首页> 中国专利> 一种促进间充质干细胞定向成骨分化的方法

一种促进间充质干细胞定向成骨分化的方法

摘要

本发明涉及一种促进间充质干细胞定向成骨分化的方法,其解决了现有植入材料不能提供植入后体外动态调控表面电势以调节细胞功能及分化的技术问题,包括如下步骤:巨噬细胞扩增培养;间充质干细胞扩增培养;调控巨噬细胞极化及间充质干细胞向成骨分化:将巨噬细胞接种于具有磁电耦合效应的带电仿生植入膜材料表面,将间充质干细胞接种于共培养小室上;将接种了间充质干细胞的共培养小室移入放置了接种巨噬细胞的带电仿生膜材料培养板,建立间接共培养体系;改变外加磁场,引起磁电微环境改变,对巨噬细胞极化进行调控,从而促进间充质干细胞成骨分化。本发明可用于促进间充质干细胞定向成骨分化。

著录项

  • 公开/公告号CN112159791A

    专利类型发明专利

  • 公开/公告日2021-01-01

    原文格式PDF

  • 申请/专利权人 北京大学口腔医学院;

    申请/专利号CN202011131028.0

  • 发明设计人 邓旭亮;张冯依;刘雯雯;

    申请日2020-10-21

  • 分类号C12N5/077(20100101);C12N5/0775(20100101);C12N5/0786(20100101);C12N13/00(20060101);

  • 代理机构11293 北京怡丰知识产权代理有限公司;

  • 代理人于振强

  • 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街22号

  • 入库时间 2023-06-19 09:24:30

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进细胞分化的方法,具体地说是一种促进间充质干细胞定向成骨分化的方法。

背景技术

伴随近年来经济的发展,由于外伤肿瘤等因素造成的骨缺损病例随之升高。目前常采用植入的方式来进行骨缺损的修复。植入物可分为自体骨,异体骨及人工合成材料。其中自体骨移植常存在供区骨量不足,术区二次感染等问题。异体骨的供体较少,且存在免疫排斥等风险。为了解决以上问题,采用人工合成材料代替骨组织进行植入修复,是目前组织工程的研究热点。研究人员发现,人体内存在天然的电磁微环境,且在组织的生长再生中发挥重要作用。为了模拟体内的电磁环境,采用电磁刺激进行骨组织缺损修复的方式得到广泛关注。目前常见的方式有外加电磁场或体内植入带电或带磁性的生物材料。但这些常用方式仍存在刺激区域无法精确定位,材料植入后电势衰减,无法实现材料植入后体外调控等缺陷。

骨组织再生是一个有巨噬细胞,间充质干细胞等多种细胞参与的复杂生理过程。巨噬细胞作为第一种到达缺损区域的细胞,在早期成骨过程中扮演者不可或缺的角色。巨噬细胞可分为促炎型(M1)和抗炎型(M2),其中M2型巨噬细胞具有可分泌多种细胞因子,促进骨组织重建。因此,诱导巨噬细胞向M2型分化,可加速骨组织再生的进程。间充质干细胞具有多向分化潜能,是组织工程中常用的种子细胞。采用适当的电磁刺激调控巨噬细胞向M2型极化,分泌成骨相关细胞因子,从而诱导间充质干细胞成骨向分化,在骨组织再生的应用中有较大的应用前景。

专利申请号201811235132.7的中国发明专利申请公开了一种通过磁电耦合调控的带电仿生植入膜材料及其制备方法,其是由铁电高分子聚合物、磁性颗粒填料及有机溶剂制得的薄膜状材料,其解决了现有带电生物材料长期植入后电势衰减、远期修复效果不稳定的技术问题,但是其植入材料不能提供植入后体外动态调控表面电势以调节细胞功能及分化。

发明内容

本发明针对在现有植入材料不能提供植入后体外动态调控表面电势以调节细胞功能及分化的技术问题,提供一种植入后可调控的电磁材料,从而诱导巨噬细胞M2极化并促进间充质细胞定向成骨分化的方法。

为此,本发明提供一种促进间充质干细胞定向成骨分化的方法,其包括如下步骤:(1)巨噬细胞扩增培养;(2)间充质干细胞扩增培养;(3)调控巨噬细胞极化及间充质干细胞向成骨分化:将巨噬细胞接种于具有磁电耦合效应的带电仿生植入膜材料表面,将间充质干细胞接种于共培养小室上;(4)将接种了间充质干细胞的共培养小室移入放置了接种巨噬细胞的带电仿生膜材料培养板,建立间接共培养体系;(5)改变外加磁场,引起磁电微环境改变,对巨噬细胞极化进行调控,从而促进间充质干细胞成骨分化。

优选的,所述步骤(1)中,所述巨噬细胞为巨噬细胞Raw 264.7。

优选的,所述步骤(1)中,所述巨噬细胞Raw 264.7扩增培养采用无诱导因子的高糖DMEM培养基,于T25培养瓶中贴壁培养,细胞复苏后培养,通过加入培养基进行采用吹打的方式进行传代。

优选的,所述步骤(2)中,所述间充质干细胞扩增培养:采用无诱导因子的α-MEM培养基,MSCs细胞复苏后培养,2-3天采用质量体积比为0.25%的胰酶消化的方式进行传代。

优选的,所述步骤(4)中,取8-15代巨噬细胞接种于带电仿生膜材料上,取3-5代间充质干细胞接种于共培养(transwell)小室中,构建间接共培养体系,采用无诱导因子的培养基,置于37℃,湿度95%,体积分数为5%的CO

优选的,所述步骤(5)中,通过每12小时改变外加磁场引起细胞所处磁电微环境改变。

本发明具有以下有益效果:

本发明通过外加磁场动态调控CoFe

附图说明

图1是实施例1所述植入体内CoFe

图2是实施例1所述植入体内CoFe

图3A是实施例1所述植入体内CoFe

图3B是实施例1所述对照组中巨噬细胞M2型分化表面标志物流式检测结果图。

图4A是实施例1所述植入体内CoFe

图4B实施例1所述对照组中巨噬细胞M2型分化表面标志物免疫荧光检测结果图。

图5A是实施例1所述植入体内CoFe

图5B实施例1所述对照组中间充质干细胞成骨分化标志物免疫荧光检测结果图。

图6A是实施例1所述植入体内CoFe

图6B实施例1所述对照组中间充质干细胞钙结节茜素红染色结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

惟以上所述者,仅为本发明的具体实施例而已,当不能以此限定本发明实施的范围,故其等同组件的置换,或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改,皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。

本发明所使用的可实现动态调控磁电微环境的带电仿生膜为CoFe

经试验证明,上述材料在CoFe

本发明细胞接种并置于共培养体系中后,接受每12小时变换一次的动态电磁微环境刺激。在培养24小时后,通过流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面标记物CD206,在提供动态磁电微环境的组阳性率为56%,对照组(无材料,无外加磁场)阳性率为17.8%(流式实验对照组为图3B);通过免疫荧光染色检测M2型巨噬细胞表面标记物CD206,在提供动态磁电微环境的组荧光强度显著高于对照组(CD206免疫荧光实验对照组为图4B);培养7天后通过免疫荧光检测成骨分化相关蛋白RUNX2的表达情况,提供动态磁电微环境的间充质干细胞荧光强度显著高于对照组(RUNX2免疫荧光实验对照组为5B);培养21天后,进行茜素红染色,在提供动态磁电微环境的组中观察到成熟钙结节,对照组则没有(茜素红实验对照组为图6B)。

实施例1

(1)小鼠巨噬细胞系(巨噬细胞Raw264.7)扩增培养:采用无诱导因子的高糖DMEM培养基,Raw264.7细胞复苏后于T25培养瓶中贴壁培养,每1-2天PBS冲洗并更换新培养基(高糖DMEM培养基)后,轻轻吹打贴壁细胞进行传代。

(2)间充质干细胞扩增培养:采用无诱导因子的α-MEM培养基,间充质干细胞(MSCs)复苏后于T25培养瓶中贴壁培养,每2-3天采用0.25%胰酶消化方式进行传代。

(3)诱导巨噬细胞M2型极化及间充质干细胞定向成骨分化:取8-15代巨噬细胞Raw264.7接种于带电仿生膜材料上,取3-5代MSCs接种于共培养(transwell)小室(美国密理博(Millipore)公司生产)中,构建间接共培养体系,采用无诱导因子的培养基,置于37℃,湿度95%,体积分数为5%的CO

(4)检测巨噬细胞M2型极化情况:继续培养24小时后,通过流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面标志物CD206,免疫荧光观察细胞形态及巨噬细胞表面标志物CD206。检测MSCs成骨分化情况:继续培养7天后,通过免疫荧光检测MSCs成骨分化相关蛋白RUNX2的表达情况。培养21天后,进行茜素红染色,观察钙结节形成。

(5)通过以上步骤所得到的巨噬细胞中,M2型巨噬细胞表面标志物CD206阳性率为56%,对照组(无材料,无外加磁场)中M2型巨噬细胞表面标志物CD206阳性率仅为17.8%;

通过以上步骤所得到的巨噬细胞中,使用动态电磁微环境刺激的实验组M2型巨噬细胞表面标记物CD206荧光强度较强,而对照组的CD206荧光强度明显弱于实验组;

通过以上步骤所得到的MSCs中,使用动态电磁微环境刺激的实验组MSCs成骨相关蛋白RUNX2荧光强度显著较强,而对照组的RUNX2荧光强度明显弱于实验组;

通过以上步骤所得到的MSCs,进行茜素红染色,使用动态电磁微环境刺激的实验组中与对扎组相比,在使用动态电磁微环境刺激的实验组中可观察到成熟钙结节形成,对照组则没有成熟的钙结节形成。

去获取专利,查看全文>

相似文献

  • 专利
  • 中文文献
  • 外文文献
获取专利

客服邮箱:kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备:11010802029741号 ICP备案号:京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有
  • 客服微信

  • 服务号