转基因水稻mfb-MH3301品系特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法

摘要

一种转基因水稻mfb‑MH3301品系特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法，特异性引物对为：MH3301‑3‑qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；MH3301‑3‑qR，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，特异性探针为：MH3301‑3‑P，其序列如序列表SEQ ID No.3。采用本发明的引物对与探针进行实时荧光定量PCR反应，可以鉴定样品中是否含有mbf‑MH3301品系，并能对其含量进行准确定量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因材料的定量检测引物，特别涉及一种转基因水稻mfb-MH3301品系特异性3’端实时荧光定量PCR检测引物及其检测方法。

背景技术

随着转基因作物在全球的种植面积不断扩大，转基因产品的安全性问题引起了世界各国普遍的关注。近年来，关于转基因产品的安全性事件报道不断，尽管有些报道缺乏事实依据，但却更加引起了公众的重视和担忧，而我国尚未建立转基因产品标识制度。

目前，转基因检测主要有两个大类：一种是在核酸水平上进行检测，另一种是在蛋白质水平上进行检测。在核酸水平上进行检测通常以DNA为模板采用PCR的基础方法进行检测。在应用PCR技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性方法是通过检测外源DNA与染色体连接区的序列来实现的。由于连接区序列的特异性，因而该方法准确性高，最适用于转基因产品检测。

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性好和可靠性强的特点，既可以避免定性PCR假阳性现象，又可以对样品中转基因含量进行定量，因而在转基因检测中具有广阔前景。迄今为止，缺乏转基因水稻mfb-MH3301品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供用于检测转基因水稻mbf-MH3301的品系特异性实时荧光定量PCR检测引物及探针；所述特异性检测正向引物为：MH3301-3-qF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述反向引物为：MH3301-3-qR，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示。

与其匹配的探针为：MH3301-3-P，探针序列如序列表SEQ ID No.3所示

本发明的目的之二是建立一种转基因水稻mbf-MH3301的品系特异性实时荧光定量PCR检测方法；

本发明的目的之三是建立一种转基因水稻mbf-MH3301的品系特异性实时荧光定量PCR定量方法；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

(1)提取待检测水稻样品的DNA；

(2)以提取的水稻样品的DNA为模板，同时设定水稻内标准基因实时荧光PCR反应体系和转基因水稻mfb-MH3301品系特异性实时荧光定量PCR反应体系；

(3)运行实时荧光定量PCR反应，若特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明样品中不含有转基因水稻mfb-MH3301品系；

(4)运行实时荧光PCR反应，若特异性实时荧光PCR反应体系没有扩增信号出现，则证明样品中不含有转基因mfb-MH3301水稻；

(5)若特异性实时荧光PCR反应体系扩增出目的荧光信号，则证明样品中含有转基因水稻mfb-MH3301，根据标准梯度样品读取的荧光PCR反应的Ct值和水稻内标准基因实时荧光PCR反应的Ct值，以Ct值为Y轴，基因组DNA拷贝数的对数为X轴，绘制标准曲线Ct＝k×Lg(Copies)+b，分别得到一条外源基因标准曲线方程和一条内标准基因标准曲线方程，再将待测样品的Ct值带入方程即得到了外源基因和内标准基因的拷贝数，然后按下述公式计算转基因含量:样品中转基因水稻mfb-MH3301的含量％＝外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数×100。

所述mfb-MH3301水稻品系特异性实时荧光PCR反应体系为：无菌水8μL，2×TaqMan反应缓冲液12.5μL，10μmol/L MH3301-3-qF 1μL，10μmol/L MH3301-3-qR 1μL，10μmol/LMH3301-3-P 0.5μL，DNA模板2.0μL。

所述实时荧光PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃，15s，60℃，60s，45个循环。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用实验的方法，对转基因水稻mfb-MH3301品系特异性3’端实时荧光定量PCR检测引物进行特异性筛选，并配合使用水稻常见的内参引物PLD，该引物不仅能够定性检测样品水稻中是否含有转基因水稻mfb-MH3301，还能定量检测其含量。

附图说明

图1是mfb-MH3301品系特异性筛选3’端实时荧光PCR扩增曲线。

图2是mfb-MH3301转化体3’端实时荧光PCR扩增曲线图。

图3是mfb-MH3301转化体3’端实时荧光PCR标准曲线图。

图4是PLD内标基因实时荧光PCR扩增曲线图。

图5是PLD内标基因实时荧光PCR标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实验采用如下所述的实验材料

1、植物材料

转基因水稻mfb-MH3301纯合体(100％)，非转基因水稻明恢86，特异性实验验证样品13种。

特异性实验验证样品设计如下：

(1)阳性对照样品：转基因水稻mfb-MH3301，含量为1％；

(2)阴性对照样品：明恢86；

(3)非转基因玉米：3种非转基因玉米等量混合制成1个样品；

(4)转基因玉米：Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、SH12-5、IE09S034，18个转化体混合制成1个样品，含量各1％；

(5)非转基因大豆：3种非转基因大豆等量混合制成1个样品；

(6)转基因大豆：GTS40-3-2、MON89788、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、FG72，12个转化体混合制成1个样品，含量各1％；

(7)非转基因水稻：TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1，7个转化体混合制成一个样品，含量各1％；

(8)其他转基因水稻：3种非转基因水稻等量混合制成1个样品；

(9)非转基因油菜：3种非转基因油菜等量混合制成1个样品；

(10)转基因油菜：MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302，9个转化体混合制成1个样品，含量各1％；

(11)非转基因棉花：3种非转基因棉花等量混合制成1个样品；

(12)转基因棉花：MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614，6个转化体混合制成1个样品，含量各1％；

(13)小麦混合样：3种非转基因小麦等量混合制成1个样品。

2、酶与试剂

Applied Biosystems的

3、实验仪器

分光光度计：Thermo ND-1000；

离心机：Thermo Bioguge Primo R，中佳科仪SC-3610；

实时荧光定量PCR仪：BioRad CFX96；

其他仪器包括水浴锅，精密天平，通风柜，生物安全柜等。

采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技有限公司)进行植物材料DNA提取和纯化，提取方法如下：

1)取200mg水稻粉末样品；

2)加入800μL 65℃预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。

4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。

5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。

6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积700μL，可分次加入离心)。

7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

9)重复步骤8。

10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60μL 0.1×TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在OD

根据mfb-MH3301转基因水稻3’端旁侧序列信息，在水稻染色体及外源插入片段部分设计引物及探针(表1)。建立mfb-MH3301转基因水稻实时荧光PCR检测方法，并对引物及探针进行特异性检测。

表1 mfb-MH3301水稻品系特异性实时荧光PCR检测引物及探针

设置mfb-MH3301转基因水稻品系特异性实时荧光PCR反应体系见表2。运行实时荧光PCR反应，反应程序如表3。样品为13种特异性实验验证样品。

表2实时荧光PCR反应体系

表3实时荧光PCR反应程序

标准曲线样品的制备：取50ng/μL的mfb-MH3301水稻纯合体DNA，10倍梯度稀释，每个浓度的DNA样品取2μL做模板，准备绘制标准曲线。反应体系中DNA模板量分别为100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，相应的拷贝数分别为2.13×10

待测样品的制备：取25ng/μL的mfb-MH3301水稻、明恢86水稻的DNA，配置成10％的待测样品，再梯度稀释至5％，1％，0.5％，0.1％，0.05％。利用上述标准曲线，对待测样品进行定值。

采用PLD作为内标准参照基因，PLD扩增方法引自欧盟标准化检测方法“Event-specific Method for the Quantitation of Rice Line LLRICE62Using Real-timePCR–Validation Report and Protocol-Sampling and DNA Extraction of Rice”。定量引物及探针见表4。

表4内标准基因PLD实时荧光PCR检测引物及探针

1、设定阈值

实时荧光PCR反应结束后，以PCR刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值。

2、记录Ct值

设定阈值后，实时荧光PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值，并记录。

3、绘制标准曲线

根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板拷贝数的对数间的线性关系，分别绘制mfb-MH3301转化体和PLD内标基因的标准曲线(如表5-6及图1-4所示)。

4、数据可接受的标准

mfb-MH3301转化体的阴性对照和空白对照，PLD内标基因的空白对照无典型扩增曲线，或Ct值≥40；标准曲线的R

5、计算待测样品中转基因水稻mfb-MH3301含量，计算公式为:

A和B分别为外源基因和内标准基因的拷贝数，从而得出测试样品的转基因含量，

实验结果如表7所示。

表5特异性实验数据统计

表6标准曲线数据统计

表7样品定量实验数据统计

从表5可以看出，本发明的引物及探针可以用于转基因水稻mfb-MH3301的筛选，特异性好，只能在含有mfb-MH3301的样品中获得检测，而在其他水稻样品或其他物种中没有扩增。

从表6、表7可以看出，本发明的引物及探针可以定量检测样品中转基因水稻mfb-MH3301的含量，准确率高，可以作为转基因水稻mfb-MH3301含量的参考测量方法。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 转基因水稻mfb-MH3301品系特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法

<141> 2020-10-07

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttgtgccgag ctgccg 16

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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