一种利用贝莱斯芽孢杆菌发酵可腐废弃物制备生防菌肥的方法

摘要

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌在发酵可腐废弃物制备生防菌肥中的应用及制备方法，属于生防菌肥制备技术领域。所述贝莱斯芽孢杆菌的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT‑2(Bacillus velezensis LT‑2)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为CCTCC No:M2019904，保藏日期为2019年11月07日。本发明主要包括如下工艺过程：固态曲种制备、堆肥发酵种子液的制备和固态发酵制备生防菌肥。本发明以有机可腐废弃物为原料制备高效农用生防菌肥，加快了生物制品替代化学农药的进程，解决长期依赖化学农药带来的作物“食品安全”问题，对推动我国现代农业的可持续发展具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明具体涉及贝莱斯芽孢杆菌在发酵可腐废弃物制备生防菌肥中的应用，属于生防菌肥技术领域。

背景技术

由于化肥与农药的长期泛滥使用严重污染了耕地，如耕层变薄、土壤板结酸化、有机质含量不足、养分失衡、农药污染、土壤生态功能变差等，严重破坏土壤生态系统，直接威胁到人体健康。据报道，有机肥施用可以为作物提供稳定充足持续的养分供给，从而促进作物生长，增加产量，市场前景良好。因此，选用天然无害、对环境友好的微生物有机生防菌肥来代替农药和化肥防治农林业的虫害和病害、促进作物健康生长、提高农作物的产量，成为了当下的研究热点。

我国可腐废弃物总量充足(主要包括作物秸秆及蔬菜、瓜果等加工后的残渣以及动物皮毛、内脏、粪便等)，这些可腐废弃物中的有机质富含纤维素、半纤维素、糖类、蛋白质、油脂以及氮、磷、钾等元素，是制备有机菌肥首选的廉价、优质环保、绿色健康的原料。

贝莱斯芽孢杆菌Bacillus valescens是习居于土壤的微生物，近来年国内外均报道了贝莱斯芽孢杆菌作为新型生防细菌在生物防治(植物生长、抗病虫和诱导系统抗病性)和作物产量增产上起着重要作用。因此，B.velezensis在植物病害生物防治上作为新型微生物资源具较大研究前景。贝莱斯芽孢杆菌作为生防用菌已广泛应用于农业生产，不仅可促进植物生长，同时通过分泌次级代谢产物抑制动物病原菌和植物病原菌感染，被认为是代替化学肥料和杀虫剂的一种安全环保的策略。

经检索，目前未见有使用贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis以有机废弃物为原料发酵制备生防菌肥的报道。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的问题是：提供一株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT-2，及其以有机废弃物为原料发酵制备生防菌肥的方法。

技术方案：为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

本发明从酒曲中筛选得到一株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌LT-2(Bacillus velezensis LT-2)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019904，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编：430072，保藏编号为CCTCC No：M2019904，保藏日期为2019年11月7日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。

贝莱斯芽孢杆菌LT-2(Bacillus velezensis LT-2)具有下述性质：

1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。

表1菌落形态学特征与生理生化特性

2、16S rDNA序列分析：

测得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如SEQID No.1：所示。将所测序列从Gene Bank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建 16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis zjt9达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌，具体为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。

上述贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2以有机废弃物为原料发酵制备生防菌肥也在本发明的保护范围之内。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2以有机废弃物为原料发酵制备生防菌肥的方法，依次包括以下步骤：

(1)固态曲种的制备：

(1a)菌种选择：

选用已保藏菌株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。

(1b)菌种活化：

将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养 16～20h，再次挑取单菌落划线到斜面培养基上，24～36℃培养16～20h，得到活化菌种备用；

其中所述斜面容器为茄子瓶；所述的斜面培养基为LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；

(1c)固态曲种种子液制备：

取步骤(1b)中活化好的菌种，无菌条件下接种于装有固态曲种种子液的发酵罐中， 150～220rpm，24～36℃，培养18～36h，得到固态曲种种子液；

其中所述的固态曲种种子液培养基为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁1g/L；所述发酵罐为机械搅拌式1000L在线灭菌发酵系统，装液量为60～75％。

(1d)发酵制备固态曲种：

取步骤(1c)中的固态曲种种子液，接种于装有曲种培养基的转鼓式固体生物反应器中，24～36℃，培养24～48h后，将含有贝莱斯芽孢杆菌的曲种培养基用挤压机压制成曲坯，自然风干，得到固态曲种；

其中所述的曲种培养基为：糖蜜10～20份，豆粕粉35～65份，稻谷壳5～10份，水45～55份，硫酸锰0.5～1.2g/kg，pH值7.0～8.0；其中所述转鼓式固体生物反应器1批次可发酵3000kg有机废弃物。

最优选的曲种培养基包含如下组分：糖蜜10份，豆粕粉40份，稻谷壳5份，水 45份，pH值7.0～8.0。此外，每公斤曲种培养基中添加硫酸锰0.5～1.2g。

(2)种子液的制备：

(2a)固态曲种的粉碎：

将步骤(1d)的固态曲种用粉碎机粉粹，并控制固态曲种颗粒的粒径在0.3cm以下；

(2b)制备发酵种子液：

将(2a)获得的固态曲种颗粒(2～5％,w/w)接入种子培养基中，控温70～80℃一小时后，降温至24～36℃，开放式机械搅拌培养24～48h，即可获得发酵种子液；

其中所述控温70～80℃一小时的作用是使杂菌在高温状态下死亡，简称为“除杂菌”。

其中所述种子培养基为：餐厨废弃物50～70份，豆粕粉20～40份，纤维素钠2～10份，硫酸锰0.5～1.2g/kg，水15～30份，pH值7.0～8.0。最佳配方为：餐厨废弃物50份，豆粕粉20份，纤维素钠5份，水25份，硫酸锰0.5～1.2g/kg,，pH值7.0～8.0。

(3)固态发酵制备生防菌肥：

(3a)将有机可腐废弃物烘/晒至水分为15～25％时，用粉碎机进行粉粹，并控制有机可腐废弃物的粒径在0.3cm以下；

其中所述最佳水分为17％。

(3b)将(3a)中的有机可腐废弃物颗粒和(2b)中的发酵种子液以及其他辅料按照一定配比混合，控制水分55～65％，进行“条垛式”堆肥发酵制备生防菌肥。当发酵温度大于65℃用翻堆机进行翻堆降温。

其中所述最佳配比为7：2.4：0.6；

其中所述最佳翻堆条件为：垛堆内部温度稳定后开始进行翻堆，翻堆以行走式翻堆机进行，一次翻堆操作的完成以翻堆后测得的内部温度较翻堆前下降超过20℃为准。

(3c)生防菌肥坯的制备

将(3b)中所得发酵产物用挤压机压制成坯，自然风干，得到生防菌肥坯。

制坯的最佳时机为发酵温度低于45℃，即堆肥发酵进入后酵期后进行。

有益效果：本发明具有如下优势：

(1)本发明首次筛选得到一株具有生防作用的菌株贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisLT-2。

(2)本发明以自制固态贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2曲种的方式代替市售“菌剂”，并将生防菌肥应用于作物培养与种植，大大降低农业作物的生产成本，实现“变废为宝”，具有十分重要的社会意义。

(3)本发明以餐厨废弃物作为种子培养基的主要成分，以可腐废弃物为生防菌肥发酵基质，可以促进可腐废弃物的循环利用，经济和社会效益显著。

(4)本发明以“菌肥坯+自然风干”的模式代替“堆肥后发酵+机械烘干”的模式，缩短了生产周期，降低了生产成本。

(5)该菌株能够以有机废弃物为原料发酵制备生防菌肥，不仅具有较高的肥力，还具有较好的生物防治效果，对弥补现有有机肥的生产缺陷与不足，建立农业作物病害绿色防治技术，推动我国现代农业的可持续发展具有重要的意义。

(6)贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2在制备生防菌肥制过程中合成微生物多糖，微生物多糖作为新型生物刺激素可以促进植物生长。

本发明报道的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2以有机废弃物为原料发酵制备生防菌肥的新方法，不仅解决了可腐废弃物的无害化处理和资源化利用的问题，也成功制备了病原菌拮抗的有机生防菌肥，对弥补现有有机肥的生产缺陷与不足，建立农业作物病害绿色防治技术，修复我国土壤生态系统，实现我国耕地自我保护，推动我国现代农业的可持续发展具有重要的意义。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌LT-2的16S rDNA PCR纯化琼脂糖凝胶电泳图(A)和贝莱斯芽孢杆菌LT-2的系统发育树(B)。

图2锰离子对贝莱斯芽孢杆菌LT-2产芽孢的影响

图3稻壳添加量对制备生防菌肥的影响

图4基质湿度对制备生防菌肥的影响

具体实施方式：

根据下列实施例可以更好的理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的分离与鉴定。

前期在酒曲中发现一株生长快速且具有较高纤维素酶活力的菌株，为鉴定该菌株，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2的基因组DNA，以上游引物27F和下游引物1492R PCR扩增16S rDNA序列如图1A所示，将PCR扩增后产物进行胶回收纯化，将胶回收纯化产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1396bp，其基因序列如SEQID No.1所示。将测序结果与GeneBank数据库中已知16S rDNA序列进行BLAST比对，并使用BLAST程序进行同源性比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果显示：该菌株与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis zjt9达到100％同源性(图1B)。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是贝莱斯芽孢杆菌，具体命名为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2。

实施例2：固态曲种培养基和种子液培养基中锰离子浓度的优化

据报道Mn

实施例3：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵制备生防菌肥辅料稻壳含量的优化

芽孢杆菌发酵属于好氧发酵，在发酵过程中需要大量的氧，文献报道添加稻壳可以加大固态基质之间的空隙，使空气进入确保发酵的进行。本实施例说明不同稻壳添加量对菌株发酵制备生防菌肥的影响，将种子培养液以25％(v/w)的接种量分别接种于稻壳添加量为2％、4％、6％、8％、10％、12％(w/w)的生防菌肥制备发酵体系中进行固态发酵，发现稻壳添加量为6％时，固态发酵升温速度最快，所需发酵时间虽短。因此，选用6％的稻壳添加量为最佳添加量。(机制失重率的测定方法：将发酵后的基质用蒸馏水浸提后过滤，反复3次，将水不溶基质烘干，烘干后基质的重量，发酵前基质的质量为 m

实施例3：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵制备生防菌肥基质湿度的优化

文献报道基质湿度是固态发酵成败的关键因素之一。本实施例说明不同基质湿度对菌株发酵制备生防菌肥的影响，将种子培养液以25％(v/w)的接种量分别接种于湿度为50％、55％、60％、65％、70％、75％(w/w)的基质中进行固态发酵，发现基质湿度为60％时，固态发酵升温速度最快，所需发酵时间虽短。因此，选用60％为最佳固态发酵基质湿度。(机制失重率的测定方法：将发酵后的基质用蒸馏水浸提后过滤，反复3次，将水不溶基质烘干，烘干后基质的重量，发酵前基质的质量为m

实施例4：贝莱斯芽孢杆菌LT-2发酵制备生防菌肥

将贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis LT-2菌种接种于LB斜面培养基上，32℃静置培养 14h，再次挑取单菌落划线到LB斜面培养基上，32℃静置培养14h，得到活化菌种。然后将活化好的菌种，在无菌条件下接种于装有固态曲种种子液的发酵罐(1000L)中， 200rpm，36℃，培养24h，得到固态曲种种子液。再将固态曲种种子液，接种于装有曲种培养基的转鼓式固体生物反应器中，32℃，培养48h后用挤压机压制成曲坯。随后将曲坯用粉碎机粉粹至颗粒的粒径在0.3cm以下，并将其接种于含有种子培养基(餐厨废弃物50份，豆粕粉20份，纤维素钠5份，水25份，硫酸锰1.0g/kg，pH值7.0～8.0。) 的敞开式机械搅拌发酵罐中，升温至70～80℃杀灭杂菌，1小时后降温至32～36℃， 24h，获得发酵种子液。再发酵种子液(1250kgkg)与粉粹好的有机可腐废弃物(3500kg) 和稻壳按照和稻壳(250kg)按照2.5：7：0.5的比例混合，用水控制发酵基质水分含量 55％，进行“条垛式”堆肥发酵制备生防菌肥，当发酵温度大于65℃用翻堆机进行翻堆降温，使温度下降25℃。当自然发酵温度低于45℃时将固态发酵基质用挤压机压制成坯，自然风干得到生防菌肥坯(3.6吨)。此外，通过乙醇沉淀法测得生防菌肥坯中含有3％(干基)的贝莱斯芽孢杆菌LT-2胞外多糖(胞外多糖含量测定方法：生防菌肥坯用蒸馏水浸提后过滤，滤液经浓缩后用乙醇沉淀，沉淀烘干即为胞外多糖)。

实施例5：生防菌肥的对玉米的促生(肥力)效果

本实施例说明生防菌肥促进玉米幼苗生长的效果。

玉米培养试验在植物组织培养室进行。对照组所用种植基质为：90％的土壤和10％未堆肥发酵基质的混合物。T1所用种植基质为：土壤和从生防菌肥中溶出的贝莱斯芽孢杆菌LT-2菌体的混合物；T2所用种植基质为：99.5％土壤和0.5％贝莱斯芽孢杆菌LT-2胞外多糖的混合物。T3所用种植基质为：90％的土壤和10％经堆肥发酵的基质(即生防菌肥)的混合物。上述每组再分为4组，分别进行发芽率(96h)、茎高(2周)、叶长、叶宽(3周)、茎叶鲜重(2周)的实验，每组3个重复。结果如表2所示。与对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌LT-2可使玉米的发芽率、茎高、叶长、叶宽和鲜重分别提高9.61％、6.38％、 12.45％、27.00％和36.84％，说明贝莱斯芽孢杆菌LT-2具有促进玉米生长的能力。此外，发现贝莱斯芽孢杆菌LT-2胞外多糖可以使玉米的发芽率、茎高、叶长、叶宽和鲜重分别提高7.68％、12.07％、19.90％、13.00％和29.82％，但其促进玉米生长的效果亚于贝莱斯芽孢杆菌LT-2。另外，由于菌体与胞外多糖协同作用，使得生防菌肥(含贝莱斯芽孢杆菌LT-2及其胞外多糖)对玉米的生长具有最好的促进效果(发芽率提高11.57％、茎高提高33.97％、叶长提高22.25％、叶片宽度提高37.00％、鲜重提高33.33％)。因此，生防菌肥(含贝莱斯芽孢杆菌LT-2及其胞外多糖)是理想的生物肥料或植物促生剂。

表2生防菌肥对玉米的促生效果

实施例6：生防菌肥的对小麦的促生(肥力)效果

本实施例说明生防菌肥促进玉米幼苗生长的效果。

小麦培养实验在植物组织培养室进行。对照组所用种植基质为：90％的土壤和10％未堆肥发酵基质的混合物。T1所用种植基质为：土壤和从生防菌肥中溶出的贝莱斯芽孢杆菌LT-2菌体的混合物；T2所用种植基质为：99.5％土壤和0.5％贝莱斯芽孢杆菌LT-2胞外多糖的混合物。T3所用种植基质为：90％的土壤和10％经堆肥发酵的基质(即生防菌肥)的混合物。上述每组再分为4组，分别进行发芽率(48h)、麦粒数和千粒重的实验，每组3个重复。结果如表2所示。与对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌LT-2可使小麦的发芽率、麦粒数和千粒重分别提高14.54％、24.10％、和19.11％，说明贝莱斯芽孢杆菌LT-2 具有促进小麦生长的能力。此外，发现贝莱斯芽孢杆菌LT-2胞外多糖可使小麦的发芽率、麦粒数和千粒重分别提高8.54％、21.66％和4.74％，但其促进小麦生长的效果亚于贝莱斯芽孢杆菌LT-2。另外，由于菌体与胞外多糖协同作用，使得生防菌肥(含贝莱斯芽孢杆菌LT-2及其胞外多糖)对小麦的生长具有相对最好的促进效果(发芽率提高 16.37％、麦粒数提高44.54％，千粒重提高25.25％)。因此，生防菌肥(含贝莱斯芽孢杆菌LT-2及其胞外多糖)是理想的生物肥料、植物促生剂或植物增产剂。

表2生防菌肥对小麦的促生效果

实施例7：生防菌肥的对水稻的促生(肥力)效果

本实施例说明生防菌肥促进水稻幼苗生长的效果。

水稻培养试验在植物组织培养室进行。对照组所用种植基质为：90％的土壤和10％未堆肥发酵基质的混合物。T1所用种植基质为：土壤和从生防菌肥中溶出的贝莱斯芽孢杆菌LT-2菌体的混合物；T2所用种植基质为：99.5％土壤和0.5％贝莱斯芽孢杆菌LT-2胞外多糖的混合物。T3所用种植基质为：90％的土壤和10％经堆肥发酵的基质(即生防菌肥)的混合物。上述每组再分为4组，分别进行发芽率(10天)、茎高(35天)、叶长、叶宽(35天)、茎叶鲜重(35天)的实验，每组3个重复。结果如表2所示。与对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌LT-2可使水稻的发芽率、茎高、叶长、叶宽和鲜重分别提高6.12％、 5.67％、3.19％、4.88％和6.56％，说明贝莱斯芽孢杆菌LT-2具有促进水稻生长的能力。此外，发现贝莱斯芽孢杆菌LT-2胞外多糖可以使水稻的发芽率、茎高、叶长、叶宽和鲜重分别提高12.24％、5.35％、3.93％、9.76％和4.92％，但其促进水稻生长的效果亚于贝莱斯芽孢杆菌LT-2。另外，由于菌体与胞外多糖协同作用，使得生防菌肥(含贝莱斯芽孢杆菌LT-2及其胞外多糖)对水稻的生长具有最好的促进效果(发芽率提高16.32％、茎高提高9.72％、叶长提高9.83％、叶片宽度提高12.20％、鲜重提高8.20％。因此，生防菌肥(含贝莱斯芽孢杆菌LT-2及其胞外多糖)是理想的生物肥料或植物促生剂。

表2生防菌肥对水稻的促生效果

实施例8：生防菌肥对禾谷镰刀菌的生防效果

本实施例说明生防菌肥对禾谷镰刀菌的生防效果。

所有实验用种植基质均为土壤，试验一共分为6组，每组15组平行。所有植株生长至株高为25cm以上后，在所有实验组基质中接入液态禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，T1、T2和T3组中分别加入基质总质量3％、6％和9％的生防菌肥；对照组1、对照组2和对照组3中分别加入基质总质量3％、6％和9％的灭菌后的生防菌肥，继续培养3周后统计水稻得病率。结果如表3所示。所有对照组的防治效果较低，维持在13.33％以下；与对照组相比，在使用生防菌肥之后试验组都表现出对水稻赤霉病有良好的防治效果，且随着接入量的增加，生防效果越明显。因此，本发明所制生防菌肥具有良好的市场应用前景。

表3生防菌肥的生防效果

实施例9：生防菌肥对黑斑病病原菌Alternaria alternanta的生防效果

本实施例说明生防菌肥对禾谷镰刀菌的生防效果。

所有实验用种植基质均为土壤，试验一共分为6组，每组15组平行。所有草莓植株生长至株高为25cm以上后，在所有实验组基质中接入液态互隔交链孢霉(Alternariaalternanta，T1、T2和T3组中分别加入基质总质量3％、6％和9％的生防菌肥；对照组 1、对照组2和对照组3中分别加入基质总质量3％、6％和9％的灭菌后的生防菌肥，继续培养3周后统计草莓得病率。结果如表3所示。所有对照组的防治效果较低，维持在 10％以下；与对照组相比，在使用生防菌肥之后试验组都表现出对草莓黑斑病有良好的防治效果，且随着接入量的增加，生防效果越明显。因此，本发明所制生防菌肥具有良好的市场应用前景。

表4生防菌肥的生防效果

最后，还需注意的是，以上列举仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 常熟理工学院

<120> 一种利用贝莱斯芽孢杆菌发酵可腐废弃物制备生防菌肥的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 60

gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatgcttgt 120

ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc 180

ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 240

agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300

tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 360

ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca 420

ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 480

gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa 540

gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag 600

tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 660

caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 720

agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 780

ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 840

tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag 960

ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1020

cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt 1080

cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatgggcag aacaaagggc 1200

agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg 1260

caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1320

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cggtgaggta accttt 1396