基于巨噬细胞的疗法

摘要

本发明涉及用于治疗肝病的自体分离的非极化人巨噬细胞和用于治疗有此需要的人的纤维化的方法的巨噬细胞。

说明书

背景技术

肝硬化是西方世界的一个主要健康问题。在英国，肝病是第五大死亡原因，2010年估计有超过100万人死于肝硬化。由于进行性组织损伤、纤维化疤痕和肝功能丧失，该疾病与高发病率相关，并且对终末期疾病的唯一治疗选择是肝移植。然而，供体器官的可用性不能满足需求，并且终末期肝病患者通常不符合移植资格。那些接受移植的人需要终身免疫抑制，这增加了健康风险。2015年，据报道，英国有611名患者被列入主动肝移植名单。患者可能要等上多达两年才能接受肝移植。注册后一年，仍有17％的患者在等待肝移植名单。同样，在美国，有许多肝移植等待名单(LTWL)上的患者可能永远无法确定供体器官。每年约有1700名患者在等候名单上死亡或因健康状况恶化而被从名单中划去，而约有6500名患者已在等候名单上超过6个月。终期肝病的治疗在全球备受关注。

迫切需要替代疗法，来防止或延缓肝病向终末失代偿阶段的转变。

肝硬化的病理可由多种致病因素驱动，包括酗酒、肥胖、代谢紊乱、病毒感染或自身免疫性疾病，导致健康肝细胞组织和肝脏结构的逐渐丧失，由成肌纤维细胞衍生的纤维化瘢痕取代。人们越来越认识到，如果清除了导致肝损伤的因素，如酒精、病毒等，那么肝纤维化可以是至少部分可逆的，使得肝再生得以发生。

实验性肝损伤后肝再生的动物模型表明，巨噬细胞可能在纤维化肝病的控制和修复中起关键作用。肝脏中的巨噬细胞是一个异质的细胞群体，包括常驻的库普弗细胞(Kuppfer cell)和募集的造血源巨噬细胞，在肝脏损伤后的再生应答中具有不同的作用，包括例如吞噬作用、维持免疫耐受、通过激活肝星状细胞/产生细胞因子和降解细胞外基质来促进和解决炎症和纤维化。

已经报道了许多针对肝脏疾病的巨噬细胞导向的治疗方法(例如在Tacke等人J.Hepatology 2017；66:1300-1312中进行了综述)，但由于疾病状态下巨噬细胞功能和相互作用的复杂性，它们面临各种挑战。此外，巨噬细胞亚群可以发挥非常相反的功能，这表明对于任何治疗性干预，都需要仔细考虑和确定待施用的巨噬细胞的特定性质以及它们的最佳剂量和时机。

发明内容

迄今为止，尚未评估过对人类施用非极化单核细胞源的成熟巨噬细胞及其在肝硬化治疗中的效果。因此，在第一方面，本发明提供了用于肝病治疗的自体分离的非极化人巨噬细胞。

在一些实施方案中，根据本发明的任何方面或实施方案使用的非极化人巨噬细胞是单核细胞源的。在一些实施方案中，根据本发明的任何方面或实施方案使用的非极化人巨噬细胞是成熟的巨噬细胞。适当地，根据本发明使用的巨噬细胞的特征在于至少一种与巨噬细胞相关的表面标志物如25F9或CD206的高表达或升高的表达；在一些实施方案中，与这些标志物在前体或来源细胞如新分离的外周血单核细胞上的表达水平相比，表达是“高”或“升高的”。其他表面标志物包括CD163或CD169的一种或多种的存在和/或高表达。在一些实施方案中，与第0天的分离的CD14+单核细胞相比，可以检测到CD93的缺失和炎性细胞因子受体CCR2的减少。在特定的实施方案中，非极化巨噬细胞的特征在于CD45/CD14的阳性表达，具有大于80％的活力，并且其表面标志物25F9和CD206的MFI(平均荧光强度)比在第0天的原始单核细胞的MFI高5倍以上。

在一个实施方案中，根据本发明的任何方面或实施方案使用的自体分离的非极化人巨噬细胞由从患病患者外周血中分离的CD14+单核细胞制备。适当地，这些CD14+单核细胞与M-CSF一起孵育至少48小时，或3至5天，或7天。在一些实施方案中，M-CSF以约100ng/ml的浓度使用，但是应当理解，可以改变该量以获得具有所需特性的非极化巨噬细胞。在一个实施方案中，根据本发明的任何方面或实施方案使用的非极化巨噬细胞通过本文实施例中所述的方法获得或可获得。特别地，所述方法如本文的实施例4A或4B中所述。在其他方面，本发明提供了通过实施例4A或4B所述的方法获得或可获得的自体巨噬细胞。在一些实施方案中，所述单核细胞在本文所述的T细胞培养基中孵育。

在一些实施方案中，根据本发明的自体分离的非极化人巨噬细胞用于肝硬化，优选地，其中肝硬化是由酗酒、肥胖、代谢紊乱或病毒感染中的任一种引起的，最优选由酒精引起的肝硬化、NASH或HCV。

在其他实施方案中，自体分离的非极化人巨噬细胞用于静脉内施用。合适地，所述剂量是大约10

在本发明的另一方面，提供了巨噬细胞，其用于通过向需要其的人施用一个或多个剂量的所述巨噬细胞来治疗纤维化，优选地治疗肝硬化的方法。在一个实施方案中，将1、2、3或更多个剂量的所述巨噬细胞施用于需要其的人，其中在每个所述剂量之间有大约一个月的间隔。在一个实施方案中，第一剂量在第1天，第二剂量在第30天，以及第三剂量在第60天。在一个实施方案中，所述巨噬细胞被包含在药物组合物中。在一个实施方案中，所述巨噬细胞的施用导致纤维化的减少。

在一些实施方案中，所述需要其的人患有肝硬化性肝病。适当地，所述人是MELD评分为10至16的患病患者。

每个剂量中的巨噬细胞的数量可以根据要治疗的个体而变化。在一些实施方案中，每个剂量包含至少1x10

在一个实施方案中，每个剂量的施用是通过静脉内施用。适当地，静脉内施用是通过外周静脉。

用于根据本发明该方面的方法中的巨噬细胞优选处于非极化状态。适当地，这种巨噬细胞的特征在于25F9或CD206的高表达，高于其来源的单核细胞上的表达。在一些实施方案中，所述非极化巨噬细胞来源于人自身的PBMC，即是自体的。在其他实施方案中，所述非极化巨噬细胞可以是同种异体的，例如来源于健康供体，用于对患有相关疾病的患者施用。在其他实施方案中，所述非极化巨噬细胞可以来源于干细胞骨髓(BM)、胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。本文描述了产生合适的巨噬细胞的方法。

在另一方面，本发明提供了用于治疗肝硬化的方法中的自体巨噬细胞，所述方法是通过向MELD评分为10至16的人静脉内施用多达10

本发明的其他方面和任何方面的实施方案在以下编号的条款中阐述：

1.一种制备自体分离的非极化人巨噬细胞的方法，所述方法包括:

a)从患者(合适地为患病的人类患者)的外周血中分离单核细胞；

b)将这些分离的单核细胞在含有50至150ng/ml M-CSF的培养基中孵育至少48小时。

2.根据条款1所述的方法，其中将所述分离的单核细胞与100ng/mL的M-CSF孵育。

3.根据条款1或条款2所述的方法，其中将所述分离的单核细胞在培养袋中孵育。

4.根据条款1-3中任一项所述的方法，其中将所述分离的单核细胞与M-CSF孵育7天。

5.根据条款1-4中任一项所述的方法，其中将所述分离的单核细胞以每平方厘米和每毫升2x10

6.根据条款1-5中任一项所述的方法，其中所述单核细胞的特征在于CD14的表面表达。

7.根据条款1-6中任一项所述的方法，其中使用CD14微珠选择来分离所述单核细胞。

8.根据条款1-7中任一项所述的方法，其中，与M-CSF孵育后，自体分离的非极化人巨噬细胞的特征在于CD45/CD14的阳性表达，具有大于80％的活力，并且表面标志物25F9和CD206的MFI(平均荧光强度)比在第0天的原始单核细胞的MFI高5倍以上。

9.根据条款1-8中任一项所述的方法，其中所述患病患者患有肝硬化。

10.根据条款9所述的方法，其中肝硬化是由酗酒、肥胖、代谢紊乱或病毒感染的任一种引起的。

11.一种用于对患病患者施用的自体非极化人巨噬细胞的制剂，其包括:

a)根据条款1-10中任一项所述的方法产生的非极化人巨噬细胞；和

b)赋形剂

其中：

c)非极化人巨噬细胞表现出高表达选自25F9、CD206、CD163、CD169或其组合的至少一种表面标志物；和/或

d)其中所述制剂包含至少1x10

e)其中所述制剂被配制成用于静脉内或皮下施用的输注剂；和/或

f)其中所述制剂包含少于4.5％v/v的血清。

12.根据条款11所述的制剂，其中所述赋形剂包含0.9％v/v盐水和0.5％v/v人血清白蛋白。

13.一种通过施用自体分离的非极化人巨噬细胞治疗人肝病的方法。

14.根据条款13所述的方法，其中所述非极化人巨噬细胞是单核细胞源的。

15.根据条款13-14中任一项所述的方法，其中所述非极化人巨噬细胞的特征在于源细胞上25F9或CD206的表达升高。

16.根据条款13-15中任一项所述的方法，其中所述非极化人巨噬细胞是根据条款1至10中任一项所述的方法制备的。

17.根据条款13-16中任一项所述的方法，其中所述施用是输注的，优选静脉内输注的。

18.根据条款17所述的方法，其中所述输注是通过外周静脉。

19.根据条款13-17中任一项所述的方法，其中所述施用或输注的剂量为10

20.根据条款19所述的方法，其中所述患者接受三次输注，间隔一个月。

21.根据条款13-19中任一项所述的方法，其中所述患者的MELD评分为10-16。

22.一种用于在MELD评分为10-16的患者中治疗肝病的方法，其包括施用治疗有效量的a)通过根据条款1-10中任一项所述的方法制备的自体巨噬细胞；和b)抗纤维化剂和/或G-CSF。

23.一种促进肝脏中肝细胞再生的方法，其包括将有效量的自体分离的非极化人巨噬细胞施用到患者体内。

24.根据条款23所述的方法，其中所述施用是静脉内，优选是通过外周静脉施用。

25.根据条款23或24所述的方法，其中所述患者患有酒精引起的肝硬化。

26.根据条款23-25中任一项所述的方法，其中每剂量施用10

附图说明

图1：正常供体的GMP巨噬细胞培养的初步优化。A)CliniMACS CD14珠使用LS柱分离单核细胞产生了高度纯化的CD14级分(n＝26)。B)ClinicMACs Prodigy CD14选择从来自肝硬化志愿者的单采血液收集中产生了同样高度富集的CD14+级分。C)肝硬化患者外周血中的CD14数量呈上升趋势(n＝11，p＝0.108)。D)尽管不显著，但TexMACS产生了最高和最一致的巨噬细胞产量(n＝6-10)。E)来自TexMACS培养的巨噬细胞的大小也明显大于在AIM-V培养基中培养的巨噬细胞(p<0.0001，n＝5)。F)来自R&D的GMP级M-CSF产生的巨噬细胞产量与标准M-CSF相似，但巨噬细胞标志物25F9的表达更强(n＝6)。G)显微成像表明，DMEM+5％AB在巨噬细胞培养物中产生凝集和粘附，这不同于在限定培养基(defined media)中产生的那些。(Fraser等人Cytotherapy 2017；19(9):1113-1124)。

图2:新鲜单核细胞和冷冻单核细胞的GMP巨噬细胞的表型分析。分离血沉棕黄层单核细胞，将等分试样冷冻并储存在LN2中，剩余用于产生巨噬细胞。解冻后，将单核细胞培养成巨噬细胞，并比较表型。虽然许多标志物在由解冻的单核细胞制成的巨噬细胞中没有变化，但CD206和CD163在来自冷冻单核细胞的巨噬细胞中显著减少，而CCR2显著增加(n＝10)。

图3:单核细胞和巨噬细胞的吞噬作用。(A)亮视野/异硫氰酸荧光素荧光的EVOS图像，表明pHRodo珠的摄取(放大倍数×100)。(B)摄取的定量表明单核细胞或巨噬细胞摄取的珠没有显著差异，并且摄取的珠的数量也没有差异(n＝4)。数据表示为平均值±SD。

图4:极化巨噬细胞的微观和表型变化A)极化巨噬细胞的EVOS亮视野图像显示出明显的形态差异，具有棱角的、尖锐的M1/M(IFNg)和细长的光滑纺锤形M2/M(IL-4)巨噬细胞(放大倍数x400)。B)流式细胞术分析显示巨噬细胞标志物25F9在总体上没有显著差异，但是IL-4刺激的巨噬细胞显著增加其CD206表达，但在IFN-g处理的巨噬细胞中降低(n＝5，平均值+/-sd，p<0.05)。

图5:健康供体巨噬细胞的分泌蛋白质组分析。第7天巨噬细胞(n＝3)未经处理或用TNF-α和poly I:C(PIC)或IFNg和LPS刺激12小时，然后用BioRad多重ELISA分析。IL-10(A)和IL-1Ra(B)均被TNF-α/PIC显著上调，而VEGF(D)也被上调。IL-12p40水平(C)不受TNF-α/PIC影响，但被LPS/IFN-g显著增加。数据表示为平均值+sd，*p<0.05。

图6:来自肝硬化患者的临床级巨噬细胞的表型组(n＝7)。A)发布标准显示MFI在第0天单核细胞和第7天巨噬细胞之间增加。B)扩展组包括两个其他清除剂受体(CD163/CD169)以及巨噬细胞迁移的标志物。应注意，在CCR2第7天的数据中有一个单一的离群值，其在Grubb的测试之后被排除在分析之外(·)。数据表示为平均值+/-，p＜0.05。

图7:GMP肝硬化患者巨噬细胞的稳定性。A)即使在环境温度下48小时后，活力也没有显示出明显的下降。B)25F9的表达随时间稳定下降，但即使在48小时，仍远高于有效性所需的5倍增加。C)CD206保持高水平直到收获后约24-30小时，然后下降得更快，但仍远高于为试验标准确立的5倍阈值(n＝3)。

图8:在健康志愿者(n＝5)和肝硬化患者(n＝8)中，源自第0天单采血液的单核细胞到分化7天后之间的基因变化，(ns，无显著性，*P<0.05，平均值和SEM)。(Moore JK等人Cytotherapy 2015；17(11):1604-16)。

图9:MATCH研究中所有患者的平均ΔMELD。不包括来自患者9、10和11的d360数据。

图10:MATCH患者的平均ΔMELD，以及BIL、CRE和INR这3个组分的贡献。不包括来自患者9、10和11的d360数据。

图11:MATCH研究中所有患者的ELF评分。

图12:MATCH研究中所有患者的ΔELF。

图13:MATCH研究中所有患者的HA值。

图14:MATCH研究中所有患者的PNIIIP值。

图15:MATCH研究中所有患者的TIMP1值。

具体实施方式

巨噬细胞

巨噬细胞是吞噬细胞，有两种不同的来源——源自胎儿细胞并分布在体内所有组织中的组织常驻巨噬细胞，以及源自外周血单核细胞的巨噬细胞，它们可以响应如损伤、炎症和疾病等信号而分化。单核细胞源的巨噬细胞具有一系列依赖于环境的功能，并涉及传染性生物的控制、受损细胞的清除和组织的修复。早期将巨噬细胞分类为M1(经典激活的、炎性的)和M2(旁路激活的，抗炎的)是一种过度简化，而巨噬细胞可以根据激活方法和细胞因子环境而同时具有炎性和促炎症消退(pro-resolution)功能，例如，如在Murray等人(Immunity 2014；41:14-20)和Tacke等人(J.Hepatology 2017；66:1300-1312)中所述。

在肝脏中，巨噬细胞可以通过以下两种方式来促进纤维发生：激活促纤维化细胞因子转化生长因子(TGF)-β，以及通过血小板衍生生长因子(PDGF)、IL-1β和肿瘤坏死因子-α刺激成肌纤维细胞增殖。它们对纤维化的消退(resolution)也至关重要，因为它们提供了丰富的疤痕降解基质金属蛋白酶(MMPs)来源。它们产生诸如MMP-9的因子，所述因子可促进疤痕消退所需的肝星状细胞凋亡。它们还吞噬细胞碎片，从而消除潜在的促炎信号。例如，Tacke等人综述了多种响应(J.Hepatology 2017；66：1300-1312)。

肝硬化供体具有大量的的循环单核细胞，通常占总有核细胞(TNC)的30％以上，这大大超过了健康供体或捐献进行CD14处理的患者的报告值(Campbell等人Methods MolMed.2005；109:55-70)，并且这与疾病进展密切相关(Zimmermann等人PLoS One 2010；5(6):e11049)。然而，以前还没有确定从肝硬化患者分离的单核细胞能够分化成与健康志愿者的功能性巨噬细胞相当的功能性巨噬细胞。本文提供的数据报告，来自肝硬化患者和健康志愿者的巨噬细胞的功能之间没有显著变化，这表明循环单核细胞的体外成熟可以成为产生用于临床细胞疗法的治疗性成熟巨噬细胞的技术。因此，有利地，提供了自体细胞(即肝硬化患者自身细胞)的使用，这使得来自细胞疗法的生物不相容性和免疫反应的风险最小化。此外，由于超出了(overwhelm)试剂和选择柱的能力，起始数目非常高的靶细胞可能会降低总体选择效率。尽管肝硬化患者的单核细胞数量很高，但CliniMACS Prodigy系统令人惊讶地能够重复分离出足够的细胞，以满足CD14+细胞产量至少为40％的生产标准。

如本文所述，所述单核细胞在符合GMP的、无抗生素的限定培养基中培养，产生约45％的向巨噬细胞的转化率。所述培养条件与现有技术不同。

非极化巨噬细胞

适当地，根据本发明的“非极化巨噬细胞”是成熟的巨噬细胞(即已经从来源的巨噬细胞祖细胞或前体细胞(例如单核细胞)充分分化)但未极化(即未受到进一步的刺激以诱导特定的功能能力)。非极化巨噬细胞也可以被描述为“幼稚的”或“未激活的”。

在本发明任何方面的一个实施方案中，非极化巨噬细胞是单核细胞源的细胞。因此，非极化巨噬细胞可从例如通过白细胞去除术或从血液样品中去除的外周血单个核细胞(PBMC)，以及通过分离和培养单个核细胞而产生出来。适当地，单核细胞是CD14+细胞，其可以通过选择CD14表达来分离。本文描述了适当的方法，并且所述方法可以包括磁性微珠选择。

在一些实施方案中，将PBMC从待治疗的患者中去除，以获得可产生自体非极化巨噬细胞的患者来源的单核细胞。例如，本文描述了从患者去除PBMC的适当的方法。有利地，使用自体细胞可以避免非自体方法遇到的问题，例如引入外源细菌或病毒、生物不相容性和免疫排斥。在其他实施方案中，非极化巨噬细胞可以是同种异体的，即，源自从健康供体获得的单核细胞。适当地，所述健康供体是匹配的，例如HLA型匹配的。简而言之，产生非极化巨噬细胞的方法包括在M-CSF的存在下培养从PBMC分离的CD14+单核细胞以产生成熟的巨噬细胞。适当地，分离的单核细胞可以孵育至少48小时或更久，例如3天或更多天，优选7天。在一些实施方案中，在加工或培养以产生成熟的非极化巨噬细胞之前，可以将患者来源的PBMC保留一段时间，例如过夜。在一些实施方案中，可以在培养袋中提供这些分离的细胞。

在一些实施方案中，根据本文实施例部分所述的培养方法和条件，从患者来源的单核细胞产生非极化巨噬细胞。在一些实施方案中，所述培养基是适合于从源细胞产生那些非极化巨噬细胞的任何培养基。所述培养基可以不含血清。适当地，所述培养基是化学限定的培养基(chemically defined media)，例如向其添加适当浓度的M-CSF的符合优质生产规范(Good Manufacturing Practice(GMP))的限定培养基。在一些实施方案中，M-CSF可以是重组M-CSF，优选重组人M-CSF。有利且令人惊讶的是，所述培养基是针对T细胞培养和扩增而优化的培养基，而不是针对巨噬细胞而特别优化的培养基。在一个实施方案中，所述培养基是TexMAC(Miltenyi)或AIM-V(Thermofisher)。

适当地，M-CSF的浓度为50至150ng/ml，例如100ng/ml。在一些实施方案中，用于制备自体非极化巨噬细胞的方法产生具有大于80％的活力的非极化巨噬细胞群，其中活力可以通过本领域技术人员熟悉的方法来测量，例如本文所述的DRAQ7染色。

适当地，非极化的成熟巨噬细胞的特征在于表面标志物“25F9”和CD206中的至少一种或两种的升高的表达。“升高的”表达是指与来源的巨噬细胞祖细胞或前体细胞(例如单核细胞(例如，第0天分离的/未处理的单核细胞))中这些标志物的表达相比增加的表达。在一些实施方案中，“升高的”表达是指与来源细胞相比至少约五倍的表面标志物的表达。标志物的表达可以通过本领域技术人员已知的方法确定，包括本文所述的荧光标记技术。合适的水平或表达可以使用本文描述的方法通过平均荧光强度(MFI)来测量。25F9是指由eBioscience/Thermofisher提供的巨噬细胞标志物抗体，其可识别成熟巨噬细胞上的标志物，但不识别未成熟的巨噬细胞或单核细胞或任何其他血细胞上的标志物。抗体结合的标志物是未知的；该名称源自抗体克隆。详情请见此处(

在一些实施方案中，来源的单核细胞是CD45

在“非极化巨噬细胞”中表达可能增加的其他标志物包括升高水平的CD163和CD169，以及降低水平的CCR2。在一些实施方案中，由于涉及清除和摄取受损细胞、纤维化物质和促炎性细胞因子的特定表面标志物或清除剂受体的表达，非极化巨噬细胞可被描述为促炎症消退和/或抗纤维化。巨噬细胞的命名法综述于例如Martinez和Gordon(F1000PrimeRep.2014；6:13)中。

在一些实施方案中，非极化的成熟巨噬细胞可以通过与合适的极化因子孵育而极化成M1或M2样表型，例如M1极化可以通过与INF-γ或TLR激动剂(如LPS或聚(I:C))孵育而获得，而M2极化可以通过用IL4刺激而获得。

非极化的成熟巨噬细胞也可以来源于干细胞，其包括胚胎干细胞(ES细胞)、人诱导多能干细胞(人iPSC)和骨髓来源的造血干细胞。

由多能干细胞(例如ES细胞和iPSC)产生巨噬细胞的多种方法是本领域已知的，例如参见van Wilgenburg等人(PLoS One 2013；8(8):e71098)。确定发育的细胞系具有多能性并具有正常核型的方法描述于例如Yang等人(Stem Cells 2017；35(4):886-897)中。合适的人诱导多能干细胞系包括SFCi55，例如在共同未决申请PCT/GB2017/052769中描述的。

从这种人iPS细胞系产生巨噬细胞祖细胞的合适方法可以如下:将它们维持在StemPro培养基中，该培养基是通过向具有Glutamax的DMEM/F12(Invitrogen)补充StemPro补充剂(Invitrogen)、1.8％BSA(Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Invitrogen)和20ng/ml人碱性FGF(Invitrogen)而制备的。iPSC分化为巨噬细胞的方法改编自van Wilgenburg等人。在第0天，从6孔板的一个汇合孔中去除用过的培养基，并以补充有细胞因子Mix 1(50ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF和20ng/ml SCF)的2ml StemPro(ThermoFisher)替换。使用EZPassageTM工具切割细胞，并用巴斯德移液器轻轻移出。5将它们等分在超低附着6孔板(Corning)的两个孔中，并向每个孔中添加2ml具有细胞因子Mix1的X-VIVO

产生巨噬细胞祖细胞的其他方法描述于：Yeung等人Sci.Rep.2015；5:8908,Zhuang等人J Immunol Methods.2012；385(1-2):1-14,Sneju等人Oncoimmunology 2014；3(1):e27927,Hale等人PLoS One 2015；10(5):e0124307,Zhang等人Circ Res.2015；117(1):17-28,Mucci等人Stem Cell Reports 2016；7(2):292-305以及van Wilgenburg等人PLoS One 2013；8(8):e71098。

通过在集落刺激因子-1(CSF-1)(也称为M-CSF)和IL-3存在下培养ES细胞以形成拟胚体(EB)，可以产生ES细胞衍生的巨噬细胞(ESDM)。当EB粘附在组织培养塑料上时，巨噬细胞祖细胞是不粘附的，因此被释放到培养基中。巨噬细胞祖细胞然后可以在不同的时间点收获，例如在10或20天后，并铺在未经处理的Petri培养皿上，在存在单独的CSF-1的情况下培养。该过程可产生单核细胞样细胞，其粘附到塑料上形成单层并成熟成为ESDM。

可以通过检测成熟巨噬细胞特异性标志物(包括25F9(人类巨噬细胞特异的)和/或CD11b)的存在，来监测ES细胞成熟成为ESDM。另外，人巨噬细胞的特征可能在于不存在单核细胞标志物CD93。有利地，所描述的方法产生基本上同质的ESDM群。

肝病

在一些方面或实施方案中，本发明提供了对患者肝病的治疗，特别是对已经遭受导致肝纤维化或肝硬化的肝损伤的患者的治疗。慢性肝损伤导致疤痕沉积和肝细胞丢失。疤痕组织过度积聚导致肝纤维化。在这个阶段，纤维化是可以被逆转的。但是，未经治疗的纤维化最终可能导致肝硬化。在一些实施方案中，肝病是由肝细胞损伤引起的肝硬化，例如，是肝细胞源性疾病，例如病毒源性疾病(包括经治疗的(持续病毒应答)丙型肝炎(HCV)、乙型肝炎)、酗酒引起的损伤(与酒精有关的肝病(ALD))、或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，其包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(包括由糖尿病或肥胖症引起的NASH)、隐源性肝硬化、血色素沉着症或α-1-抗胰蛋白酶缺乏症。在一些实施方案中，已经消除了潜在的病因(例如，因酗酒而遭受损害的患者不再饮酒，或因HCV而遭受损害的患者不再患有HCV等)。

适合根据本发明的任何方面或实施方案的治疗或用途的患病患者可以是具有相关疾病和严重程度的患者。

治疗

如本文所用，术语“治疗”是指减少纤维化、防止进展或部分或完全减少受试者肝病或损伤的临床症状的干预。适当地，所述治疗可以导致肝再生的增加或加速。有利地，根据本发明使用的巨噬细胞提供抗纤维化和促再生细胞。

适当地，根据本发明施用非极化人巨噬细胞可导致以下有益效果的一种或多种：受试者的纤维化减少或肝病减少、坏死减少、肝细胞增殖增加、促炎细胞因子水平降低、纤维化部位的吞噬作用增加。

典型地，肝病是通过MELD(终末期肝病的测量)评分来测量的，MELD是一种从血清标志物血液胆红素、肌酐和凝血潜能衍生的评分系统。该评分最初是为了预测死亡率而开发的，用于确定肝移植患者的优先顺序。它预测三个月和一年的死亡，并预测代偿性肝硬化患者的临床失代偿。

MELD的变化是比最初单独MELD更重要的死亡决定因素。对于任何给定的MELD，在过去30天内MELD评分的变化幅度和方向是一个重要的独立的死亡预测因子。涉及肝移植的所有主要西方监管机构(英国移植、欧洲移植和UNOS)都使用MELD评分来帮助确定肝移植的分配优先顺序。在一些实施方案中，使用根据本发明的非极化人巨噬细胞的治疗可以导致受试者的MELD改变。在其他实施方案中，治疗可导致MELD评分的肝脏相关组分之一即胆红素(BIL)和/或国际标准化比率(INR)改变。

在其他实施方案中，使用根据本发明的非极化人巨噬细胞的治疗可以导致UKELD改变。测量在受试者中的效果的其他方法包括通过瞬时弹性成像，通过使用增强型肝纤维化测试)-ELISA，通过使用标记的代谢物和肝脏MRI扫描测量肝脏代谢和再生活性，或使用MRI测量肝脏体积和血流量，来评估肝脏纤维化变化。在其它实施方案中，使用根据本发明的非极化人巨噬细胞的治疗可以导致ELF或ELF评分的肝脏相关组分之一的改变，所述ELF评分的肝脏相关组分即透明质酸(HA)、金属蛋白酶的组织抑制剂-1(TIMP-1)和III型原胶原的前肽(PIIINP)。在其他实施方案中，可以测量疾病特异性生物标志物和表位，例如新表位(neoepitope)。例如，使用根据本发明的非极化人巨噬细胞的治疗可以导致精确切割的III型胶原的N末端前肽(PRO-C3)和/或III型螺旋胶原降解的肽(C3M)的改变。在纤维组装过程中，三型胶原蛋白的N端前肽被N-蛋白酶切割，但有时前肽的去除是不完全的，因此PIIINP可以是原纤维形成和降解的标志物，而PRO-C3则是原纤维形成的标志物，因为PRO-C3对N蛋白酶切割位点具有特异性。例如，ELF、ELF的肝脏相关组分、PRO-C3和C3M可以根据以下文件的任意一个进行测量：Thiele等人(Gastroenterology 2018；154:1369-1379)、Irvine K等人(Liver International 2016,370-377 ISSN 1478-3223)、Barascuk N等人(Clinical Biochemistry 34(2010)899-904)以及Nielsen MJ等人(Am J Transl Res2013；5(3):303-315)。

如本文所用，术语“受试者”是指可以从肝损伤的治疗中受益的任何个体。所述受试者可以是人受试者、需要治疗的人，例如患病的患者。适当地，适合于根据本发明的治疗的人是患有肝硬化性肝病的人，优选MELD评分在10和16之间的患者。患有发展中的肝病的人也可能适合于这种治疗，例如患有门静脉高压症的人/患者。

剂量

将理解的是，非极化巨噬细胞的治疗有效量或剂量将取决于多种因素，其包括要治疗的受试者的体重。举例来说，治疗有效量可以是1x10

在一些实施方案中，根据本发明的巨噬细胞可以在合适的储存或转移袋中提供。

施用

根据本发明的任何方面的巨噬细胞产物可以通过任何合适的方式被施用到受体体内，所述方式包括但不限于经皮、皮下、肌内、肠胃外、肠内、静脉内、腹膜内、眶内、视网膜内，通过组织移植以及进入脑脊液。有利地，所述巨噬细胞产物静脉内施用，例如静脉内注射或输注。

早期的研究支持门静脉递送将递送到肝脏的细胞数量最大化，然而，这种递送途径在临床环境中是不理想的，因为在肝硬化患者中反复地门静脉施用会导致门静脉高压和凝血病的风险。本发明人已经发现，尽管静脉内注射后可能较少数量的细胞分布到肝脏，但是这种递送途径在临床上是有效的。

在一些实施方案中，根据本发明使用的非极化巨噬细胞在药学上可接受的载体中制备。药学上可接受的载体可以是能够将非极化巨噬细胞递送至受试者的任何物质，并且可以包括任何合适的稀释剂或赋形剂或其组合。在一些实施方案中，非极化的巨噬细胞可以在补充有人白蛋白溶液的盐水溶液中递送。

因此，根据本发明使用的非极化巨噬细胞可以在药物组合物中提供，所述药物组合物包含治疗有效量的非极化巨噬细胞和药学上可接受的载体。

在合适的实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂和相容的载体。所述组合物还可包含抗氧化剂和/或防腐剂。在一些实施方案中，药物组合物可以包含DMSO，例如5-10％的DMSO。

组合

在一些实施方案中，根据本发明的巨噬细胞治疗可以与肝病的另一种治疗组合。合适的治疗包括用G-CSF的治疗。在一些实施方案中，另一种治疗可以包括抗纤维化药物治疗。合适的抗纤维化药物例如由Wang等人(

鉴于本公开，本发明的各种另外的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。

本说明书中提及的所有文件均通过引用整体并入本文。

在本文中使用的“和/或”应被视为两个指定的特征或组分中的每一个具有或不具有另一个的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就像每一个在本文中单独列出一样。

除非上下文另外指示，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且等同地适用于所描述的所有方面和实施方案。

现在将通过实施例的方式并参考上述附图来说明本发明的某些方面和实施方案。

实施例1优化符合GMP的单核细胞培养

从健康供体中分离细胞

作为健康供体单核细胞来源的供体血沉棕黄层由苏格兰国家输血服务(SNBTS)献血中心(爱丁堡，英国)根据SNBTS样本管理13-12和14-02提供。从PBMC中的CD14选择：使用Histopaque 1077(Sigma)通过密度离心将PBMC与正常供体血沉棕黄层分离。洗涤后，使用CliniMACS GMP级CD14微珠和LS分离磁柱(Miltenyi Biotec)从单个核细胞级分中分离出CD14+单核细胞。简要地，将细胞重悬于PEA缓冲液(磷酸盐缓冲盐水[PBS]加2.5mmol/L乙二胺四乙酸[EDTA]和人血清白蛋白[0.5％最终体积的Alburex 20％，Octopharma])中至合适的浓度，按照制造商的说明与CliniMACS CD14珠一起孵育，然后洗涤并通过磁化的LS柱。洗涤后，将纯化的单核细胞从去磁化的柱中洗脱，洗涤并重新悬浮在相关培养基中用于培养。

从肝硬化患者中分离细胞

为了进行全面的GMP工艺优化和验证，通过白细胞去除术在爱丁堡皇家医院的SNBTS临床单采血部门收集了外周血单个核细胞(PBMC)。东南苏格兰研究伦理委员会02授予了伦理批准。根据赫尔辛基宣言，获得了关于单采血捐献的知情同意。由白细胞去除术分离CD14+细胞：通过白细胞去除术从肝硬化供体中收集PBMC，所述肝硬化供体给予了知情同意以参加研究。资格标准为18至75岁的年龄范围，并且肝硬化由以下任何一项定义：先前的肝活检证实肝硬化的组织学特征、瞬时弹性成像(Fibroscan)>18kPa和/或在临床上认为与肝硬化的诊断有关的临床和放射学特征。为了试验的目的，排除标准包括那些需要持续抗病毒治疗的病况，如病毒性肝炎、平均酒精摄入量>21单位/周(男性)或>14单位/周(女性)、之前3个月使用利尿疗法未能很好控制的腹水、之前3个月需要住院治疗的脑病、之前3个月的门静脉高压性出血、肝细胞癌、之前5年内的其他癌症、以前的肝移植或目前在等待名单上、存在可能危及安全分娩和妊娠和/或哺乳的临床相关急性疾病。用于单个核细胞(MNC)的外周血白细胞去除术是使用Optia单采系统通过无菌采集进行的。使用了MNC标准采集程序，处理了2.5倍血液量。使用符合GMP的功能封闭系统(CliniMACS Prodigy系统，MiltenyiBiotec)进行CD14细胞的分离。简而言之，对白细胞去除术产物取样以进行细胞计数，并取等分试样用于预分离流式细胞术。确定单核细胞(CD14+)的百分比和绝对细胞数，并根据需要调整体积以满足选择所需的标准(≤20×10

细胞计数

使用Sysmex XP-300自动分析仪(Sysmex)，对总MNC和分离的单核细胞级分进行细胞计数。由于Sysmex始终低估了巨噬细胞的数量，因此使用TruCount管(BectonDickinson)通过流式细胞仪进行了巨噬细胞数量的评估，以确定绝对的细胞数量。使用流式细胞仪(FACSCanto II，BD Biosciences)和一组针对人类白细胞的抗体(CD45-VioBlue、CD15-FITC、CD14-PE、CD16-APC)评估分离的纯度，并通过确定中性粒细胞污染的量(CD45int、CD15pos)来评估产物质量。

细胞收获

对于正常供体来源的巨噬细胞，在第7天使用细胞解离缓冲液(Gibco，ThermoFisher)和巴斯德移液器将细胞从孔中取出。将细胞重新悬浮在PEA缓冲液中并计数，然后对每个测试中大约10

细胞分选效率

使用CD14 CliniMACS珠的分选效率极高，并且所有方法的结果都是相当的，无论细胞来自血沉棕黄层还是来自肝硬化患者的白细胞去除术；珠标记的细胞经过人工标记，并通过LS色谱柱分离，或使用全自动CliniMACS prodigy系统进行处理。对使用CliniMACSCD14试剂和LS柱分离的、26个不同的正常供体分离物的预分选以及阳性和阴性级分的流式细胞术分析表明，从20.5％的单核细胞的初始平均值开始，阳性级分被高度富集(95.9％)，并且阴性级分损失最小(4.1％)(图1A)。在使用CliniMACS Prodigy分离的肝硬化供体样本中观察到非常相似的数字(图1B)，尽管肝硬化供体在其收集物中具有较高(尽管不显著)的单核细胞的初始平均百分比(图1C)。

培养来自健康供体样品的单核细胞的最佳培养基

研究了用于巨噬细胞分化的最佳培养基，并使用血沉棕黄层单核细胞测试了三种候选培养基；补充有5％AB血清(SNBTS)的杜氏改良Eagle培养基(DMEM；LifeTechnologies)，以及两种化学限定的无血清培养基——AIM-V(Thermo Fisher)和TexMACS(Miltenyi)。TexMACS培养基是一种优化的无血清细胞培养基，其针对人和小鼠T细胞和调节性T细胞的培养和扩增进行了优化，其包含预选的人血清白蛋白、稳定的谷氨酰胺和酚红(临床版本中没有)。使用在37℃和5％CO2下、在湿润气氛中、在具有100ng/mL特级巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，Miltenyi)的每种培养基中培养了7天的血沉棕黄层单核细胞进行实验。将细胞以1.8×10

从冷冻单核细胞衍生巨噬细胞

还对从新鲜和冷冻/解冻的单核细胞衍生的巨噬细胞进行了比较(参见结果部分)。从血沉棕黄层中分离出单核细胞，然后将一份等分试样在冷冻保存培养基(CryostorCS10，Sigma)中冷冻，并将其余部分新鲜培养。将冷冻的等分试样在数天后解冻，并像以前一样培养。

对于治疗用途，冷冻单核细胞的等分试样以产生多个巨噬细胞剂量将是有吸引力的。评估了巨噬细胞产量或表型是否存在任何显著差异，以致无法使用冷冻的储液。数据表明，产量和表型都有差异。特别是，CD206和CD163的表达明显下降(图2)。CCR2表达也有相反的增加(图2)。这表明来自冷冻单核细胞的巨噬细胞会发展出更像M1的经典激活表型。此外，在这些实验中，来自解冻的单核细胞的巨噬细胞的平均活力明显低于来自新鲜的单核细胞的那些(活力45.5％vs.新鲜巨噬细胞的75.2％，n＝4–6，P＝0.0098)。得出的结论是，差的活力(以及因此的产量)和不利的表型阻碍了从用于最初的临床用途的冷冻细胞进一步开发成为巨噬细胞产品。

实施例2扩展功能分析：健康供体巨噬细胞

单核细胞和巨噬细胞的吞噬性摄取

正常巨噬细胞的功能表征研究了细胞吸收颗粒的能力。使用仅在进入酸性核内体时才发出荧光的pHRodo珠，测试了来自血沉棕黄层CD14细胞的单核细胞和巨噬细胞的吞噬性摄取。简而言之，将单核细胞或巨噬细胞与1-2uL的pHRodo大肠杆菌生物颗粒(LifeTechnologies，Thermo Fisher)一起培养1h，然后移出培养基并洗涤细胞以除去未被吞噬的颗粒。使用EVOS显微镜(Thermo Fisher)评估吞噬作用，使用ImageJ软件(NIH免费软件,https://imagej.nih.gov/ij)捕获图像并定量珠粒的细胞摄取。在这些研究中使用pHRodo珠可以给出准确的评估，因为珠在被吞噬之前是透明的，并且一旦暴露在吞噬溶酶体的酸性环境中就会发出荧光。根据EVOS图像对吞噬作用进行量化(图3A)，评估每个视野的总细胞数、包含荧光珠的总细胞数，然后评估每个细胞的珠数。使用这种方法对吞噬作用进行定量表明，单核细胞和巨噬细胞之间的摄取没有差异(图3B)。进一步分析表明，用TNF-α和poly I：C刺激巨噬细胞对吞噬作用没有显著影响(数据未示出)。

收获时巨噬细胞的极化

表型分析表明收获时的巨噬细胞未极化，但确实显示了旁路激活的巨噬细胞具有高CD206和CD169表达特征(图6)。IFN-γ和IL-4刺激用于确定收获时的巨噬细胞是否能够响应极化细胞因子暴露。通过用干扰素(IFN)-γ(50ng/mL)或白介素(IL)-4(20ng/mL)处理第7天的巨噬细胞48小时，以诱导极化为M1或M2表型(或分别为M[IFNγ]vs.M[IL-4])，来检测向限定的分化的巨噬细胞极化的能力。48小时后，通过EVOS亮视野显微镜观察细胞，然后如前所述收获细胞并进行表型分析。在极化的第2天，培养物中存在形态学差异，用IFN-γ处理的巨噬细胞显示出圆的、有棱角的形状(图4A)，而经IL-4处理的巨噬细胞则表现出特征性的纺锤形形态。尽管两种培养物之间的25F9标志物表达没有显著差异，但经过IL-4处理的细胞能够显著上调CD206(极化的M2a巨噬细胞的特征)(图4B)。这种极化是体外巨噬细胞的特征，并不一定预测在受体中的功能性能力。

巨噬细胞的细胞因子和生长因子分泌情况

细胞产物评估的最后一个方面是确定静止时和刺激后巨噬细胞因子的分泌情况(图5)。巨噬细胞如前所述由健康供体血沉棕黄层产生，并且所述巨噬细胞或是未经处理的，或是用肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子(TNF)-α(50ng/mL，Peprotech)和聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly I:C，一种与TLR3结合的病毒同源物，1_g/mL，Sigma)刺激，以模拟炎症肝脏中存在的情况，或是用脂多糖(LPS，100ng/mL，Sigma)加IFN-γ(50IU/mL，Peprotech)刺激，以产生最大的巨噬细胞活化。将第7天的巨噬细胞孵育过夜，并收集上清液并离心除去碎片，然后在-80℃下保存直至测试。分泌蛋白质组分析是使用27重人细胞因子试剂盒和9重基质金属蛋白酶试剂盒在Magpix多重酶联免疫分析板读板器(BioRad)上进行的。静止时巨噬细胞表达低水平的IL-1Ra、IL-10和血管内皮生长因子(VEGF)。使用TNF-α和poly I:C刺激来模拟发炎的环境，并导致促再生/抗炎因子VEGF，IL-10和IL-1Ra的产生显著增加，但IL-12没有增加。通过LPS/IFN-γ刺激，IL-10表达没有强烈增加，但是相反，通过LPS/IFN-γ刺激，IL-12表达强烈增加。TNF-α/poly I:C刺激增加了CCL3、4和5的表达，但CCL2没有明显增加。巨噬细胞组成性表达高水平的MMP 7、9和12，而低表达MMP3。在刺激或极化后，该MMP表达没有被明显调节，并且MMP 1、7、8、10和11的表达可忽略不计(数据未示出)。

实施例3过程验证肝硬化患者

培养来自患者样品的单核细胞

将来自Prodigy分离、白细胞去除术的培养的单核细胞以每平方厘米和每毫升2×10

过程验证

细胞培养和识别数据用于设计GMP过程，然后对其进行验证。从广泛的表型分析组中选择了一组标志物，以用作包含细胞识别和功能标志物的产品发布标准。这些是用于谱系确定的CD45和CD14的表达，以及作为巨噬细胞成熟标志物的25F9。另外，选择CD206作为吞噬作用和清除能力的替代标志物，其将有效地鉴定合适的功能性巨噬细胞的开发。活力染色剂DRAQ7作为GMP发布标准组的最终组分被包括在内。为了获得有关细胞产物的更多信息，使用了第二种表型集，称为扩展组，用于评估CD163、CD169和CCR2的表达。该组对来自7位肝硬化志愿者的白细胞去除的捐献物进行了验证。

使用FACSCanto II(BD Biosciences)或MACSQuant 10(Miltenyi)流式细胞仪分析单核细胞和巨噬细胞表面标志物的表达。对每个样本采集大约20000个事件。通过将细胞与特异性抗体孵育(最终稀释度为1：100)，在新鲜分离的和第7天的成熟细胞中进行白细胞标志物的细胞表面表达。将细胞与FcR阻断剂(Miltenyi)孵育5分钟，然后在4℃与抗体混合物孵育20分钟。在PEA中洗涤细胞，并以1：100加入死细胞排除染料DRAQ7(BioLegend)。对细胞进行一系列如下所示的表面标志物的染色：CD45-VioBlue、CD14-PE或CD14-PerCPVio700、CD163-FITC、CD169-PE和CD16-APC(均来自Miltenyi)、CCR2-BV421、CD206-FITC、CXCR4-PE和CD115-APC(均来自BioLegend)以及25F9-APC和CD115-APC(eBioscience).使用向前和侧面散射以及DRAQ7死细胞鉴别器(BioLegend)对单核细胞和巨噬细胞进行门控，以排除碎片、双峰和死细胞，并使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。从最初的详细表型开始，开发了一个组作为发布标准(CD45-VB/CD206-FITC/CD14-PE/25F9-APC/DRAQ7)，所述标准限定了来自单核细胞的功能性巨噬细胞的开发。对于25F9和CD206两者，确定巨噬细胞的平均荧光强度(MFI)比第0天单核细胞的水平高五倍。开发了第二组，其评估了作为扩展组的一部分的其他标志物，所述扩展组由CCR2-BV421/CD163-FITC/CD169-PE/CD14-PerCP-Vio700/CD16-APC/DRAQ7组成，但并未被用作细胞产品的发布标准。

使用CliniMACS Prodigy设备选择CD14+细胞，并如上所述培养细胞。第0天富集的单核细胞和第7天相应的巨噬细胞的每种标志物的表达水平显示在图6中。分化的细胞保留CD45+CD14+表达，并且巨噬细胞中25F9、CD206、CD169和CD163显著升高。与单核细胞相比，CCR2在巨噬细胞中被显著下调。还使用Transwell趋化实验评估了收获后的巨噬细胞的迁移能力，并证实尽管CCR2的表达下调，它们仍具有体外迁移至合适靶标的能力(数据未示出)。

来自肝硬化患者的收获后的单核细胞的稳定性

如在过程优化(临床级0.9％盐水和0.5％HAS)中确定的那样，对在最佳赋形剂中于受控室温(21-22℃)下储存的巨噬细胞进行了稳定性研究。在过程开发过程中测试了多种赋形剂，其包括PBS/EDTA缓冲液；仅具有0.5％HAS(Alburex)、仅具有0.9％盐水或具有含0.5％HAS的盐水的PBS/EDTA缓冲液。发现具有0.5％HAS的0.9％盐水(Baxter)的赋形剂可以维持最佳的细胞活力和表型(数据未示出)。在三个过程优化运行中研究了收获后的肝硬化供体的巨噬细胞的稳定性，并在过程验证运行中评估了更有限的时间点范围(n＝3)。收获并重悬于赋形剂中(0.9％的用于输注的生理盐水，0.5％的人血清白蛋白)后，将袋子保存在环境温度(21–22℃)中，并在收获后0、2、4、6、8、12、24、30和48h取样。对每个样品运行发布标准抗体组，并从第0天起测量活力和25F9和CD206的几何MFI的平均倍数变化。在每个时间点取样后，评估细胞的表型和活力。来自所有三个过程优化运行的数据表明，细胞活力和表型(25F9/CD206MFI)都保持到收获后48小时(图7)，这表明所述过程可重复地生产出非常稳定的细胞产物。因此确定了发布标准，即巨噬细胞应为CD45/CD14阳性，具有大于80％的活力，并且25F9和CD206的MFI比第0天的原始单核细胞的MFI高5倍以上。表1详细列出了包括稳定性的发布标准过程验证的所有最终结果。

表I.来自过程验证运行1-3的数据。

详细信息包括将用作最终产品发布标准的参数。

实施例4用于人体试验的自体单核细胞衍生的巨噬细胞疗法

A.第一阶段试验的单次升序剂量(SAD)

患者招募

资格标准是18至75岁的年龄范围、10.00至16的MELD范围和由以下任何一项限定的肝硬化：酒精相关性肝病(ALD)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、隐源性肝硬化、血色素沉着症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、经治疗(持续病毒反应)的丙型肝炎。排除标准为之前3个月门静脉高压性出血、之前3个月使用利尿疗法未能很好控制的腹水、之前3个月需住院治疗的脑病，肝细胞癌(排除增生性或不确定的结节，包括再生结节或其他结节)，肝细胞癌的先前诊断，器官移植的先前接受者或组织的先前接受者。其他排除标准包括：酗酒或药物滥用、居住地点远离研究地点、不服从或无法合作、影响参与研究的临床相关急性疾病、过去5年内癌症的存在或病史、怀孕或哺乳。

表2.在MATCH研究的SAD阶段研究的患者特征。

自体非极化巨噬细胞产品

利用CliniMACS

研究设计：

所述研究的第一阶段被设计为标准的3+3设计，以测试人类中细胞的安全性和耐受性。将自体巨噬细胞以剂量递增的方式施用于参与者，其中以三种不同剂量的细胞(10

来自肝硬化患者的再生巨噬细胞

已经证明再生巨噬细胞可以来自肝硬化患者。在来自健康和肝硬化患者的离体分化巨噬细胞中，包括CCL2、MMP9、IL10、CCL3在内的数种标志物的基因表达没有显著不同(图8)。

对于MATCH试验，在多个时间点测量了MELD。首次筛查前3-6个月进行了首次测量。该数据点称为d-120，但是每位患者的实际血液测试是在3-6个月时间段内的不同时间点进行的。还在初步筛选测量了MELD，即基线(d-14)，然后是d7、d14、d30、d60、d90、d180和d360。d0是巨噬细胞产物的施用日。

MELD由三个组分组成；胆红素(BIL)、肌酐(CRE)和国际标准化比率(INR)，将它们在以下公式中结合以产生MELD评分。

MELD＝10*[(0.957*In(CRE(mmol/l)*0.011312217))+(0.378*In(BIL(mmol/l)*0.058479532))+(1.12*In(INR))]+6.43(Huo等人Journal of hepatology 2005；42(6):826-32)。

MELD的任何组分均不能产生负贡献，并且MELD分数会四舍五入到最接近的整数。表3显示了MATCH试验中所有受试者的MELD数据。计算了所有患者的相对于基线(d-14)的ΔMELD，其中负值表示临床状况有所改善。图9示出了所有患者的平均ΔMELD。最显著的反应来自S05，其中观察到MELD短暂降低了6点。巨噬细胞疗法被认为是对潜在病因是肝细胞驱动的肝硬化患者具有更好的效果。由于患者S04的病因是原发性胆源性胆管炎(PBC)，它不被认为是肝细胞驱动的，因此在该患者中观察到较少的治疗响应也就不足为奇了。

为了理解非极化巨噬细胞疗法对ΔMELD的机制贡献，评估了MELD的每种组分对ΔMELD的贡献，如图10所示。结果表明，对于三种组分中的两种，BIL和INR，MELD评分降低，其中ΔMELD变化的62％由BIL的贡献解释，其余部分来自INR。对于CRE组分的贡献，MELD评分没有观察到显著变化。这些结果表明，观察到的MELD改善是由于肝功能的直接改善。胆红素是由红细胞死亡导致的，是血红蛋白代谢的副产物。循环胆红素被肝细胞葡萄糖醛酸化，然后经胆管排泄。因此，BIL是肝细胞健康和功能的量度。INR是肝脏合成维生素K衍生的凝血因子的能力的结果，尽管对肝细胞功能的直接测量比BIL少，但也表明肝脏健康有所改善。相比之下，CRE是肾脏标志物，是与肝硬化相关的多器官衰竭的替代指标。因此，所述数据表明，非极化疗法不仅对MELD产生有益的作用，而且这种作用是由肝功能的改善驱动的，这与所提出的治疗作用机制相一致。

表3.来自MATCH试验的MELD数据

*d-120不是绝对时间点，这些数据点是在试验(筛选)开始之前的3-6个月的时间范围内收集的。

同样在MATCH试验中，在不同时间点(包括筛选(d-14)、d30、d60、d90、d180和d360)对提供纤维化的无创测量的增强型肝纤维化(ELF)进行了测量。d0是巨噬细胞产物的施用日。图11显示了MATCH研究中所有患者的ELF评分，而图12显示了MATCH研究中所有患者的ΔELF。图13、14和5分别提供了ELF分数的每种组分-HA值、PNIIIP和TIMP1的细目。这些图显示在所测量的360天内，增强的肝纤维化的总体减少。

在不同的时间点(包括筛选、筛选(d-14)、d30和d90)测量了精确切割的III型胶原N末端前肽(PRO-C3)和III型螺旋胶原降解的肽(C3M)。

表4.来自MATCH试验的PRO-C3数据

PRO-C3的数据表明纤维化形成减少。

表5.来自MATCH试验的C3M数据

B.二期试验

进行随机对照研究。28名参与者被随机分配接受标准医疗护理。28位参与者在30天之内总共接受了3次10

自体非极化巨噬细胞产品

将来自Prodigy分离、白细胞去除术的培养的单核细胞以每平方厘米和每毫升2×10

从白细胞去除产物中分离出CD14+单核细胞，并对其进行了表征，然后将其转移到研究人员所在地，如上所述。

测得的结果：

通过以下评估/测量中的一项或多项评估接受输注的患者的结果：MELD和ΔMELD；UKELD和ΔUKELD；瞬时弹性成像(FibroscanTM，Echosens，France)(Fraquelli等人Gut,2007；56(7):968-73)-一种非侵入性方法，用于在筛选时、第90天，第180天和第360天时评估肝纤维化；增强型肝纤维化(ELF)测试-用于基质组分和涉及其转换(turnover)的酶(透明质酸、基质金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP-1)、III型前胶原(PIIINP))的ELISA测定，计算得出的ELF评分与肝纤维化水平相关；31-P-MRS和肝脏MRI扫描：在治疗后第90天，随机地，对肝脏代谢和再生活性进行非侵入性、定量测量；用于肝体积和血流量的MRI。评估结果的其他方法包括CLDQ(慢性肝病问卷)(Younossi等人Gut1999；45(2)；295-300)和Newsome等人Gastroenterol Hepatol.2018；3:25-36描述的方法。

其他分析可能包括测量蛋白质标志物的变化：在细胞外基质(ECM)转换期间，蛋白水解切割的基质降解片段或新表位被释放到体循环中。特定的MMP对每个ECM蛋白的切割会产生独特的新表位。对于个体的纤维增生性疾病，这些新表位可能是比它们的起源蛋白更准确的诊断和预后标志物。用于检测此类特定蛋白质片段以及识别和量化疾病的方法包括Protein Fingerprint

参考文献

Campbell JD,Piechaczek C,Winkels G,Schwamborn E,Micheli D,HennemannS,Schmitz J.Isolation and generation of clinical-grade dendritic cells usingthe CliniMACS system.Methods Mol Med.2005；109:55-70.PubMed PMID:15585913.Fraquelli M,Rigamonti C,Casazza G,Conte D,Donato MF,Ronchi G,等人Reproducibility of transient elastography in the evaluation of liver fibrosisin patients with chronic liver disease.Gut.2007；56(7):968-73

Fraser AR,Pass C,Burgoyne P,Atkinson A,Bailey L,Laurie A,W A McGowanN,Hamid A,Moore JK,Dwyer BJ,Turner ML,Forbes SJ,Campbell JDM.Development,functional characterization and validation of methodology for GMP-compliantmanufacture of phagocytic macrophages:A novel cellular therapeutic for livercirrhosis.Cytotherapy.2017 Sep；19(9):1113-1124.doi:10.1016/j.jcyt.2017.05.009.Epub 2017 Jun 30.PubMed PMID:28673774；PubMed CentralPMCID:PMC5571439

Hale C,Yeung A,Goulding D,Pickard D,Alasoo K,Powrie F,Dougan G,Mukhopadhyay S.Induced pluripotent stem cell derived macrophages as acellular system to study salmonella and other pathogens.PLoS One.2015 May 6；10(5):e0124307.doi:10.1371/journal.pone.0124307.eCollection 2015.PubMed PMID:25946027；PubMed Central PMCID:PMC4422593.

Huo TI,Wu JC,Lin HC,Lee FY,Hou MC,Lee PC,Chang FY,Lee SD.Evaluationof the increase in model for end-stage liver disease(DeltaMELD)score overtime as a prognostic predictor in patients with advanced cirrhosis:riskfactor analysis and comparison with initial MELD and Child-Turcotte-Pughscore.J Hepatol.2005 Jun；42(6):826-32.Epub 2005 Mar 31.PubMed PMID:15885353.

Irvine K,Wockner LF,Shanker M,Fagan KJ,Horsfall LU,Fletcher LM,Ungerer JPJ,Pretorius CJ,Miller GC,Clouston AD,Lampe G and Powell EE.TheEnhanced liver fibrosis score is associated with clinical outcomes anddisease progression in patients with chronic liver disease.LiverInternational 2016,370-377 ISSN 1478-3223

Martinez FO,Gordon S.The M1 and M2 paradigm of macrophage activation:time for reassessment.F1000Prime Rep.2014 Mar 3；6:13.doi:10.12703/P6-13.eCollection 2014.Review.PubMed PMID:24669294；PubMed Central PMCID:PMC3944738.

Moore JK,Mackinnon AC,Wojtacha D,Pope C,Fraser AR,Burgoyne P,BaileyL,Pass C,Atkinson A,Mcgowan NW,Manson L,Turner ML,Campbell JD,ForbesSJ.Phenotypic and functional characterization of macrophages with therapeuticpotential generated from human cirrhotic monocytes in a cohortstudy.Cytotherapy.2015 Nov；17(11):1604-16.doi:10.1016/j.jcyt.2015.07.016.Epub2015 Sep 3.PubMed PMID:26342993；PubMed Central PMCID:PMC4596388.

Mucci A,Kunkiel J,Suzuki T,Brennig S,Glage S,Kühnel MP,Ackermann M,Happle C,Kuhn A,Schambach A,Trapnell BC,Hansen G,Moritz T,Lachmann N.MurineiPSC-Derived Macrophages as a Tool for Disease Modeling of HereditaryPulmonary Alveolar Proteinosis due to Csf2rb Deficiency.Stem CellReports.2016 Aug 9；7(2):292-305.doi:10.1016/j.stemcr.2016.06.011.Epub 2016Jul 21.PubMed PMID:27453007；PubMed Central PMCID:PMC4982988.

Murray PJ,Allen JE,Biswas SK,Fisher EA,Gilroy DW,Goerdt S,Gordon S,Hamilton JA,Ivashkiv LB,Lawrence T,Locati M,Mantovani A,Martinez FO,Mege JL,Mosser DM,Natoli G,Saeij JP,Schultze JL,Shirey KA,Sica A,Suttles J,Udalova I,van Ginderachter JA,Vogel SN,Wynn TA.Macrophage activation and polarization:nomenclature and experimental guidelines.Immunity.2014 Jul 17；41(1):14-20.doi:10.1016/j.immuni.2014.06.008.PubMed PMID:25035950；PubMed CentralPMCID:PMC4123412.

Nielsen MJ,Nedergaard AF,Sun S,Veidal SS,Larsen L,Zheng Q,Suetta C,Henriksen K,Christiansen C,Karsdal MA,Leeming DJ.The neo-epitope specificPRO-C3 ELISA measures true

formation of type III collagen associated with liver and muscleparameters.Am J Transl Res 2013；5(3):303-315.ISSN:1943-8141

PN Newsome,R Fox,AL King.；Granulocyte colony-stimulating factor andautologous CD133-positive stem-cell therapy in liver cirrhosis(REALISTIC):anopen-label,randomised,controlled phase 2 trial.Lancet GastroenterolHepatol.2018；3:25–36,

Senju S,Koba C,Haruta M,Matsunaga Y,Matsumura K,Haga E,Sasaki Y,IkedaT,Takamatsu K,Nishimura Y.Application of iPS cell-derived macrophages tocancer therapy.Oncoimmunology.2014 Jan 1；3(1):e27927.Epub 2014 Feb 14.PubMedPMID:24800175；PubMed Central PMCID:PMC4008454.

Tacke F.Targeting hepatic macrophages to treat liver diseases.JHepatol.2017 Jun；66(6):1300-1312.doi:10.1016/j.jhep.2017.02.026.Epub 2017 Mar4.Review.PubMed PMID:28267621.

Thiele M,

van Wilgenburg B,Browne C,Vowles J,Cowley SA.Efficient,long termproduction of monocyte derived macrophages from human pluripotent stem cellsunder partly-defined and fully-defined conditions.PLoS One.2013 Aug 12；8(8):e71098.doi:10.1371/journal.pone.0071098.eCollection 2013.PubMed PMID:23951090；PubMed Central PMCID:PMC3741356.

Wang P,Koyama Y,Liu X,Xu J,Ma HY,Liang S,Kim IH,Brenner DA,KisselevaT.Promising Therapy Candidates for Liver Fibrosis.Front Physiol.2016 Feb 16；7:47.doi:10.3389/fphys.2016.00047.eCollection 2016.Review.PubMed PMID:26909046；PubMed Central PMCID:PMC4754444.

Yang CT,Ma R,Axton RA,Jackson M,Taylor AH,Fidanza A,Marenah L,FrayneJ,Mountford JC,Forrester LM.Activation of KLF1 Enhances the Differentiationand Maturation ofRed Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells.StemCells.2017 Apr；35(4):886-897.doi:10.1002/stem.2562.Epub 2017 Jan 19.PubMedPMID:28026072；PubMed Central PMCID:PMC5396323.

Yeung AT,Hale C,Xia J,Tate PH,Goulding D,Keane JA,Mukhopadhyay S,Forrester L,Billker O,Skarnes WC,Hancock RE,Dougan G.Conditional-ready mouseembryonic stem cell derived macrophages enable the study of essential genesin macrophage function.Sci Rep.2015 Mar 10；5:8908.doi:10.1038/srep08908.PubMed PMID:25752829；PubMed Central PMCID:PMC4354151.

Younossi ZM,Guyatt G,Kiwi M,Boparai N,King D.Development of a diseasespecific questionnaire to measure health related quality of life in patientswith chronic liver disease.Gut.1999；45(2):295-300.

Zimmermann HW,Seidler S,Nattermann J,Gassler N,Hellerbrand C,ZerneckeA,Tischendorf JJ,Luedde T,Weiskirchen R,Trautwein C,Tacke F.Functionalcontribution of elevated circulating and hepatic non-classical CD14CD16monocytes to inflammation and human liver fibrosis.PLoS One.2010 Jun 10；5(6):e11049.doi:10.1371/journal.pone.0011049.PubMed PMID:20548789；PubMed CentralPMCID:PMC2883575.

Zhang H,Xue C,Shah R,Bermingham K,Hinkle CC,Li W,Rodrigues A,Tabita-Martinez J,Millar JS,Cuchel M,Pashos EE,Liu Y,Yan R,Yang W,Gosai SJ,VanDornD,Chou ST,Gregory BD,Morrisey EE,Li M,Rader DJ,Reilly MP.Functional analysisand transcriptomic profiling of iPSC-derived macrophages and theirapplication in modeling Mendelian disease.Circ Res.2015 Jun 19；117(1):17-28.doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.305860.Epub 2015 Apr 22.PubMed PMID:25904599；PubMed Central PMCID:PMC4565503.

Zhuang L,Pound JD,Willems JJ,Taylor AH,Forrester LM,Gregory CD.Purepopulations of murine macrophages from cultured embryonic stemcells.Application to studies of chemotaxis and apoptotic cell clearance.JImmunol Methods.2012 Nov 30；385(1-2):1-14.doi:10.1016/j.jim.2012.06.008.Epub2012 Jun 18.PubMed PMID:22721870.