一种基于富硒土壤中微生物多样性指数分析方法

摘要

本发明公开一种基于富硒土壤中微生物多样性指数分析方法，包括以下步骤：A、称取富硒土壤样本，并进行微生物DNA提取；B、对提取的宏基因组DNA进行质量检测，基因组DNA的纯度和完整性检测分别通过NanoDrop微量分光光度计和琼脂糖凝胶水平电泳完成，DNA质量浓度通过Qubit检测获得；C、采用二代测序技术进行高通量测序，需要对提取的宏基因组样本进行文库构建；D、数据分析：测序得到的原始数据中，使用FastQC对下机数据进行质控，根据质检报告结果对数据进行过滤，通过快速比对准确估计物种的相对丰度，得到微生物群落组成信息，使用GraPhlAn基于分类等级绘制可视化进化树，构建物种群落结构图。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物研究技术领域，特别涉及一种基于富硒土壤中微生物多样性指数分析方法。

背景技术

微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点，目前，对于土壤微生物多样性的研究主要是借助于分子生物学的手段，直接从土壤中获得微生物的DNA片段进行分析，从而使环境微生物多样性分析成为一种尽可能全面的方法；近年来，关于土壤中微生物多样性分析的方法报道很多，然而，主要侧重于提取土壤中细菌群落的总DNA的提取及分析，较少关注土壤中真菌群落总DNA的提取及分析。

硒作为人与动物必需的微量元素和植物有益的营养元素，在人体中构成含硒蛋白与含硒酶成分，是谷胱甘肽过氧化物酶的组成部分；是一种具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、保护和修复细胞、提高人体免疫力、解除重金属毒害等多功能的生命营养素。在富硒土壤中种植作物之前，需要对土壤进行检测，对微生物多样性进行分析，了解富硒土壤中的特性，可以为农作物的种植和管理提供依据。

现有的微生物多样性分析方法，样本丰度存在误差，常规多样性文库构建采用PCR方法进行文库构建，所涉及PCR引物由于Tm值等不同容易造成偏差，使分析结果出现偏差。

发明内容

本发明旨在提供一种基于富硒土壤中微生物多样性指数分析方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种基于富硒土壤中微生物多样性指数分析方法，包括以下步骤：

A、称取富硒土壤样本，并进行微生物DNA提取；

B、对提取的宏基因组DNA进行质量检测，基因组DNA的纯度和完整性检测分别通过NanoDrop微量分光光度计和琼脂糖凝胶水平电泳完成，DNA质量浓度通过Qubit检测获得；

C、采用二代测序技术进行高通量测序，需要对提取的宏基因组样本进行文库构建；

D、数据分析：测序得到的原始数据中，使用FastQC对下机数据进行质控，生成质检报告，根据质检报告结果对数据进行过滤，以去除接头序列的低质量数据，然后进行后续分析，通过快速比对准确估计物种的相对丰度，得到微生物群落组成信息，使用GraPhlAn基于分类等级绘制可视化进化树，构建物种群落结构图。

步骤C所述的文件库构建步骤如下：

(1)对微生物样本的基因组DNA进行处理，使其成为单链DNA；

(2)将步骤(1)中获得的单链DNA与特殊标签引物接头进行连接，获得一端连接有特殊标签引物接头的单链DNA；

(3)对步骤(2)中一端连接有特殊标签引物接头的单链DNA进行延伸，形成一端连接有特殊标签引物的双链DNA；

(4)对步骤(3)获得的双链DNA与双链接头进行连接，获得两端均连接有接头的双链DNA；

(5)对步骤(4)获得的两端均连接有接头的双链DNA进行扩增，获得微生物多样性文库。

步骤A所述微生物DNA提取的条件如下：称土样于离心管中，加提取液涡旋混匀后置于冰箱静止或液氮速冻，取出水浴融化，反复冻融，加蛋白酶K，摇床振荡，加SDS，水浴在室温离心，收集上清，沉淀加提取液和20％SDS，涡旋水浴然后在室温下离心，合并上清；上清中加聚己二醇800混匀，沉淀过夜；然后离心，弃上清，沉淀加入1×TE溶解；用等体积的氯仿：异戊醇抽提，离心后收集上清，重复一次；用NaAc和异丙醇室温沉淀，离心后弃上清；沉淀用70％乙醇洗涤，离心后弃上清，晾干，加超纯水溶解。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.采用本发明所述的分析方法，可以准确估计物种的相对丰度，对富硒土壤中微生物多样性的分析结果更全面和准确。

2.本发明所述的微生物多样性文库构建方法，利用单链连接及特殊标签引物接头对宏基因组进行微生物多样性文库构建，该方案适用于常规样品、微量样品、FFPE样品，扩大了微生物多样性研究的应用范围；单链连接及特殊标签的引入可将不同种群目的片段进行偏向性较小的富集，保证了物种丰富性以及样本不同物种丰度的真实性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

一种基于富硒土壤中微生物多样性指数分析方法，包括以下步骤：

A、称取富硒土壤样本，并进行微生物DNA提取；

B、对提取的宏基因组DNA进行质量检测，基因组DNA的纯度和完整性检测分别通过NanoDrop微量分光光度计和琼脂糖凝胶水平电泳完成，DNA质量浓度通过Qubit检测获得；

C、采用二代测序技术进行高通量测序，需要对提取的宏基因组样本进行文库构建；

D、数据分析：测序得到的原始数据中，使用FastQC对下机数据进行质控，生成质检报告，根据质检报告结果对数据进行过滤，以去除接头序列的低质量数据，然后进行后续分析，通过快速比对准确估计物种的相对丰度，得到微生物群落组成信息，使用GraPhlAn基于分类等级绘制可视化进化树，构建物种群落结构图。

步骤C所述的文件库构建步骤如下：

(1)对微生物样本的基因组DNA进行处理，使其成为单链DNA；

(2)将步骤(1)中获得的单链DNA与特殊标签引物接头进行连接，获得一端连接有特殊标签引物接头的单链DNA；

(3)对步骤(2)中一端连接有特殊标签引物接头的单链DNA进行延伸，形成一端连接有特殊标签引物的双链DNA；

(4)对步骤(3)获得的双链DNA与双链接头进行连接，获得两端均连接有接头的双链DNA；

(5)对步骤(4)获得的两端均连接有接头的双链DNA进行扩增，获得微生物多样性文库。

步骤A所述微生物DNA提取的条件如下：称土样于离心管中，加提取液涡旋混匀后置于冰箱静止或液氮速冻，取出水浴融化，反复冻融，加蛋白酶K，摇床振荡，加SDS，水浴在室温离心，收集上清，沉淀加提取液和20％SDS，涡旋水浴然后在室温下离心，合并上清；上清中加聚己二醇800混匀，沉淀过夜；然后离心，弃上清，沉淀加入1×TE溶解；用等体积的氯仿：异戊醇抽提，离心后收集上清，重复一次；用NaAc和异丙醇室温沉淀，离心后弃上清；沉淀用70％乙醇洗涤，离心后弃上清，晾干，加超纯水溶解。

取3组样品a1、a2、a3通过步骤A提取得到的结果如下表1所示；

表1 NanoDrop和Qubit检测基因组DNA结果

其中A

微生物多样性分析结果如下表2所示；

表2微生物多样性分析结果；

从表2的结果可知，MetaPhlAn2可以基于宏基因组数据，精确到微生物群体中种属的构成，包括细菌、古菌、真核生物和病毒等，MetaPhlAn2还可以准确估计物种的相对丰度，使分析结果全面而准确。

采用本发明所述的分析方法，对富硒土壤中微生物多样性的分析结果更准确；本发明所述的微生物多样性文库构建方法，利用单链连接及特殊标签引物接头对宏基因组进行微生物多样性文库构建，该方案适用于常规样品、微量样品、FFPE样品，扩大了微生物多样性研究的应用范围；单链连接及特殊标签的引入可将不同种群目的片段进行偏向性较小的富集，保证了物种丰富性以及样本不同物种丰度的真实性。