上内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)表达的任何减少。术语减少的还可以指与对照细胞群体相比，细胞群体中在细胞表面上表达内源多肽(即内源T细胞受体)的细胞的百分比的减少。这样的减少可能高达5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或最高100％。因此，术语“减少的”包括内源性T细胞受体的部分敲减和完全敲减。内源性T细胞受体的细胞表面表达的敲除(即完全敲减)可以由使用本文所述的工程化大范围核酸酶对T细胞受体α恒定区基因进行基因的灭活而导致。由T细胞受体α恒定区基因编码的α恒定区对于内源性TCR复合物在细胞表面上的组装是必需的。因此，使用本文所述的工程化大范围核酸酶敲除T细胞受体α恒定区基因导致细胞表面T细胞受体表达的敲除。

如本文针对氨基酸序列和核酸序列两者所使用的，术语“百分比同一性”、“序列同一性”、“百分比相似性”、“序列相似性”等是指基于序列比对的两个序列相似性程度的量度，所述序列比对使比对的氨基酸残基或核苷酸之间的相似性最大化，并且其是相同或相似残基或核苷酸的数目、总的残基或核苷酸的数目以及序列比对中缺口的存在和长度的函数。多种算法和计算机程序可用于使用标准参数确定序列相似性。如本文所用，使用对于氨基酸序列的BLASTp程序和对于核酸序列的BLASTn程序测量序列相似性，这两种方法均可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，并且例如在Altschul等(1990),J.Mol.Biol.215:403-410；Gish and States(1993),Nature Genet.3:266-272；Madden等(1996),Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul等(1997),Nucleic Acids Res.25:33 89-3402)；Zhang等(2000),J.Comput.Biol.7(1-2):203-14中描述。如本文所使用的，两个氨基酸序列的百分比相似性是基于BLASTp算法的以下参数的得分：字长＝3；缺口开放罚分＝-11；缺口延伸罚分＝-1；评分矩阵＝BLOSUM62。如本文所用，两个核酸序列的百分比相似性是基于用于BLASTn算法的以下参数的得分：字长＝11；缺口开放罚分＝-5；缺口延伸罚分＝-2；匹配奖励＝1；错配罚分＝-3。

如本文所用，关于两种蛋白质或氨基酸序列的修饰，术语“对应于”用于指示第一蛋白质中的特定修饰是与第二蛋白质的修饰中相同的氨基酸残基的置换，并且当两个蛋白质进行标准序列比对时(例如使用BLASTp程序)，第一蛋白质中修饰的氨基酸位置与第二蛋白质中修饰的氨基酸位置相对应或对准。因此，如果残基X和Y在序列比对中彼此对应，则第一蛋白质中的残基“X”修饰为氨基酸“A”将对应于第二蛋白质中的残基“Y”修饰为氨基酸“A”，尽管X和Y可以是不同的数字。

如本文所用，术语“识别半位点”、“识别序列半位点”或简称“半位点”是指双链DNA分子中被同型二聚体或异二聚体大范围核酸酶的单体，或被单链大范围核酸酶的一个亚基识别的核酸序列。

如本文所用，术语“高变区”是指大范围核酸酶单体或亚基内的局部序列，其包含具有相对高变异性的氨基酸。高变区可包含约50-60个连续残基，约53-57个连续残基或优选约56个残基。在一些实施方式中，高变区的残基可以对应于SEQ ID NO：7或8的24-79位或215-270位。高变区可以包含一个或多个与识别序列中的DNA碱基接触的残基，并且可以修饰以改变单体或亚基的碱基偏好。高变区还可以包含一个或多个当大范围核酸酶与双链DNA识别序列结合时与DNA骨架结合的残基。这些残基可以修饰以改变大范围核酸酶对DNA骨架和靶标识别序列的结合亲和力。在本发明的不同实施方式中，高变区可以包含表现出变异性并且可以被修饰以影响碱基偏好和/或DNA结合亲和力的1-20个残基(其。在特定的实施方式中，高变区包含表现出变异性并且可以被修饰以影响碱基偏好和/或DNA结合亲和力的约15-20个残基。

在一些实施方式中，高变区内的可变残基对应于SEQ ID NO：7或8的位置24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77中的一个或多个。在一些实施方式中，高变区内的可变残基还对应于SEQ ID NO：7的位置48、50、71、72和73中的一个或多个。在一些实施方式中，在高变区内的可变残基还对应于SEQ ID NO：8的位置48和50中的一个或多个。在一些实施方式中，高变区内的可变残基对应于SEQ ID NO：7或8的位置24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、48、50、68、70、71、72、73、75和77中的一个或多个。

在其他实施方式中，高变区内的可变残基对应于SEQ ID NO：7或8的位置215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268中的一个或多个。

如本文所用，术语“T细胞受体α基因”或“TCRα基因”是可互换的，并且是指编码T细胞受体α亚基的T细胞中的基因座。在重排之前或之后，T细胞受体α可指NCBI基因ID号6955。重排后，T细胞受体α基因包含内源启动子、重排的V和J片段、内源剪接供体位点、内含子、内源剪接受体位点和T细胞受体α恒定区基因座(其包含编码亚基的外显子)。

如本文所用，术语“T细胞受体α恒定区”或“TCRα恒定区”是指T细胞受体α基因的编码序列。TCRα恒定区包含由NCBI Gen ID NO.28755确认的野生型序列及其功能变体。

术语“重组DNA构建体”、“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA片段”在本文中可互换使用，并且是单链或双链多核苷酸。重组构建体包含核酸片段的人工组合，包含但不限于自然界中未发现在一起的调控和编码序列。例如，重组DNA构建体可包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或衍生自相同来源并以与自然界中存在的方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。这样的构建体可以独自使用或与载体结合使用。

如本文所用，“载体”或“重组DNA载体”可以是如下的构建体，其包含复制系统和能够在给定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列。如果使用载体，则如本领域技术人员众所周知的，载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法。载体可包括但不限于质粒载体和重组病毒载体(例如AAV载体)或本领域已知的适于将编码本发明的大范围核酸酶的基因递送至靶细胞的任何其他载体。技术人员充分了解为了成功转化、选择和繁殖包含本发明的任何分离的核苷酸或核酸序列的宿主细胞而必须存在于载体上的遗传元件。

如本文所用，“载体”也可以指病毒载体。病毒载体可以包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体(AAV)。

如本文所用，“多顺反子”mRNA是指包含两个或更多个编码序列(即顺反子)并编码超过一种蛋白质的单个信使RNA。多顺反子mRNA可包含本领域已知的任何元件，以允许翻译来自相同mRNA分子的两个或更多个基因，所述元件包括但不限于IRES元件、T2A元件、P2A元件、E2A元件和F2A元件。

如本文所用，“人T细胞”或“T细胞”是指从供体特别是人供体分离的T细胞。T细胞和由其衍生的细胞包括未在培养中传代的分离的T细胞，在细胞培养条件下传代和维持但未永生化的T细胞，以及被永生化且可在细胞培养条件下无限期维持的T细胞。

如本文所用，“对照”或“对照细胞”是指提供用于测量遗传修饰的细胞的基因型或表型变化的参考点的细胞。对照细胞可包括例如：(a)野生型细胞，即与用于遗传改变的起始材料具有相同的基因型的细胞，所述遗传改变遗传修饰的细胞；(b)与遗传修饰的细胞具有相同基因型，但已经用无效构建体(即，对目的性状没有已知作用的构建体)转化的细胞；或(c)与遗传修饰的细胞在遗传上相同，但未暴露于会诱导改变的基因型或表型表达的条件或刺激或进一步的遗传修饰的细胞。

如本文所用，术语“治疗”或“治疗受试者”是指向患有疾病的受试者施用本发明的遗传修饰的T细胞或遗传修饰的T细胞群体。例如，受试者可以患有疾病(例如癌症)，并且治疗可以表示用于治疗该疾病的免疫疗法。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病的发展速度、改善或减轻疾病状态和缓解或改善预后。在一些方面，在治疗期间以本发明的药物组合物的形式施用本文所述的遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的真核细胞群体。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望的生物学和/或临床结果的量。治疗有效量将根据所使用的制剂或组合物，疾病及其严重程度以及要治疗的受试者的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。在具体的实施方式中，有效量的本发明遗传修饰的T细胞或遗传修饰的T细胞群体或本文公开的药物组合物减轻受试者中疾病的至少一种症状。在其中疾病是癌症的那些实施方式中，有效量的本文公开的工程化大范围核酸酶或药物组合物降低癌症的增殖或转移水平，引起癌症的部分或完全反应或缓解，或减轻受试者的至少一种癌症症状。

如本文所用，术语“癌症”应被理解为涵盖任何特征在于导致恶性生长或肿瘤的异常和不受控制的细胞分裂的肿瘤性疾病(无论是侵袭性还是转移性的)。

如本文所用，术语“上皮癌(carcinoma)”是指由上皮细胞组成的恶性生长。

如本文所用，术语“白血病”是指造血器官/系统的恶性肿瘤，并且通常以血液和骨髓中白细胞及其前体的异常增殖和发育为特征。

如本文所用，术语“肉瘤”是指由类似于胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，并且通常由包埋在原纤维、异质或同质物质中的紧密堆积的细胞组成。

如本文所用，术语“黑素瘤”是指源自皮肤和其他器官的黑素细胞系统的肿瘤。

如本文所用，术语“淋巴瘤”是指从淋巴细胞发展而来的一组血液细胞肿瘤。

如本文所用，术语“母细胞瘤”是指由前体细胞或母细胞(未成熟或胚胎组织)中的恶性肿瘤引起的癌症类型。

如本文所使用的，对变量的数值范围的叙述旨在传达可以在变量等于该范围内的任何值的情况下实施本发明。因此，对于固有地离散的变量，该变量可以等于数值范围内的任何整数值，包括该范围的端点。类似地，对于固有地连续的变量，该变量可以等于数值范围内的任何实数值，包括该范围的端点。例如但不限于，如果变量固有地是离散的，则描述为具有0到2之间的值的变量可以取值为0、1或2，并且如果变量固有地是连续的，则该变量可以取值0.0、0.1、0.01、0.001，或任何其他≥0且≤2的实数值。

本发明部分地基于优化的第二代大范围核酸酶的发现，其与亲本第一代大范围核酸酶相比具有改善的特性，例如提高的(即增加的)特异性和减少的脱靶切割，在从mRNA表达后减少的细胞中持续时间，在体外与人T细胞使用时改善的细胞特性，在大规模CAR T细胞制造过程中使用时改善的细胞特性。

像先前描述的TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶一样，这些优化的第二代大范围核酸酶识别TCRα恒定区基因的外显子1中的TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)。在该识别序列上的切割可以允许在切割位点处的NHEJ，并破坏人T细胞受体α链亚基的表达，从而导致T细胞受体在细胞表面的表达和/或功能降低。另外，在该识别序列上的切割可以进一步允许外源核酸序列直接同源重组到TCRα恒定区基因中。此类外源核酸序列可包含目的序列，例如编码嵌合抗原受体、外源TCR受体或任何其他目的多肽的序列。因此，目前公开的组合物和方法允许敲除内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)和表达外源核酸序列(例如嵌合抗原受体或外源TCR)。当施用于同种异体受试者时，此类细胞可表现出减少的移植物抗宿主疾病(GVHD)的诱导或不诱导。

本领域中已知可以使用位点特异性核酸酶在活细胞的基因组中制造DNA断裂，并且这种DNA断裂可以通过切割的靶位点与基因组内的相同或高度同源的DNA序列的同源重组而导致基因组的永久修饰。因此，在一些实施方式中，可以使用工程化的重组大范围核酸酶来实施本发明。

在特定的实施方式中，用于实施本发明的核酸酶是单链大范围核酸酶。单链大范围核酸酶包含通过接头肽连接的N端亚基和C端亚基。两个结构域的每一个识别识别序列的一半(即识别半位点)，并且DNA切割的位点在靠近两个亚基的界面的识别序列的中间处。DNA链断裂偏离四个碱基对，使得大范围核酸酶的DNA切割产生一对四个碱基对的3'侧单链突出端。

本发明的重组大范围核酸酶已经被工程化以识别和切割TCRα恒定区基因(SEQ IDNO：3)的外显子1内的TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)。本发明的工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，所述第一亚基包含第一高变(HVR1)区，所述第二亚基包含第二高变(HVR2)区。此外，第一亚基结合识别序列中的第一识别半位点(即TRC1半位点)，第二亚基结合识别序列中的第二识别半位点(即TRC2半位点)。在重组大范围核酸酶是单链大范围核酸酶的实施方式中，第一亚基和第二亚基可以定向为使得包含HVR1区并结合第一半位点的第一亚基被定位为N-末端亚基，和包含HVR2区并结合第二半位点的第二亚基被定位为C-末端亚基。在替代实施方式中，第一亚基和第二亚基可以定向为使得包含HVR1区并结合第一半位的第一亚基被定位为C-末端亚基，而包含HVR2区并结合第二半位点的第二亚基被定位为N-末端亚基。表1提供了识别和切割TRC 1-2识别序列的示例性工程化大范围核酸酶。

表1.识别和切割TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO:5)的示例性工程化大范围核酸酶

*“HVR1％”和“HVR2％”代表每个大范围核酸酶的分别HVR1区和HVR2区与TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的分别HVR1区和HVR2区之间的氨基酸序列同一性。

在一些实施方式中，与第一代大范围核酸酶TRC 1-2x.87EE相比，当前公开的工程化大范围核酸酶表现出至少一个优化的特性。这种优化的特征包括改善的(即增加的)特异性(导致减少的脱靶切割)，从mRNA表达后在细胞中减少的持续时间，以及增强的(即增加的)TCRα恒定区基因的切割和修饰效率。因此，在特定的实施方式中，在将当前公开的工程化大范围核酸酶递送至真核细胞群体时，其能够产生更大百分比的具有TCRα恒定区基因的切割和/或修饰的细胞。在这些实施方式的一些中，真核细胞群体包含至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更多的在TCRα恒定区基因中包含切割和/或插入/删除(“indel”)的真核细胞。可以使用本领域已知的任何方法来测量大范围核酸酶对TCRα恒定区基因的切割和/或修饰，包括T7核酸内切酶I试验、数字PCR、错配检测试验、错配切割试验、高分辨率熔解分析(HRMA)、异源双链迁移性试验、测序和荧光PCR毛细管凝胶电泳(参见，例如Zischewski等(2017)Biotechnology Advances35(1):95-104，其全部内容通过引用并入本文)。

在某些实施方式中，与第一代TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶相比，当前公开的工程化大范围核酸酶在细胞中表现出减少的持续时间，特别是当作为mRNA引入时。可以使用本领域已知的任何方法来测量细胞内mRNA或蛋白质的持久性，包括但不限于RT-PCR、RNA印迹分析、核酸酶保护试验、原位杂交、免疫细胞化学、免疫印迹和免疫沉淀。

本发明提供了使用工程化大范围核酸酶产生遗传修饰的T细胞及其群体的方法，所述工程化大范围核酸酶识别并切割在人TCRα恒定区基因(SEQ ID NO：3)中存在的识别序列。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些实施方式中，可以使用本领域中可用的任何数量的T细胞系。在本公开的一些实施方式中，T细胞是使用本领域技术人员已知的多种技术从从受试者收集的血液单位中获得的。在一个实施方式中，来自个体循环血液的细胞通过单采血液分离术(apheresis)获得。

修饰的T细胞受体α基因包含通过目前公开的工程化大范围核酸酶的双链切割插入到TCRα恒定区基因的第一外显子(即，靶标外显子)中的外源目的序列。由此类大范围核酸酶产生的切割位点可允许将外源目的序列直接同源重组到靶标外显子中。

如本文所用，就核苷酸序列而论的术语“外源的”或“异源的”意指纯合成的、源于外来物质的，或者如果来自相同物质，通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座上从其原生形式被实质上改变的序列。

在各种实施方式中，外源目的序列可包含目的蛋白质的编码序列。预想的是编码序列可以用于任何目的蛋白质。

在某些实施方式中，外源目的序列包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。通常，本公开的CAR将至少包含细胞外结构域和细胞内结构域。在一些实施方式中，细胞外结构域包含靶标特异性结合元件，另外称为配体结合结构域或部分。在一些实施方式中，细胞内结构域或胞质结构域包含至少一个共刺激结构域和一个或多个信号传导结构域，例如CD3ζ。

在一些实施方式中，可用于本发明的CAR包含细胞外靶标特异性结合元件，另外称为配体结合结构域或部分。配体结合结构域的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择配体结合结构域以识别用作在靶细胞上与特定疾病状态相关的细胞表面标志物的配体。因此，可以用作CAR中配体结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例可以包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫性疾病和癌细胞相关的那些。在一些实施方式中，可以通过特异性地结合肿瘤细胞上的抗原的期望配体结合部分的工程化的方式对CAR进行工程化以靶向肿瘤特异性目的抗原。在本公开的上下文中，“肿瘤抗原”或“肿瘤特异性抗原”是指特定的过度增殖性障碍例如癌症所共有的抗原。

在一些实施方式中，CAR的细胞外配体结合结构域对任何目的抗原或表位，特别是任何目的肿瘤抗原或表位具有特异性。作为非限制性实例，在一些实施方式中，靶标的抗原是肿瘤相关表面抗原，例如ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD40、CLL-1、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关抗原、B人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、prostase、prostase特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrin B2、胰岛素生长因子(IGFl)-l、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)以及腱生蛋白C的Al结构域(TnC A1)和成纤维细胞相关蛋白(fap)；谱系特异性或组织特异性抗原，例如CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD38、CD123、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、内皮糖蛋白、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF 17)、CS1；或病毒特异性表面抗原，例如HIV特异性抗原(例如HIVgp120)、EBV特异性抗原、CMV特异性抗原、HPV特异性抗原(例如E6或E7癌蛋白)、Lasse病毒特异性抗原、流感病毒特异性抗原，以及这些表面标志物的任何衍生物或变体。在本公开的特定实施方式中，配体结合结构域对CD19具有特异性。

在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞外结构域进一步包含自身抗原(参见，Payne等(2016)Science,Vol.353(6295):179-184)，其可以被B淋巴细胞上的自身抗原特异性B细胞受体识别，从而在抗体介导的自身免疫性疾病中指导T细胞特异性靶向并杀死自身反应性B淋巴细胞。这样的CAR可以称为嵌合自身抗体受体(CAAR)。

在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞外结构域可包含目的抗原的天然存在的配体或保留结合目的抗原的能力的天然存在的配体的片段。

在一些实施方式中，CAR包含跨膜结构域，所述跨膜结构域通过铰链或间隔区序列将细胞外配体结合结构域或自身抗原与细胞内信号传导和共刺激结构域连接。所述跨膜结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。例如，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基(即构成CD3复合物的α、β、γ或ζ多肽)，IL2受体p55(a链)，p75(β链)或γ链，Fc受体(例如Fcγ受体III)的亚基链或CD蛋白(例如CD8α链)。可替代地，所膜结构域可以是合成的，并且可以主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在特定的实施例中，所述跨膜结构域是CD8α跨膜多肽。

铰链区是指具有将跨膜结构域连接细胞外配体结合结构域的功能的任何寡聚或多肽。例如，铰链区可包含至多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。铰链区可以源自天然存在的分子的全部或部分，例如源自CD8、CD4或CD28的细胞外区域的全部或部分，或源自抗体恒定区的全部或部分。可替代地，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或者可以是完全合成的铰链序列。在特定实施例中，铰链结构域可包含人CD8α链、FcγRIIIa受体或IgG1的一部分。

CAR的细胞内信号传导结构域负责激活其中已放置CAR的细胞的至少一种正常效应子功能和/或激活增殖和细胞存活途径。术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。T细胞的效应子功能例如可以是溶细胞活性或辅助者活性，包括细胞因子的分泌。细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)可以响应于细胞外结构域的结合而向细胞提供激活信号。如所讨论的，激活信号可以诱导细胞的效应子功能，例如溶细胞活性或细胞因子分泌。

CAR的细胞内结构域可包括一个或多个细胞内共刺激结构域，其在细胞外结构域结合后传递共刺激信号以促进细胞增殖、细胞存活和/或细胞因子分泌。此类细胞内共刺激结构域包括本领域已知的那些，例如但不限于N1、N6、CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能-相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体。

CAR可以对任何类型的癌细胞具有特异性。此类癌症可包括但不限于上皮癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤、白血病、B细胞起源的癌症、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤。在某些实施方式中，B细胞起源的癌症包括但不限于B谱系急性淋巴母细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

目的序列可以进一步编码外源性T细胞受体(TCR)。这样的外源性T细胞受体可以包含α和β链，或者可选地可以包含γ和δ链。可用于本发明的外源TCR可对任何目的抗原或表位具有特异性。

在其他实施方式中，目的序列可以编码内源目的基因的野生型或修饰形式。

目的序列可以包含本领域已知的元件或肽以允许从同一启动子翻译两个以上基因，包括但不限于IRES元件和2A元件，例如T2A元件、P2A元件、E2A元件和F2A元件。在特定实施方式中，外源目的序列中的此类元件可位于编码目的蛋白质(例如CAR)的核酸序列的5'上游或3'下游。

本文所述的外源目的序列可以进一步包含另外的控制序列。例如，目标序列可以包含同源重组增强子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序列、转录终止序列、选择标记序列(例如抗生素抗性基因)、复制起点等。本文所述的目的序列也可包含至少一个核定位信号。核定位信号的实例在本领域中是已知的(参见例如Lange等,J.Biol.Chem.,2007,282:5101-5105)。

本发明的工程化大范围核酸酶可以以蛋白质的形式或优选作为编码工程化大范围核酸酶的核酸被递送到细胞中。这样的核酸可以是DNA(例如环状或线性化的质粒DNA或PCR产物)或RNA(例如mRNA)。对于其中工程化大范围核酸酶编码序列以DNA形式递送的实施方式，其应可操作地与启动子连接以促进大范围核酸酶基因的转录。适用于本发明的哺乳动物启动子包括组成型启动子(例如巨细胞病毒早期(CMV)启动子((Thomsen等(1984),Proc Natl Acad Sci USA.81(3):659-63))或SV40早期启动子((Benoist和Chambon(1981),Nature.290(5804):304-10)))以及诱导型启动子(例如四环素诱导的启动子((Dingermann等(1992),Mol Cell Biol.12(9):4038-45)))。本发明的工程化大范围核酸酶也可以可操作地与合成启动子连接。合成启动子可以包括但不限于JeT启动子(WO 2002/012514)。

在一些实施方式中，将编码工程化大范围核酸酶的mRNA递送至细胞，因为这降低了编码工程改造的大范围核酸酶的基因整合到细胞基因组中的可能性。可以使用本领域已知的方法例如体外转录产生编码工程化大范围核酸酶的此类mRNA。在一些实施方式中，mRNA使用7-甲基鸟苷、抗反向帽类似物(ARCA)(US 7,074,596)、

在特定的实施方式中，编码本发明的工程化大范围核酸酶的mRNA可以是编码在细胞中同时表达的两种或更多种大范围核酸酶的多顺反子mRNA。多顺反子mRNA可以编码靶向同一靶基因中不同识别序列的两种或更多种大范围核酸酶。或者，多顺反子mRNA可编码至少一种本文所述的大范围核酸酶和至少一种另外的核酸酶，所述另外的核酸酶靶向位于同一基因中的单独的识别序列，或靶向位于第二基因中的第二识别序列，从而在两个基因中都产生切割位点。多顺反子mRNA可包含本领域已知的任何元件以允许从同一mRNA分子翻译两个或多个基因(即顺反子)，所述元件包括但不限于IRES元件、T2A元件、P2A元件、E2A元件和F2A元件。

在另一个特定的实施方式中，可以使用单链DNA模板将编码本发明的工程化大范围核酸酶的核酸引入细胞中。单链DNA还可在编码工程化大范围核酸酶的序列的上游和/或下游包含5'和/或3'AAV反向末端重复序列(ITR)。在其他实施方式中，单链DNA可进一步在编码工程化大范围核酸酶的序列的上游和/或下游包含5'和/或3'同源臂。

在另一个特定的实施方式中，可以使用线性化的DNA模板将编码本发明的大范围核酸酶的基因引入细胞中。在一些实施例中，编码大范围核酸酶的质粒DNA可以被一种或多种限制酶消化，使得环状质粒DNA在被引入细胞中之前被线性化。

纯化的大范围核酸酶蛋白可通过本领域已知的多种不同机制(包括下文进一步详述的那些机制)递送到细胞中以切割基因组DNA，这允许在裂解位点处与目的序列进行同源重组或非同源末端连接。

在一些实施方式中，将大范围核酸酶蛋白或编码大范围核酸酶的DNA/mRNA偶联至细胞穿透肽或靶向配体以促进细胞摄取。本领域已知的细胞穿透肽的实例包括聚精氨酸(Jearawiriyapaisarn等(2008)Mol Ther.16:1624-9)，来自HIV病毒的TAT肽(Hudecz等(2005),Med.Res.Rev.25:679-736)，MPG(Simeoni等(2003)Nucleic Acids Res.31:2717–2724),Pep-1(Deshayes等(2004)Biochemistry 43:7698–7706)和HSV-1VP-22(Deshayes等(2005)Cell Mol Life Sci.62:1839-49)。在可选的实施方式中，将大范围核酸酶蛋白或编码大范围核酸酶的DNA/mRNA与识别靶细胞上表达的特定细胞表面受体的抗体共价或非共价偶联，从而使大范围核酸酶蛋白/DNA/mRNA与靶细胞结合并被其内化。可替代地，大范围核酸酶蛋白/DNA/mRNA可以与这种细胞表面受体的天然配体(或天然配体的一部分)共价或非共价偶联。(McCall等(2014)Tissue Barriers.2(4):e944449；Dinda等(2013)CurrPharm Biotechnol.14:1264-74；Kang等(2014)Curr Pharm Biotechnol.15(3):220-30；Qian等(2014)Expert Opin Drug Metab Toxicol.10(11):1491-508)。

在一些实施方式中，使用本领域已知的方法将大范围核酸酶蛋白或编码大范围核酸酶的DNA/mRNA共价或非共价偶联至纳米颗粒或包封在这种纳米颗粒内(Sharma,等(2014)Biomed Res Int.2014)。纳米颗粒是纳米级的递送系统，其长度尺度<1□m，优选<100nm。可以使用由金属、脂质、聚合物或生物大分子组成的核来设计这样的纳米颗粒，并且可以将多个拷贝的重组大范围核酸酶蛋白、mRNA或DNA附着至纳米颗粒核或包封在纳米颗粒核内。这增加了递送到每个细胞的蛋白质/mRNA/DNA的拷贝数，且因此增加了每个工程化大范围核酸酶的细胞内表达，从而使靶识别序列切割的可能性最大化。此类纳米颗粒的表面可用聚合物或脂质(例如壳聚糖、阳离子聚合物或阳离子脂质)进一步修饰以形成核-壳纳米颗粒，其表面赋予其他功能以增强有效负载(payload)的递送和细胞摄取(Jian等(2012)Biomaterials.33(30):7621-30)。纳米颗粒可以另外有利地与靶向分子偶联，以将纳米颗粒指引至合适的细胞类型和/或增加细胞摄取的可能性。这种靶向分子的实例包括对细胞表面受体具有特异性的抗体和细胞表面受体的天然配体(或天然配体的部分)。

在一些实施方式中，大范围核酸酶蛋白或编码大范围核酸酶的DNA/mRNA被包封在脂质体内或使用阳离子脂质复合(参见例如Lipofectamine

在一些实施方式中，将大范围核酸酶蛋白或编码大范围核酸酶的DNA/mRNA包封在聚合物支架(例如PLGA)内或使用阳离子聚合物(例如PEI、PLL)复合(Tamboli等(2011)TherDeliv.2(4):523-536)。可以将聚合物载体设计成通过控制聚合物侵蚀和药物扩散来提供可调的药物释放速率，并且高的药物包封效率可以提供治疗有效负载的保护，直到细胞内递送至所需的靶细胞群体。

在一些实施方式中，将大范围核酸酶蛋白或编码重组大范围核酸酶的DNA/mRNA与自组装成胶束的两亲分子结合(Tong等(2007)J Gene Med.9(11):956-66)。聚合物胶束可以包括由亲水聚合物(例如聚乙二醇)形成的胶束壳，其可以防止聚集，遮蔽电荷相互作用，并减少非特异性相互作用。

在一些实施方式中，将大范围核酸酶蛋白或编码大范围核酸酶的DNA/mRNA配制成乳液或纳米乳液(即具有小于1nm的平均粒径)以用于施用和/或递送至靶细胞。术语“乳液”是指但不限于任何水包油、油包水、水包油包水或油包水包油分散液或液滴(包括脂质结构)，所述脂质结构可由于当水不溶相与水相混合时，将非极性残基(例如长烃链)从水驱离而将极性头基驱向水的疏水力的结果而形成。这些其他脂质结构包括但不限于单层、寡层(paucilamellar)和多层脂质囊泡、胶束和层状相。乳液由水相和亲脂相(通常包含油和有机溶剂)组成。乳液还经常包含一种或多种表面活性剂。纳米乳液制剂是众所周知的，例如，如美国专利申请号2002/0045667和2004/0043041和美国专利号6,015,832、6,506,803、6,635,676和6,559,189中所述，其每一个的全部内容均通过引用并入本文。

在一些实施方式中，大范围核酸酶蛋白或编码大范围核酸酶的DNA/mRNA与多功能聚合物缀合物、DNA树状聚合物和聚合物树状聚合物共价连接或非共价缔合(Mastorakos等(2015)Nanoscale.7(9):3845-56；Cheng等(2008)J Pharm Sci.97(1):123-43)。树状聚合物的产生可以控制有效负载容量和大小，并且可以提供高药物有效负载容量。而且，可以利用多个表面基团的展示来改善稳定性，减少非特异性相互作用和增强细胞特异性靶向和药物释放。

在一些实施方式中，使用病毒载体递送编码大范围核酸酶的基因。这样的载体是本领域已知的，且包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体(在Vannucci等2013New Microbiol.36:1-22中综述)。可用于本发明的重组AAV载体可以具有允许将病毒转导到细胞中和将核酸酶基因插入细胞基因组中的任何血清型。在特定的实施方式中，重组AAV载体具有AAV2或AAV6的血清型，AAV载体也可以是自身互补的，使得它们不需要在宿主细胞中合成第二链DNA(McCarty,等(2001)Gene Ther.8:1248-54)。

如果大范围核酸酶基因以DNA形式(例如质粒)和/或通过病毒载体(例如AAV)递送，则它们必须与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，这可以是病毒启动子，例如来自病毒载体的内源启动子(例如慢病毒载体的LTR)或众所周知的巨细胞病毒或SV40病毒早期启动子。在优选的实施方式中，大范围核酸酶基因与优先在靶细胞(例如T细胞)中驱动基因表达的启动子可操作地连接。

本发明进一步用于在TRC 1-2识别序列处将外源目的序列引入T细胞受体α恒定区基因中。在一些实施方式中，所述外源目的序列包含插入片段的元件侧翼的5’同源臂和3’同源臂。这样的同源臂与其中产生切割位点的核酸酶识别序列5’上游和3’下游的相应序列具有序列同源性。通常，同源臂的长度可以是至少50个碱基对，优选至少100个碱基对，和多达2000个碱基对或更多，并且可以与基因组中的其相应序列具有至少90％，优选至少95％或更高的序列同源性。

本发明的外源目的序列可以通过前面讨论的任何方法引入细胞中。在特定的实施方式中，通过病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或优选地重组AAV载体来引入所述外源目的序列。可用于引入外源核酸的重组AAV载体可以具有允许将病毒转导至细胞中以及将外源核酸序列插入细胞基因组中的任何血清型。在特定的实施方式中，重组AAV载体具有AAV2或AAV6的血清型。重组AAV载体也可以是自身互补的，使得它们不需要在宿主细胞中合成第二链DNA。

在另一个特定的实施方式中，可以使用单链DNA模板将外源目的序列引入细胞中。单链DNA可包含所述外源目的序列，并且在优选的实施方式中，可包含5’和3’同源臂以通过同源重组促进核酸序列插入到大范围核酸酶切割位点中。单链DNA可进一步在5’同源臂的5’上游包含5’AAV反向末端重复序列(ITR)，和在3’同源臂的3’下游包含3’AAV ITR序列。

在另一个特定的实施方式中，可以通过用线性化的DNA模板转染将编码本发明的工程化核酸酶的基因和/或本发明的外源目的序列引入细胞中。在一些实施例中，质粒DNA可以被一种或多种限制酶消化，使得环状质粒DNA在转染到细胞中之前被线性化。

通过本发明修饰的T细胞在大范围核酸酶和/或外源目的序列引入之前可能需要激活。例如，可使T细胞与可溶的或缀合至支持物(即珠子)的抗CD3和抗CD28抗体接触足以激活细胞的时间。

本发明的遗传修饰的细胞可以进一步修饰以表达一种或多种可诱导的自杀基因，该基因的诱导引起细胞死亡并允许在体外或体内选择性破坏细胞。在一些实施例中，自杀基因可以编码细胞毒性多肽(即具有将非毒性前药转化为细胞毒性药物的能力的多肽)和/或激活细胞内的细胞毒性基因途径的多肽。也就是说，自杀基因是编码自身或在其他化合物的存在下引起细胞死亡的产物的核酸。这样的自杀基因的代表性实例是编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶的基因。另外的实例是编码水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶的基因和可以将5-氟胞嘧啶转化为高毒性化合物5-氟尿嘧啶的细菌胞嘧啶脱氨酶基因。作为非限制性实例，自杀基因还包括编码半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶的基因。在一些实例中，可以使用特定的二聚化化学诱导物(CID)来激活半胱天冬酶-9。自杀基因还可以编码在细胞表面表达的多肽，该多肽使细胞对治疗性和/或细胞毒性单克隆抗体敏感。在进一步的实例中，自杀基因可以编码重组抗原多肽，所述重组抗原多肽包含被抗CD20 mAb利妥昔单抗识别的抗原基序和允许对表达自杀基因的细胞进行选择的表位。参见例如WO2013153391中描述的RQR8多肽，其包含两个利妥昔单抗结合表位和QBEnd10结合表位。对于这种基因，可以在需要时将利妥昔单抗施用于受试者以诱导细胞耗竭。在进一步的实例中，自杀基因可以包括与截短的EGFR多肽组合表达的QBEnd10结合表位。

通过本文所述的方法和组合物修饰的真核细胞可以具有降低的内源性T细胞受体(即α/βT细胞受体)的表达，并且可以任选地进一步表达目的蛋白质(例如CAR)。因此，本发明进一步提供了表达目的蛋白质并且不表达内源性T细胞受体(例如α/βT细胞受体)的真核细胞群体。例如，群体可以包括多个本发明的遗传修饰的真核细胞，其表达CAR(即CAR+)或外源性T细胞受体(即exoTCR+)，并且具有降低的内源性T细胞受体的表达(即TCR-)。在本发明的各种实施方式中，群体中至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或高达100％的细胞是如本文中所述的遗传修饰的真核细胞。在特定的实例中，该群体所包含的至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或高达100％的细胞可以是TCR-和CAR+的。

在一些实施方式中，与将第一代TCR 1-2x.87EE大范围核酸酶引入细胞群体中时相比，目前公开的工程化大范围核酸酶被引入细胞群体中时产生更高百分比的TCR-和CAR+的细胞群体。

此外，与用TRC1-2x.87EE大范围核酸酶进行遗传修饰的细胞相比，用当前公开的工程化大范围核酸酶进行遗传修饰的细胞表现出改善的特性，包括减少的脱靶切割及其效应，减少的大范围核酸酶在细胞中的持续时间，增强的(即增加的)CAR T扩增，和较低的分化。另外，与其中引入了TRC1-2x.87EE大范围核酸酶(或编码其的核酸)的那些细胞群体相比，已引入目前公开的大范围核酸酶(或编码其的核酸)的细胞群体具有更大百分比的修饰细胞和更大百分比的低分化细胞。在特定的实施方式中，引入了目前公开的工程化大范围核酸酶的细胞群体显示出比其中引入第一代TRC1-2x.87EE大范围核酸酶的细胞群体更高百分比的中央记忆T细胞(例如表达CD45RO、CCR7和CD62L的那些)。

在一些实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的遗传修饰的真核细胞或本发明的遗传修饰的真核细胞群体，以及药学上可接受的载体。这样的药物组合物可以根据已知技术来制备。参见，例如Remington,科学与药学实践(The Science AndPractice of Pharmacy)(第21版,Philadelphia,Lippincott,Williams&Wilkins,2005)。在制造根据本发明的药物制剂时，通常将细胞与药学上可接受的载体混合，并将所得的组合物施用于受试者。当然，在与制剂中的任何其他成分相容的意义上，载体必须是可接受的，并且必须不对受试者有害。在一些实施方式中，本发明的药物组合物可进一步包含一种或多种可用于治疗受试者的疾病的另外的药剂。在另外的实施方式中，本发明的药物组合物可以进一步包含生物分子，例如细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21)，其促进体内细胞增殖和遗传修饰的T细胞的植入。包含本发明的遗传修饰的真核细胞的药物组合物可以与另外的药剂或生物分子在相同的组合物中施用，或者可以在分开的组合物中共同施用。

本公开还提供了用作药物的本文所述的遗传修饰的细胞或其群体。本公开进一步提供了本文所述的遗传修饰的细胞或其群体在制备用于治疗有此需要的受试者的疾病的药物中的用途。在一个这样的方面，该药物可用于有需要的受试者的癌症免疫治疗。

已知其中引入了本发明公开的大范围核酸酶的细胞可以减少脱靶切割，减少大范围核酸酶在细胞中的持续时间，提高TCRα恒定区基因的破坏效率，增强(即提高)CAR T扩增，且与已经用TRC1-2x.87EE大范围核酸酶进行遗传修饰的细胞相比，细胞具有较低的分化，在一些实施方式中，与包含通过TRC1-2x.87EE大范围核酸酶进行遗传修饰的细胞的药物组合物的施用相比，目前公开的包含遗传修饰细胞的药物组合物在被施用于有需要的受试者时还具有改善的治疗疾病(例如癌症)的功效。

在一些实施方式中，与第一代TCR 1-2x.87EE大范围核酸酶引入细胞群体中相比，目前公开的工程化大范围核酸酶在引入细胞群体中时产生更高百分比的TCR-和CAR+的细胞群体。

此外，与已经用TRC1-2x.87EE大范围核酸酶进行遗传修饰的细胞相比，已经用当前公开的工程化大范围核酸酶进行遗传修饰的细胞表现出改善的特性，包括减少的脱靶切割及其效应，减少的大范围核酸酶在细胞中的持续时间，增强的(即增加的)CAR T扩增，和较低的细胞分化。另外，与其中已经引入了TRC1-2x.87EE大范围核酸酶(或编码其的核酸)的细胞群体相比，其中已经引入了目前公开的大范围核酸酶(或编码其的核酸)的细胞群体具有更大百分比的修饰细胞和更大百分比的较低分化细胞。在特定的实施方式中，相比于引入了亲本TRC1-2x.87EE大范围核酸酶的细胞群体，已经引入了目前公开的工程化大范围核酸酶的细胞群体表现出更大百分比的中央记忆T细胞(例如表达CD45RO、CCR7和CD62L的那些)。

本发明的药物组合物可用于治疗可被T细胞过继免疫疗法靶向的任何疾病状态。在特定的实施方式中，本发明的药物组合物和药物可用于治疗癌症。可以用本公开的药物组合物和药物治疗的癌症的非限制性实例是上皮癌、淋巴瘤、肉瘤、黑素瘤、母细胞瘤、白血病和生殖细胞肿瘤，包括但不限于B细胞起源的癌症、神经母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、肝癌、胃癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域的癌、胃的癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱发的癌症(包括石棉诱发的癌症)、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓样淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、蕈样肉芽肿、间变性大细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤以及所述癌症的任何组合。在某些实施方式中，B细胞起源的癌症包括但不限于B谱系急性淋巴母细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前-B ALL(儿科适应症)、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、多发性骨髓瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤。

在其中用当前公开的遗传修饰的细胞或其群体治疗癌症的这些实施方式的一些中，向被施用了遗传修饰的细胞或其群体的受试者进一步施用另外的治疗剂，例如放射、手术或化学治疗剂。

本发明进一步提供了包含多个本文所述的遗传修饰细胞的遗传修饰细胞群体，所述细胞在其基因组中包含编码目的序列的外源核酸分子，其中所述外源核酸分子被插入T细胞受体α恒定区基因中，并且其中内源TCR的细胞表面表达降低。因此，在本发明的各种实施方式中，提供了遗传修饰的细胞群体，其中群体中至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或高达100％的细胞是本文所述的遗传修饰的细胞。在本发明的其他实施方式中，提供了遗传修饰的细胞群体，其中群体中至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或高达100％的细胞是还表达嵌合抗原受体的本文所述的遗传修饰的细胞。

本文公开的另一方面是将有效量的本公开的遗传修饰的真核细胞或其群体施用于有需要的受试者。在特定的实施方式中，将本文所述的药物组合物施用于有需要的受试者。例如，可以向患有疾病的受试者施用有效量的细胞群体。在特定的实施方式中，疾病可以是癌症，并且本发明的遗传修饰的真核细胞的施用代表免疫疗法。所施用的细胞能够减少接受体中的靶细胞增殖，减少其数量或杀死靶细胞。与抗体疗法不同，本公开的遗传修饰的真核细胞能够在体内复制和扩增，导致长期持续存在，这可以导致疾病的持续控制。

可能的施用途径的实例包括肠胃外(例如静脉内(IV)，肌内(IM)，皮内，皮下(SC)或输注)施用。此外，可以通过连续输注或通过单次或多次大丸剂(boluses)来施用。在特定的实施方式中，在少于约12小时、6小时、4小时、3小时、2小时或1小时的时间内输注药剂。在其他实施方式中，输注首先缓慢地发生，然后随着时间而增加。

在一些实施方式中，出于治疗癌症的目的，本公开的遗传修饰的真核细胞或其群体靶向肿瘤抗原。此类癌症可包括但不限于上皮癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤、白血病、B细胞起源的癌症、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤。在特定的实施方式中，癌症和病症包括但不限于前-B ALL(儿科适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、同种异体骨髓移植后的挽救等。可以使用靶向例如CD19、CD20、CD22和/或ROR1的CAR的组合治疗这些癌症。在一些非限制性实例中，本公开的遗传修饰的真核细胞或其群体靶向上皮癌、淋巴瘤、肉瘤、黑素瘤、母细胞瘤、白血病和生殖细胞肿瘤，包括但不限于B细胞起源的癌症、神经母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、肝癌、胃癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门区域的癌、胃的癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波济肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的癌症)、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非-霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性淋巴瘤、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴性白血病、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、蕈样肉芽肿、间变性大细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤以及所述癌症的任何组合。在某些实施方式中，B细胞起源的癌症包括但不限于B谱系急性淋巴母细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前-B ALL(儿科适应症)、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、多发性骨髓瘤和B细胞非霍奇金淋巴瘤。

当指示“有效量”或“治疗量”时，可以由医师根据年龄、体重、肿瘤大小(如果存在)、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定。在一些实施方式中，包含本文所述的遗传修饰的细胞或其群体的药物组合物以10

在一些实施方式中，本公开的遗传修饰的真核细胞或其群体的施用减轻了目标疾病或病症的至少一种症状。例如，施用本公开的遗传修饰的T细胞或其群体可以减轻癌症的至少一种症状。癌症的症状在本领域中是众所周知的，并且可以通过已知技术来确定。

在一些实施方式中，本发明提供了用于本发明方法的病毒载体(例如重组AAV载体)。重组AAV载体通常在哺乳动物细胞系如HEK-293中产生。由于从载体中去除了病毒cap和rep基因来防止其自我复制，从而为要递送的治疗基因(例如大范围核酸酶基因)腾出空间，因此有必要在包装细胞系中反式提供这些基因。此外，有必要提供支持复制所必需的“辅助”(例如腺病毒)组分(Cots等(2013),Curr.Gene Ther.13(5):370-81)。通常，使用三重转染产生重组AAV载体，其中用编码“辅助”组分的第一质粒，包含cap和rep基因的第二质粒和包含病毒ITR的第三质粒转染细胞系，所述病毒ITR含有待包装到病毒中的介入DNA序列。然后通过冻融循环、超声处理、去污剂或本领域已知的其他方式从细胞中分离包含被包裹在衣壳中的基因组(ITR和目的介入基因)的病毒颗粒。然后使用氯化铯密度梯度离心或亲和色谱法纯化颗粒，然后将目的基因递送至细胞、组织或生物体(例如人患者)。

因为重组AAV颗粒通常在细胞中产生(制造)，所以在实施本发明时必须采取预防措施以确保在包装细胞中不表达工程化大范围核酸酶。因为本发明的病毒基因组可以包含大范围核酸酶的识别序列，所以在包装细胞系中表达的任何大范围核酸酶可能能够在病毒基因组包装到病毒颗粒中之前将其裂解。这将导致包装效率降低和/或片段化基因组的包装。可以使用几种方法来防止包装细胞中大范围核酸酶的表达，包括：

可以将大范围核酸酶置于在包装细胞中非活性的组织特异性启动子的控制之下。例如，如果开发病毒载体以将一个或多个大范围核酸酶基因递送至肌肉组织，则可以使用肌肉特异性启动子。肌肉特异性启动子的实例包括C5-12(Liu等(2004)Hum Gene Ther.15:783-92)，肌肉特异性肌酸激酶(MCK)启动子(Yuasa等(2002)Gene Ther.9:1576-88)或平滑肌22(SM22)启动子(Haase等(2013)BMC Biotechnol.13:49-54)。CNS(神经元)特异性启动子的实例包括NSE、突触蛋白和MeCP2启动子(Lentz等(2012)Neurobiol Dis.48:179-88)。肝特异性启动子的实例包括白蛋白启动子(例如Palb)、人α1-抗胰蛋白酶(例如Pa1AT)和血液结合素(例如Phpx)(Kramer等,(2003)Mol.Therapy 7:375-85)，杂合肝特异性启动子(来自ApoE基因的肝基因座控制区(ApoE-HCR)和肝特异性α1-抗胰蛋白酶启动子)，人甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子和载脂蛋白A-II启动子。眼特异性启动子的实例包括视蛋白和角膜上皮特异性K12启动子(Martin等(2002)Methods(28):267-75)(Tong等,(2007)J GeneMed,9:956-66)。这些启动子或本领域已知的其他组织特异性启动子在HEK-293细胞中不是高度活跃的，且因此，当并入本发明的病毒载体中时，不会预期在包装细胞中产生显著水平的大范围核酸酶基因表达。类似地，本发明的病毒载体考虑使用其他细胞系与使用不相容的组织特异性启动子(即众所周知的HeLa细胞系(人上皮细胞)并使用肝特异性血液结合素启动子)。组织特异性启动子的其他实例包括：滑膜肉瘤PDZD4(小脑)、C6(肝脏)、ASB5(肌肉)、PPP1R12B(心脏)、SLC5A12(肾脏)、胆固醇调节APOM(肝脏)、ADPRHL1(心脏)和单基因畸形综合征TP73L(肌肉)。(Jacox等,(2010),PLoS One v.5(8):e12274)。

或者，可以将载体包装在来自不太可能表达大范围核酸酶的不同物种的细胞中。例如，可以使用在非哺乳动物包装细胞中非活性的哺乳动物启动子(例如众所周知的巨细胞病毒或SV40病毒早期启动子)在微生物、昆虫或植物细胞中产生病毒颗粒。在一个优选的实施方式中，如Gao等(Gao等(2007),J.Biotechnol.131(2):138-43)所述，使用杆状病毒系统在昆虫细胞中产生病毒颗粒。哺乳动物启动子控制下的大范围核酸酶在这些细胞中不太可能表达(Airenne等(2013),Mol.Ther.21(4):739-49)。而且，昆虫细胞利用与哺乳动物细胞不同的mRNA剪接基序。因此，有可能将哺乳动物内含子，例如人生长激素(HGH)内含子或SV40大T抗原内含子并入到大范围核酸酶的编码序列中。因为这些内含子在昆虫细胞中不能从前mRNA转录物有效剪接，所以昆虫细胞将不会表达功能性的大范围核酸酶，并且包装全长基因组。相反，递送产生的重组AAV颗粒的哺乳动物细胞将正确剪接pre-mRNA，并表达功能性大范围核酸酶蛋白。Haifeng Chen报告了使用HGH和SV40大T抗原内含子来减弱昆虫包装细胞中毒性蛋白质芽胞杆菌RNA酶和白喉毒素片段A的表达，从而能够生产携带这些毒素基因的重组AAV载体(Chen(2012),Mol Ther Nucleic Acids.1(11):e57)。

大范围核酸酶基因可以可操作地与诱导型启动子连接，使得大范围核酸酶表达需要小分子诱导物。诱导型启动子的实例包括Tet-On系统(Clontech；Chen等(2015),BMCBiotechnol.15(1):4)和RheoSwitch系统(Intrexon；Sowa等(2011),Spine,36(10):E623-8)。两种系统以及本领域已知的类似系统均依赖配体诱导的转录因子(分别是Tet阻遏物和蜕皮激素受体的变体)，所述转录因子响应于小分子激活剂(分别为强力霉素或蜕皮激素)来激活转录。使用这样的配体诱导型转录激活剂实施本发明包括：1)将大范围核酸酶基因置于对相应转录因子有响应的启动子的控制下，所述大范围核酸酶基因具有一个或多个转录因子的结合位点；和2)在包装的病毒基因组中包括编码转录因子的基因。后一步骤是必要的，因为如果转录激活因子没有同时提供靶细胞，则在重组AAV递送后，大范围核酸酶不会在靶细胞或组织中表达。然后，转录激活因子仅在用同源小分子激活因子处理的细胞或组织中诱导大范围核酸酶基因表达。该方法是有利的，因为它使得能够通过选择何时和向哪些组织递送小分子诱导物而以时空方式调节大范围核酸酶基因的表达。但是，要求在病毒基因组中包含诱导物(这极大限制了携带能力)给这种方法带来了缺点。

在另一个优选的实施方式中，在哺乳动物细胞系中产生重组AAV颗粒，其表达阻止大范围核酸酶表达的转录阻遏物。转录阻遏物是本领域已知的，且包括Tet阻遏物、Lac阻遏物、Cro阻遏物和Lambda阻遏物。在缺乏同源激素配体的情况下，许多核激素受体例如蜕皮激素受体也可以充当转录阻遏物。为了实施本发明，用编码转录阻遏物的载体转染/转导包装细胞，且病毒基因组(包装载体)中的大范围核酸酶基因可操作地连接经修饰以包含阻遏物结合位点的启动子，使得阻遏物使启动子沉默。编码转录阻遏物的基因可以置于多个位置。可以将其在一个单独的载体上编码；可以将其在ITR序列之外并入包装载体中；可以将其并入cap/rep载体或腺病毒辅助载体中；或者可以将其稳定整合到包装细胞的基因组中，从而使其组成型地表达。修饰常见哺乳动物启动子以并入转录阻遏位点的方法是本领域已知的。例如，Chang和Roninson修饰了强的组成型CMV和RSV启动子以包含Lac阻遏物的操纵子，并表明修饰的启动子的基因表达在表达该阻遏物的细胞中大大减弱(Chang和Roninson(1996),Gene 183:137-42)。非人类转录阻遏物的使用确保了仅在表达阻遏物的包装细胞中而不在用所得重组AAV载体转导的靶细胞或组织中抑制大范围核酸酶基因的转录。

本发明的实施方式包括本文所述的工程化核酸酶及其变体。本发明的其他实施方式包括包含编码本文所述核酸酶的核酸序列的多核苷酸，以及此类多核苷酸的变体。

如本文所用，“变体”旨在表示基本上相似的序列。“变体”多肽意指通过在天然蛋白质的一个或多个内部位点删除或添加一个或多个氨基酸和/或在天然多肽中的一个或多个位点处一个或多个氨基酸置换而由“天然”多肽衍生的多肽。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽包含变体由其衍生的亲本序列。实施方式涵盖的变体多肽具有生物活性。也就是说，它们继续具有天然蛋白质所需的生物学活性；即，识别和切割在人T细胞受体α恒定区(SEQ ID NO：3)中发现的TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)的能力，并且在一些实施方式中，相对于第一代TRC 1-2大范围核酸酶表现出选自以下的至少一种改进的特性：改进的(即增加的)特异性和脱靶切割，减少的细胞内持续时间，以及增强的(即增加的)TCRα恒定区基因的修饰效率。这样的变体可以例如由人为操纵产生。实施方式的天然多肽的生物活性变体(例如SEQ ID NO：7和8)，或本文所述的识别半位点结合亚基的生物活性变体，将与天然多肽或天然亚基的氨基酸序列具有至少约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约91％，约92％大约93％，大约94％，大约95％，约96％，约97％，约98％或约99％的序列同一性，如通过本文中其他地方描述的序列比对程序和参数所确定的。实施方式的多肽或亚基的生物活性变体可与该多肽或亚基的区别在于少至约1-40个氨基酸残基，少至约1-20个，少至约1-10个，少至约5个，少至4个、3个、2个，或甚至1个氨基酸残基。

实施方式的多肽可以以各种方式改变，包括氨基酸置换，删除，截短和插入。用于这种操纵的方法是本领域公知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备氨基酸序列变体。诱变和多核苷酸改变的方法是本领域众所周知的。参见，例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel等(1987)酶学方法(Methods in Enzymol)154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra,eds.(1983)分子生物学技术(Techniques in Molecular Biology)(MacMillan Publishing Company,New York)和其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质生物学活性的适当氨基酸置换的指南可在以引用方式并入本文的Dayhoff等(1978)蛋白质序列和结构图集(Atlas of Protein Sequenceand Structure)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)中找到。保守置换，例如将一个氨基酸用具有相似特性的另一个氨基酸交换，可能是最佳的。

在一些实施方式中，本发明的工程化大范围核酸酶可以包含本文公开的HVR1区和HVR2区的变体。亲本HVR区可包含例如例示的工程化大范围核酸酶的残基24-79或残基215-270。因此，变体HVR可以包含与对应于本文例示的工程化大范围核酸酶的残基24-79或残基215-270的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，使得变体HVR区保持了工程化大范围核酸酶的生物学活性(即结合并切割识别序列)。此外，在本发明的一些实施方式中，变体HVR1区或变体HVR2区可包含对应于在亲本HVR内的特定位置存在的氨基酸残基的残基。在这种情况中，“对应于”是指变体HVR中的氨基酸残基是亲本HVR序列中在相同的相对位置(即相对于亲本序列的其余氨基酸)存在的相同氨基酸残基(即，单独的相同残基)。举例来说，如果亲本HVR序列在位置26处包含丝氨酸残基，则“包含对应于”残基26的残基的变体HVR也将在相对于(即对应于)亲本位置26的位置处包含丝氨酸。

在特定的实施方式中，本发明的工程化大范围核酸酶包含与对应于SEQ ID NO：7残基215-270的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性的HVR1区。

在某些实施方式中，本发明的工程化大范围核酸酶包含与对应于SEQ ID NO：7的残基24-79的氨基酸序列具有至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性的HVR2区。

在一些实施方式中，本发明的工程化大范围核酸酶包含与对应于SEQ ID NO：8残基24-79的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的序列同一性的HVR2区。

在特定实施方式中，本发明的工程化大范围核酸酶包含与对应于SEQ ID NO：7的残基215-270的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的HVR1区和与对应于SEQ ID NO：7的残基24-79的氨基酸序列具有至少81％的序列同一性的HVR2区。

在其他特定的实施方式中，本发明的工程化大范围核酸酶包含具有对应于SEQ IDNO：8的残基215-270的氨基酸序列的HVR1区和与对应于SEQ ID NO：8残基24-79的氨基酸序列具有至少86％的序列同一性的HVR2区。

先前已经鉴定了对野生型I-CreI大范围核酸酶的DNA识别结构域的大量氨基酸修饰(例如US 8,021,867)，其单独或组合地产生了具有在DNA识别序列半位点内的单个碱基处改变的特异性的重组大范围核酸酶，使得得到的合理设计的大范围核酸酶具有与野生型酶不同的半位点特异性。表2提供了可以在工程化大范围核酸酶单体或亚基中基于识别半位点的每个半位点位置(-1至-9)存在的碱基进行以增强特异性的潜在置换。

表2.

粗体是野生型接触残基且不构成本文所用的“修饰”。星号表示该残基与反义链上的碱基接触。

可以在工程化大范围核酸酶单体或亚基中进行某些修饰，以调节DNA结合亲和力和/或活性。例如，本文所述的工程化大范围核酸酶单体或亚基可在对应于I-CreI或SEQ IDNO：7或8的位置19的残基处包含G、S或A(WO 2009001159)，在对应于I-CreI或SEQ ID NO：7或8的位置66的残基处包含Y、R、K或D，和/或在对应于I-CreI或SEQ ID NO：7或8的位置80的残基处包含E、Q或K(US8021867)。

对于多核苷酸，“变体”包括在天然多核苷酸内一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的删除和/或添加。本领域技术人员将认识到，该实施方式的核酸的变体构建为使得保持开放阅读框。对于多核苷酸，保守变体包含那些由于遗传密码的简并性而编码实施方式的多肽之一的氨基酸序列的序列。变体多核苷酸包括合成衍生的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变而产生但仍编码实施方式的重组核酸酶的多核苷酸。通常，实施方式的特定多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或更高的序列同一性，如通过本文其他各处所述的序列比对程序和参数确定的。实施方式的特定多核苷酸的变体(即参考多核苷酸)也可以通过比较变体多核苷酸编码的多肽和参考多核苷酸编码的多肽之间的百分序列同一性来评估。

预期本文涵盖的变体蛋白质序列的删除、插入和置换不会在多肽的特性上产生根本性的变化。然而，当在这样做之前难以预测置换、删除或插入的确切效果时，本领域技术人员将理解，通过筛选多肽优先识别和切割在人T细胞受体α恒定区基因(SEQ ID NO：3)的外显子1内发现的TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)的能力来评估效果。

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被理解为是限制性的。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的特定物质和程序的许多等同。这样的等同旨在被包括在以下实施例之后的权利要求的范围内。

实施例1

称为TRC 1-2L.1592(SEQ ID NO：7)和TRC 1-2L.1775(SEQ ID NO：8)的第二代TRC1-2大范围核酸酶被工程化来识别和切割存在于人T细胞受体α恒定区中的TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)。这些第二代大范围核酸酶中的每一个均包含衍生自SV40的N端核酸酶定位信号、第一大范围核酸酶亚基、接头序列和第二大范围核酸酶亚基。每个TRC 1-2大范围核酸酶中的第一亚基与SEQ ID NO：5的TRC1识别半位结合，而第二亚基与TRC2识别半位结合(见图1)。TRC1结合亚基和TRC2结合亚基各自包含56个碱基对的高变区，分别称为HVR1和HVR2。

每个TRC1结合亚基的HVR1区由SEQ ID NO：7和8的残基215-270组成。TRC1-2L.1592和TRC 1-2L.1775的TRC1结合亚基在HVR1区的外部彼此相同。每个TRC 1-2大范围核酸酶的HVR1区在位置215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、266和268处包含相对于野生型I-CreI序列(SEQ ID NO：1)的修饰。尽管相对于野生型I-CreI没有被修饰，但是据信SEQ ID NO：7和8的261位的精氨酸残基与修饰的HVR1残基一起造成核酸酶的特异性。TRC 1-2L.1592的HVR1区与TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的HVR1区共有96.43％的序列同一性。TRC 1-2L.1775的HVR1区与TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的HVR1区共有100％的序列同一性。

每个TRC2结合亚基的HVR2区由SEQ ID NO：7和8的残基24-79组成。TRC 1-2L.1592和TRC 1-2L.1775的TRC2结合亚基在HVR2区的外部彼此相同，但SEQ ID NO：7和8的80位除外，其可以是E(TRC 1-2L.1592)或Q(TRC 1-2L.1775)。每个TRC 1-2大范围核酸酶的HVR2区在位置24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、48、50、68、70、75和77处包含相对于野生型I-CreI序列(SEQ ID NO：1)的修饰。TRC 1-2L.1592大范围核酸酶相对于野生型I-CreI在位置71、72和73处还包含修饰。还值得注意的是，SEQ ID NO：7和8的139位处的精氨酸残基相对于野生型I-CreI序列被修饰，并且据信与修饰的HVR2残基一起造成核酸酶的特异性。TRC1-2L.1592的HVR2区与第一代TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的HVR2区仅共有80.36％的序列同一性。TRC 1-2L.1775的HVR2区与TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的HVR2区仅共有85.71％的序列同一性。

使用与GUIDE-seq(Tsai等(2015),Nat Biotechnology 33:187-197)非常相似的方法评估了先前报道的TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶的识别位点特异性，但对其进行了调整以发现潜在的大范围核酸酶的脱靶位点。通常，通过在双链DNA断裂中捕获探针寡核苷酸来识别潜在的脱靶位点。TRC 1-2大范围核酸酶产生4个碱基对的3’突出端，因此探针寡核苷酸还包含随机化的四个碱基对的突出端以提高在更可能由核酸酶切割产生的位点处的连接效率。

TRC 1-2x.87EE的特异性分析发现了人类T细胞中多个潜在的脱靶位点。这些脱靶可以分为两个相关类别：以高频命中的独特靶标和低频命中的重复靶标。将涉及这些脱靶的识别的关键氨基酸重新随机化。随后，进行切割预期位点的同时选择及不切割脱靶位点的反向选择。脱靶位点在连续的选择轮次之间交替以分离区分两个脱靶的答案(即核酸酶)。使用的两个脱靶是Off1:5’-TGGCCTGGAGaAACAgtgtaaa-3’(SEQ ID NO:16)，其是基因组中低频切割但高度重复位点；和Off2:5’-cGGCCTGtAGtAcaggAcCTGA-3’(SEQ ID NO:17)，其是频繁命中的、独特的脱靶(小写字母表示与预期位点的错配)。使用了多种核酸酶文库。

选择后，制备来自每个成功文库的分离克隆的96孔板以分离质粒DNA。将每个质粒DNA单独转染到包含在GFP基因中两个直接重复序列之间的中断中的整合靶位点的CHO细胞中。切割靶位点通过单链退火导致GFP基因的修复，并且切割靶位点的频率可以通过在流式细胞仪上计数GFP阳性细胞的数目来计数。我们针对具有预期位点和Off1靶位点的细胞分析了核酸酶质粒。通过这种方式，我们可以评估哪些核酸酶仍切割预期的位点，但最好地针对脱靶进行区分。我们确定了五个候选物。从TRC 1-2的原始文库中重新分离了三个候选物：L.1462，L.1466和L.1469。这三个答案全部是独特的，但彼此相关。从TRC文库2分离出两个候选物：L.1108和L.1118。这些候选物中的每一个都代表本发明第二代核酸酶开发中的中间体核酸酶。

为了进一步改善核酸酶，将涉及识别位点特异性的关键氨基酸随机化。将L.1462、L.1466和L.1469收集到一个文库中，并将L.1108和L.1118收集到第二文库中。通过PCR的新随机化引入两者中。新文库采用了类似的选择策略；同时对于预期位点和针对Off1或Off2进行选择。脱靶在选择轮次之间交替。从选择产生单个答案的96孔板，并在CHO iGFFP试验中进行测试，以确定预期位点以及Off1和Off2两者的切割。从这一附加的优化轮中鉴定出了几种新的核酸酶。来自基于L.1462、L.1466和L.1469的文库的答案包括：L.1775和L.1843。来自基于L.1108和L.1118的文库的一个答案：L.1592。所有新的核酸酶均显示出对预期靶标的强大活性，和对两个脱靶的强区分能力(如下所述)。新的核酸酶进行寡核苷酸捕获试验(下文进一步描述)以确定潜在的脱靶位点，并证明总体上潜在脱靶的数量减少，且特别是，L.1592几乎没有潜在的合理脱靶位点。在iGFFP分析中对L.1108、L.1469、L.1592、L.1775和L.1843进行为期7天的进一步评估以测定GFP信号随时间的稳定性，这是毒性的一般度量。L.1469，L.1592，L.1775和L.1843在原代T细胞中进一步测试了功能。

为了确定TRC 1-2大范围核酸酶是否可以识别和切割TRC 1-2识别序列(SEQ IDNO：5)，使用先前描述的CHO细胞报告基因试验评估每种TRC 1-2大范围核酸酶(参见WO/2012/167192，图3)。为了进行该分析，制备了一对CHO细胞报告系，其携带整合到细胞基因组中的非功能性绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒。每个细胞系中的GFP基因被一对识别序列打断，使大范围核酸酶对任一识别序列进行的细胞内切割会刺激同源重组事件，从而产生功能性GFP基因。在两种细胞系中，识别序列中的一个源自TRC 1-2基因，第二个识别序列被称为“CHO 23/24”的对照大范围核酸酶特异性识别。包含TRC 1-2识别序列(SEQ ID NO：5)和CHO 23/24识别序列的CHO报告细胞在本文中称为“TRC 1-2细胞”。

用编码TRC 1-2大范围核酸酶中的一种(例如TRC 1-2x.87EE，TRC 1-2L.1592，TRC1-2L.1775或TRC 1-2L.1843)或编码CHO 23/34大范围核酸酶的质粒DNA转染TRC 1-2细胞。根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher)在96孔板中用50ng质粒DNA转染4e5 CHO细胞。转染后48小时，通过流式细胞术评估细胞以确定GFP阳性细胞与未转染的阴性对照(1-2bs)相比的百分比。发现所有TRC 1-2大范围核酸酶均在包含TRC 1-2识别序列的细胞系中以明显超过阴性对照并与CHO 23/24阳性对照相当或超过的频率产生GFP阳性细胞，这表明每个TRC 1-2大范围核酸酶都能有效识别并切割细胞中的预期TRC 1-2识别序列(图4A-4C)。

或者，也将TRC 1-2大范围核酸酶转染到TRC Off1和TRC Off2细胞中，所述细胞在GFP直接重复序列之间包含反向选择的脱靶序列。与预期靶位点TRC 1-2CHO细胞不同，TRCOff1和TRC Off2 CHO细胞中所需的核酸酶仅具有背景水平的GFP阳性细胞，因为它能够对于切割脱靶序列加以区分。在这些实验中，CHO 23-24靶位点充当阳性对照，表明如果CHO23-24核酸酶切割靶位点，仍然可以产生GFP。与TRC 1-2x.87EE相比，新的核酸酶显示出显著改善(即增加)的针对Off1和Off2靶位点的区分，％GFP的水平与TRC 1-2bs阴性对照相当(图5A-5C)。

TRC 1-2.L1469、L.1592、L.1775和L.1843工程化大范围核酸酶的功效还在将大范围核酸酶mRNA引入TRC 1-2细胞中之后2、5和7天以时间依赖的方式测定。在这项研究中，根据制造商的说明使用BioRad Gene Pulser Xcell将TRC 1-2细胞(1.0x10

扩展的iGFFP试验还用于评估同一组的大范围核酸酶在7天的时间内针对两个脱靶Off1和Off2的区分。在这种情况下，根据制造商的说明使用BioRad Gene Pulser Xcell将含有Off1或Off2以及CHO 23-24的细胞用每细胞1x10

在这些研究中，寡聚捕获试验用于鉴定由TRC 1-2大范围核酸酶诱导的脱靶切割。与GUIDE-seq相似，寡核苷酸捕获试验通过在细胞基因组DNA内的断裂位点处捕获寡核苷酸来鉴定TRC 1-2大范围核酸酶产生的潜在脱靶位点。GUIDE-seq是为CRISPR-Cas9产生的DNA断裂而开发的，且存在对化学和分析的一些关键的修改以便将该技术应用于当前的核酸酶。与CRISPR-cas9不同，本发明的工程化大范围核酸酶产生4个碱基对的3’突出端。为了适应这种差异，寡核苷酸捕获中使用的寡核苷酸具有随机的四个碱基对的突出端，所述突出端可以与TRC 1-2大范围核酸酶产生的突出端相容。由于连接粘性末端而不是钝末端的更高效率，观察到更高的插入频率。用编码核酸酶的mRNA和双链DNA寡核苷酸转染细胞。两天后，从这些细胞中分离基因组DNA，并进行超声处理以将DNA剪切成较小的大小。将寡核苷酸衔接子连接至剪切的DNA，并且PCR用于扩增在一端包含衔接子而在另一端包含捕获的寡核苷酸的任何DNA片段。扩增的DNA纯化，并使用标准商业试剂盒制备测序文库。

使用V2 2x150试剂盒在Illumina MiSeq上运行测序文库。过滤数据并分析捕获寡核苷酸的有效位点，并预测潜在的脱靶位点。同样地，实验方案需要将从用于CRISPR-cas9的PAM搜索调整到TRC 1-2大范围核酸酶搜索。开发的软件检查每个序列以确保在序列侧翼有衔接子和捕获的寡核苷酸以验证它是有效的阅读片段。该软件还检查PCR重复并删除相同的阅读片段以帮助减少PCR偏差。将序列阅读片段与参考基因组比对并扫描数千个碱基对的窗口内的分组序列以寻找潜在的TRC 1-2大范围核酸酶位点。

每个TRC 1-2大范围核酸酶是连接的二聚体。每个单体识别九碱基对的半位点，在两个半位点之间的中心有四碱基对的间隔序列。该软件将为每个半位点寻找最接近的序列匹配而没有允许的缺口。在脱靶选择中不考虑中间的四碱基对，因为TRC 1-2大范围核酸酶通常可以在靶位点的这些位置上耐受更高的简并性。该软件输出潜在脱靶位点的列表，及合并的半位点中碱基错配的数量，但不计算中间四碱基对的错配。与消除了用超过六个错配的碱基对鉴定的任何脱靶的CRISPR-Cas9不同，该软件不消除基于任意错配过滤器的任何脱靶。相反，可以通过两种方式减少在基因组内的脆弱点或热点处从寡核苷酸的随机捕获而产生的背景噪声。首先，也可以通过寡核苷酸捕获运行未经处理的模拟样品，且可以从含有核酸酶的样品减去不存在核酸酶的整合位点的窗口。我们还发现，一式三份地运行测定并消除三个重复中至少两个没有重复的任何位点是经验地消除随机整合噪声的好方法。

尽管阅读片段计数与特定位置的切割频率不直接相关，但通常可以突出显示可能更令人关注或更有效的脱靶，因为它们发生的频率更高。图9显示了一种以图形方式可视化寡核苷酸捕获数据作为潜在有效脱靶位点数量的量度。由特定核酸酶产生的每个脱靶根据在该位点被捕获的探针寡核苷酸的独特序列阅读片段数绘制。预期的位点应该具有最高的阅读片段计数，其是所有测试的TRC 1-2大范围核酸酶的情况。较好的核酸酶去除较高计数的位点，并且具有在图的最左侧背景噪声之上的较少点。使用该图可以例如清楚地看到，TRC 1-2L.1592比第一代TRC 1-2x.87EE去除更多的较高阅读片段计数位点。

其他可视化方法使我们能够不仅在特定位点回收的阅读片段数来观察寡核苷酸捕获数据，还通过推定的脱靶位点与预期位点之间的错配数来查看寡核苷酸捕获数据。与随机整合或测序噪声相比，这允许更准确地确定真实的寡核苷酸整合位点。在图10中，脱靶位点根据其在X轴上对准的阅读片段数绘制，并且相比于预期位点的错配碱基对的数量用颜色表示，颜色越深表示脱靶与预期的结合位点之间的整体匹配越接近。方框表示置信度最高的区域。这些框内的脱靶具有高的对准阅读片段计数或与预期位点的非常高的相似度，其任一降低该位点为背景噪音的可能性。比较置信区中的位点，图10证明与TRC 1-2x.87EE相比，优化的大范围核酸酶，尤其是TRC 1-2L.1592的特异性提高。TRC 1-2L.1592显示较高阅读片段计数位点的数量减少，以及与预期的更相似的位点减少。

实施例2

在第一组实验中，针对其基因编辑效率以及编辑后扩增和分化潜力，筛选了四种优化的第二代TRC 1-2大范围核酸酶。三个不同的操作员各自在从不同健康人类T细胞供体获得的T细胞中评估所有核酸酶变体。单采血液分离材料源自Key Biologics(Memphis,TN)的供体K708、K799和K6784。根据以下方案处理K708和K6784 T细胞：使用人CD3阳性选择试剂(StemCell Technologies)进行T细胞富集，使用ImmunoCult抗CD2/CD3/CD28(StemCellTechnologies)进行刺激以及使用4D NucleoFEctor(Lonza)进行核酸酶RNA递送。根据以下方案处理来自K799的T细胞：使用CD4和CD8微珠和CliniMACS细胞分离器(MiltenyiBiotec)进行T细胞富集，使用TransAct(Miltenyi)进行刺激，并使用MaxCyte-GT进行核酸酶RNA递送。

将四种优化的核酸酶变体(TRC 1-2L.1496、L.1592、L.1775和L.1843)的编辑效率、扩增和分化针对祖细胞核酸酶TRC 1-2x.87EE和模拟电穿孔的T细胞进行比较。在用ImmunoCult/TransAct最初刺激三天后，收获T细胞，用编码核酸酶之一的RNA电穿孔，然后立即用编码要插入TRC 1-2切割位点中的CAR基因的AAV6载体转导。平行组装不接受AAV的对照培养物。

在编辑后的第4天和第8天，用NucleoCounter NC-200(ChemoMetec)测定总培养细胞性(cellularity)。编辑效率是通过将培养样品用针对人类CD3-PE的抗体(BioLegend克隆UCHT1)和抗FMC63scFv-AlexaFluor647(内部生产并缀合的新克隆)染色来确定的。通过使用CD4-BV786(克隆OKT4 BioLegend)，CD8-BV711(克隆RPA-T8,BioLegend)，CD62L-BB515(克隆SK11 BD Biosciences)和CD45RO-PE/Cy7(克隆UCHL1,BioLegend)比较CD4和CD8区室中中央记忆、过渡记忆和效应记忆细胞的频率来评估分化。

这些实验的结果在图11中总结。确定了3个不同供体中每种核酸酶的内源性T细胞受体的敲除频率(通过从CD3阳性转变为CD3阴性表型的T细胞来测量)。对于所有测试的3个供体(并使用两种细胞制备方法)，TRC 1-2L.1592和L.1775两者以与TRC 1-2x.87EE相似或更高的效率产生敲除细胞。相比之下，L.1469和L.1843产生更低的敲除频率。对于所有测试的3个供体来说都是如此。L.1775表现出比L.1592略高的编辑效率。TRC 1-2识别序列的编辑增加与CAR基因的插入率增加有关。在所有三个供体中，L.1592和L.1775支持等效或更优的编辑和插入频率。

编辑后第8天，细胞计数数据用于计算CAR T细胞倍数扩增。在所有三个供体中，L.1592、L.1775和L.1843在电穿孔后比x.87EE促进了更大的扩增。相反，L.1469促进的扩增少于x.87EE。在三个供体中的两个中，L.1843允许三种优化的核酸酶的最广泛扩增。L.1775支持的扩增程度因供体而异。

在编辑后的第8天还捕获了CD4：CD8比率和记忆亚群数据。与x.87EE相比，从任何一种优化的核酸酶未观察到对CD4：CD8比率的重大扰动，尽管L.1592、L.1775和L.1843通常会导致更高频率的CD4+细胞。与x.87EE相比，在用L.1469编辑的细胞中观察到了更大程度从中央记忆向过渡和效应记忆群体的分化。相反，当用L.1592，L.1775或L.1843编辑时，同等或更高频率的细胞保持中央记忆表型。

这些研究表明，在编辑效率、细胞扩增和分化特性方面，四种优化的核酸酶中的三种优于TRC 1-2x.87EE。一种核酸酶(L.1469)的性能不如x.87EE。在具有改进的体外功能的三个变体中，变体L.1775支持培养中最高频率的编辑细胞，但支持最小量的编辑后扩增并加速培养中T细胞的分化。变体L.1843允许最大量的编辑后扩增，并保持有利的中央记忆频率，但在敲除频率方面，效率低于L.1775或L.1592。出乎意料的是，使用所有这三个标准，L.1592代表了相对于第一代x.87EE的改进。

使用先前实施例1中所述的方法，对从三个供体中的每一个获得的T细胞的三个重复进行寡核苷酸捕获。寡核苷酸捕获的结果示于图12。点代表在每个推定的脱靶位点以及预期的靶位点回收的测序阅读片段的数目。具有超过7个与预期靶标的错配的推定位点被去除，因为在先前的研究中没有显示出具有超过7个错配的位点被TRC 1-2L.1592切割。每个样品的预期靶标位点用圆圈突出显示。与预期靶标相比的错配数由每个圆圈的暗度表示，较少的错配具有较深的颜色。该图表示寡核苷酸捕获数据，其中未去除模拟背景，并且将阅读片段计数对于每个样品的独特阅读片段数标准化以说明回收的阅读片段总数的差异。如图所示，TRC 1-2L.1592显示出少量的较高阅读片段计数位点，以及少量的与用于CART细胞群体中的编辑和靶向插入时与预期位点更类似的位点。

在第二组的体外研究中，评估了第二代优化的TRC 1-2大范围核酸酶在编辑T细胞方面的效率、编辑的T细胞在编辑后扩增的能力以及用核酸酶变体生成的CAR T细胞对于与带有抗原的靶细胞相遇的反应的能力。

单采血液分离材料源自Key Biologics(Memphis,TN)的供体K708，且使用人CD3阳性选择试剂(StemCell Technologies)富集T细胞，使用ImmunoCult抗CD2/CD3/CD28(StemCell Technologies)刺激，并使用4D NucleoFector(Lonza)递送核酸酶RNA。一式三份的样品平行运行。

三种优化的大范围核酸酶(TRC 1-2L.1592，L.1775和L.1843)的编辑效率、扩增和分化与祖细胞核酸酶TRC 1-2x.87EE和模拟电穿孔的T细胞进行比较。在用ImmunoCult/TransAct最初刺激后三天，收获T细胞，用编码其中一种核酸酶的RNA电穿孔，然后立即用编码要插入TRC 1-2切割位点中的CAR基因的AAV6载体转导。编辑后第4天和第8天，对培养物进行采样以使用Beckman-Coulter CytoFLEX-LX流式细胞仪确定编辑效率和扩增。使用抗CD3-PE(BioLegend克隆UCHT1)评估内源性T细胞受体敲除效率，并使用抗FMC62scFv-AlexaFluor647(内部生产并缀合的新克隆)测量CAR敲入。

通过将CAR T细胞与CD19+肿瘤系Raji或Nalm6以1：1和1：2的E：T比率共培养来评估增殖、细胞毒性和细胞因子的产生。CD19阴性K562骨髓性白血病细胞用作对照。收集培养上清液，并使用Luminex MAGPIX仪器和MilliPlex MAP 15-plex珠组(Millipore)分析分泌的细胞因子。通过用抗CD4-APC(BioLegend克隆OKT4)、抗CD8-FITC(BioLegend克隆RPA-T8)和抗CD19-PE(BioLegend克隆HIB19)对培养细胞样品进行染色，并且使用CytoFLEX-LX获取荧光数据以及细胞计数来评估增殖和靶向杀伤。

与没有RNA电穿孔的T细胞相比(模拟对照)，用TRC 1-2大范围核酸酶x.87EE和L.1775编辑的T细胞在第8天的总培养细胞性减少了约50％(图13A)。用L.1592或L.1843编辑的培养物没有显示出总培养物细胞性减少达到这种程度。当考虑编辑效率，并计算在此过程中生成的编辑细胞的总数时，L.1592生成最多的TCR敲除细胞(图13B)。变体x.87EE和L.1775生成几乎相等数量的编辑细胞，而L.1843生成的最少。当测量培养物中CAR+/TCR-细胞的数量时，也观察到了这种模式(图13C)。

当CAR T细胞与带有抗原的靶细胞共培养时，用TRC 1-2x.87EE产生的CAR T细胞在输入数量(水平虚线定义的–图14)上扩增了近三倍。出乎意料的是，用优化的核酸酶产生的CAR T细胞比x.87EE强烈得多地增殖，在5天后接近10倍扩增。当E：T比率增加到1：2时，x.87EE和L.1843编辑的CAR T细胞的增殖相对于1：1比率减少了约1/2。这在使用L.1775或L.1592产生的CAR T细胞中未观察到，发现它们比其他TRC 1-2核酸酶具有明显更好的性能(p<0.0001，图15A)。当测量剩余的CD19+Raji细胞数量时(以1：2的E：T比率，图15B)，与未接受CAR T细胞的对照培养物相比，所有4种CAR T产物均显示Raji数量减少了90％或更多。使用优化的核酸酶产生的CAR T细胞比使用x.87EE产生的细胞明显更好地消除Raji细胞。

共培养上清液的分析表明，当使用优化的核酸酶而不是x.87EE制备CAR T细胞时，产生更高水平的效应细胞因子。L.1592编辑的CAR T细胞分泌最高水平的IL-2、TNFα、IFNγ和颗粒酶B(图16A-16D)，以及第二高水平的穿孔素(图16E)。在IL-2和TNFα的情况下，x.87EE编辑的CAR T细胞和L.1592编辑的CAR T细胞的细胞因子产生之间的差异是2-3倍，而所有其他差异很小。

总体而言，优化的TRC 1-2大范围核酸酶L.1775、L.1592和L.1843在功能上优于x.87EE。就核酸酶支持CAR T细胞制造的相对能力(图13)以及CAR T细胞对与其靶抗原相遇的反应能力(图14-16)而言，这是正确的。从多个实验中可以得出，看起来虽然L.1775通常支持最高的编辑效率(敲除频率)，且L.1843在编辑后允许T细胞的最大扩增，但L.1592结合了第二高的编辑效率与最高或第二高的扩增以产生最高总体数量的CAR T细胞。重要的是，与其他优化的大范围核酸酶相比，用L.1592产生的CAR T细胞显示出功能优势(增殖、靶细胞杀伤和细胞因子产生)。

进一步进行研究以确定优化的第二代TRC 1-2大范围核酸酶在体外的滞留时间是否比第一代TRC 1-2x.87EE短。在基因编辑和脱靶切割潜在减少的背景下，较短的停留时间可能是有利的。

在这些研究中，通过使用CD4和CD8微珠和LD柱(Miltenyi)通过磁性富集CD4+和CD8+细胞，从单采血液分离产品(Key Biologics)获得T细胞。在含有5％FBS(GE Hyclone)，10ng ml IL-2(Cellgenix)和1％抗生素/抗真菌溶液(Gibco)的Xuri培养基(GE)中，将细胞用抗CD3/抗CD28 TransAct试剂(Miltenyi)激活三天。然后，使用MaxCyte电穿孔系统，细胞用体外转录的编码TRC 1-2x.87EE或TRC 1-2L.1592核酸酶的mRNA(Trilink)电穿孔，每1e6细胞1ug mRNA。随后，在含有30ng/ml IL和1％的抗生素/抗真菌溶液的无血清Xuri培养基中，通过同源重组(SAB Tech)用带有供体模板的重组AAV6载体转导细胞，该供体模板编码设计用于在TRC 1-2位点插入的抗CD19嵌合抗原受体。电穿孔后6小时，将样品定量并重悬于含有5％FBS、30ng/ml IL-2和1％抗生素/抗真菌溶液的Xuri培养基中。在96小时的时间点，通过使用LD柱、CliniMACS缓冲液和CD3微珠(Miltenyi)的磁性耗竭从TRC电穿孔组中去除了残留的未编辑CD3+T细胞。然后，对于其余的实验，在Xuri培养基+5％FBS/1％抗-抗+10ng/ml IL-15和IL-21中在37摄氏度下培养细胞。

在电穿孔后6小时、24小时、48小时、96小时和168小时，对T细胞样品进行定量，且将等量的活细胞沉淀并重悬在添加了蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(EMDMillipore)中，充分混合，且冷冻保存或在冰上孵育30分钟，然后再按照下文对于蛋白质印迹所述的进一步处理。

激活来自同一供体的模拟细胞，并在与核酸酶处理组相同的培养基中培养，和在核酸酶处理组电穿孔后24小时收获。

对于蛋白质印迹分析，将裂解物离心，并将上清液转移至新试管中并置于冰上。通过BCA试验(Pierce)测定蛋白质浓度，且每个样品的15μg总蛋白质为样品缓冲液+DTT(NuPage)，在90℃下孵育10分钟。将5μg每个样品装入凝胶的每个孔中。来自电穿孔后24小时时间点的单个模拟样品用作对照。电泳后，将样品转移(NuPage电泳系统和试剂)到PVDF膜(Novex)上。将膜用在TBS-T中的5％脱脂奶粉封闭，并用一抗染色：

印迹 一抗

A 兔多克隆抗核酸酶(Precision BioSciences专有的，以1：6500使用)

B 小鼠抗B-肌动蛋白(Sigma，以1：15000使用)

将膜洗涤6次，然后与适当的二抗一起孵育：

印迹 二抗

A 山羊抗兔HRP(Invitrogen，以1：50000使用)

B 山羊抗小鼠HRP(Invitrogen，以1：75000使用)

清洗步骤后，将膜暴露于ECL Prime(Amersham)中，包裹在Saran包装膜中，并使用UVP ChemiDoc-It 815成像仪捕获图像。

如图17所示，如预期的，在模拟样品中没有检测到核酸酶表达。在用编码TRC1-2x.87EE或TRC1-2L.1592核酸酶的mRNA电穿孔的样品中，核酸酶蛋白在电穿孔后6小时分析的最早时间点高度表达。电穿孔后24小时，蛋白质仍是可检测到的；但是，两个核酸酶的表达观察到均显著低于电穿孔后6小时时，而该时间点TRC 1-2L.1592明显低于TRC 1-2x.87EE。在TRC 1-2L.1592mRNA处理的样品中，在电穿孔后48小时或随后的时间点核酸酶蛋白检测不到，而在该时间点仍可检测到TRC 1-2x.87EE蛋白表达。肌动蛋白表达在所有样品和时间点上均一致，表明每个样品添加了等量的蛋白质。

这些研究表明，TRC1-2x.87EE和TRC1-2L.1592核酸酶在mRNA电穿孔后6小时以高水平表达。但是，T细胞中TRC 1-2L.1592的表达比TRC 1-2x.87EE更快地降低。如图11所示，与TRC 1-2x.87EE相比，TRC 1-2L.1592没有显示降低的基因编辑效率，尽管它的表达时间较短。保留高基因编辑活性同时减少表达持续时间是TRC 1-2L.1592的理想特性，且代表了与TRC 1-2x.87EE相比意想不到的和有利的改进，因为这些特性与TRC 1-2L.1592比于TRC1-2x.87EE增强的(即增加的)耐受性和更高的T细胞增殖能力，以及更低的脱靶活性相关。

实施例3

在大规模工艺过程中对TRC 1-2L.1592大范围核酸酶进行了进一步的评估以确定相对于第一代TRC 1-2x.87EE大范围核酸酶，CAR T细胞的成规模生产是否得到了改善。

用于利用TRC 1-2x.87EE产生同种异体CAR T细胞的大规模过程开始于来自健康的资格预审的供体的新鲜Leukopak。在对靶T细胞进行免疫磁性富集之前，洗涤Leukopak产物以除去血小板。然后将富集的T细胞洗涤到生长培养基中，并使用激活试剂激活。在3天的激活期后，将细胞洗涤并在电穿孔缓冲液中浓缩。添加编码TRC 1-2x.87EE的mRNA，并通过电穿孔装置处理细胞和mRNA的混合物。用含有编码CAR插入基因的AAV载体的生长培养基稀释电穿孔的细胞。扩增期后，在第8天收集细胞，并进行CD3阳性群体的免疫磁性耗竭。耗竭后，靶CD3阴性细胞在生长培养基中再扩增一段时间。最后，在第13天收集细胞，洗涤，并浓缩至冷冻保护剂溶液中并冷冻。与对于TRC 1-2x.87EE所述的基本相同的进行用于利用TRC1-2L.1592生成同种异体CAR T细胞的大规模过程，除了TRC 1-2L.1592试验中的生长培养基配方是无动物起源的(AOF)。

在生产过程中的关键时间点测定活细胞的总数(图18)。从第0天到第8天耗竭步骤，细胞数量是相当的。但是，由于TRC 1-2L.1592的显著更高的T细胞受体敲除效率，因此TRC 1-2L.1592过程中的耗竭步骤有利地回收超过了TRC 1-2x.87EE处理过程中回收的细胞数两倍的细胞。第8天到第13天之间的扩增速率相似，导致第13天的总存活细胞高大约两倍。

在每个生产过程的第8天通过流式细胞术确定CD3敲除效率(即内源性T细胞受体敲除的指标)(图19)。出乎意料的是，TRC 1-2L.1592处理过程中(总活细胞中)CD3阴性、基因编辑的细胞的百分比比TRC 1-2x.87EE处理过程高出近20％。

最后，在每个生产过程中的三个关键时间点通过流式细胞术测量CAR敲入效率(图20)。出乎意料的是，TRC 1-2L.1592处理过程中的(CD3阴性细胞中)CAR阳性的转导细胞的百分比与TRC 1-2x.87EE处理过程相比高约25％。在第8天和第13天过程结束之间，两个过程的CAR敲入百分比均是稳定的，从而导致TRC 1-2L.1592处理过程结束时，相似地更高的CAR阳性细胞的百分比。

总之，这些研究令人惊讶地表明，TRC 1-2L.1592核酸酶显著提高了最终同种异体细胞治疗产品的数量以及质量。TRC 1-2L.1592更有效地敲除内源性T细胞受体，从而导致基因编辑的CD3阴性细胞的更大群体，使整个生产过程的产量提高了大约两倍。另外，TRC1-2L.1592潜在地为靶向双链断裂处与CAR基因插入片段的同源重组提供改善的环境，如通过改善的CAR敲入效率证明的。CAR阳性百分比的增加导致显著更高的药物产品纯度，具有较少的CAR阴性细胞。