用于生长NK92细胞的基础培养基

摘要

本文提供了用于培养细胞的方法和定制的培养基组合物。

说明书

背景技术

天然杀伤细胞(NK)是细胞毒性淋巴细胞，其构成先天免疫系统的主要组成部分。通常代表约10-15％的循环淋巴细胞的NK细胞结合并杀死包括被病毒感染的细胞和许多恶性细胞在内的靶细胞，对抗原而言非特异性地且无需预先免疫致敏。Herberman等，Science214:24(1981)。通过诱导细胞裂解来杀死靶细胞。用于该目的NK细胞从受试者的血液的外周血淋巴细胞(“PBL”)级分中分离出，在细胞培养中扩增以获得足够数量的细胞，然后将其重新注入受试者中。NK细胞在体外疗法和体内疗法中都显示出了一定的疗效。然而，由于并非所有的NK细胞都具有细胞溶解作用，并且这样的疗法对所治疗的患者具有特异性，因此这样的疗法变得复杂。

发明内容

本文提供了用于培养

本文提供了一种培养

本文还提供了一种培养

任选地，乙醇胺衍生物为乙醇酰胺。乙醇酰胺可为异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺，软脂酸乙醇酰胺或硬脂酸乙醇酰胺。任选地，乙醇胺衍生物为磷脂酰乙醇胺。

任选地，一种或多种补充剂包含1-7％的人AB血清。任选地，一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。

任选地，一种或多种补充剂进一步包含300-600IU/mL白细胞介素-2。任选地，一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。

任选地，在所述定制的

任选地，在所述定制的

任选地，在所述定制的

任选地，在所述定制的

任选地，所述

任选地，所述定制的

任选地，所述定制的

任选地，所述定制的

本文还提供了一种细胞培养物，其包含在定制的

本文还提供了一种细胞培养物，其包含在定制的

任选地，所述乙醇胺衍生物为乙醇酰胺，其中所述乙醇酰胺为顺式异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺。

任选地，所述一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。任选地，所述一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。任选地，所述定制的

任选地，所述

任选地，所述基础培养基包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。

任选地，所述

任选地，已在所述定制的

任选地，所述

上文的概述和下文的详述是示例性和说明性的，并且旨在提供对本发明公开内容的进一步说明。本发明的其他的目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图说明

通过结合附图并参考以下公开内容将更容易地理解本发明的目的、特征和优点。

图1是显示在生长周期5时

具体实施方式

本文提供了用于培养

在阅读了该描述之后，对于本领域技术人员而言，如何实现多种替代实施方式和替代应用将变得显而易见。然而，本文未描述所有实施方式。将被理解的是，在此呈现的实施方式仅是示例性的，而非限制性的。因此，对多种替代实施方式的详细描述不应被理解为对本文公开内容的范围或广度的限制。将被理解的是，以下描述的方面不限于特定的组合物，制备这样的组合物的方法或其用途，因为这些当然是可变的。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的意思相同的含义。

在本说明书和随后的权利要求书中，将引用许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：

本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于进行任何限制。除非上下文另外明确指出，本文所使用的单数形式“一个/一种(a/an)”，“所述”也意图包括复数形式。因此，例如，对“天然杀伤细胞”的引用包括多个天然杀伤细胞。

所有数字标识，例如pH值、温度、时间、浓度、含量和分子量，包括范围，均为近似值，在适当情况下以0.1或1.0为增量进行(+)或(-)的变化。将被理解的是，尽管并没有总是被明确指出，但是所有数字标识之前都可以有术语“约”。

除非另有说明，否则百分比在表示浓度时是指w/v百分比。例如，1.0％HA是指1.0％w/v HA。

除非另有说明，否则本公开中的浓度是指所述定制的

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地识别为充分描述，并且可以将相同范围分解为至少相等的一半，三分之一，四分之一，五分之一，十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等，均包括所列举的数字，并且指代可随后被细分为上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，所述范围包括每个单独的成分。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，依此类推。

还将被理解的是，尽管并没有总是被明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。

“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情况能或不能发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及所述事件或情况没有发生的实例。

术语“包含/包括”旨在表示所述组合物和方法包含所列举的要素，但不排除其他要素。当被用于定义组合物和方法时，“基本由……组成”应表示排除对该组合具有任何实质意义的其他要素。例如，基本由本文所定义的元素组成的组合物将不排除不会实质上影响权利要求的基本和新颖特征的其他元素。“由……组成”是指排除超过痕量的其他成分和实质性的方法步骤。由这些过渡(transition)术词中的每一个所定义的实施方式在本公开内容的范围内。

本文所用的“自然杀伤(NK)细胞”是免疫系统的细胞，其在没有特异性抗原刺激且不受任何主要组织相容性复合物(MHC)类别限制的情况下杀死靶细胞。靶细胞可为癌细胞或肿瘤细胞。NK细胞的特征在于CD56的存在和CD3表面标志物的缺失。

为了本发明的目的，除非另有说明，术语

如本文所用，术语“aNK

如本文所用，术语“

如本文所用，术语“

如本文所用，术语“

术语“Fc受体”是指在某些细胞(例如自然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质，其通过结合至被称为Fc区的抗体的一部分而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)来刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。根据FcR识别的抗体类型对FcR进行分类。例如，Fc-γ受体(FcγR)与IgG类抗体结合。FcγRIII-A(也被称为CD16)是与IgG抗体结合并激活ADCC的低亲和力Fc受体。FcγRIII-A通常在NK细胞上被发现。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。CAR可以在T细胞或NK细胞中表达，以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对在感兴趣的细胞上发现的抗原具有特异性的scFv。基于scFv结构域的特异性，将表达CAR的

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可以包含被修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后修饰核苷酸结构。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可在聚合后被进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子两者。除非另有说明或要求，否则多核苷酸既包括双链形式和已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个两者。

术语“表达”是指基因产物的产生。术语“瞬时”当指向表达时，其意为未将多核苷酸引入所述细胞的基因组中。

术语“细胞因子(cytokine/cytokines)”是指影响免疫系统细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白细胞介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在优选的实施方式中，细胞因子为IL-2。

如本文所用，术语“载体”是指包含完整的复制子的非染色体核酸，所述完整的复制子使得所述载体在被置于允许性(permissive)细胞内时可被复制(例如通过转化过程)。载体可以在一种细胞类型(例如细菌)中复制，但是在另一种细胞(例如哺乳动物细胞)中复制的能力有限。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；DNA与单独的阳离子脂质或阳离子脂质与阳离子聚合物的组合复合；阴离子和阳离子脂质体；DNA-蛋白质复合物和颗粒，其包含与阳离子聚合物(如异质聚赖氨酸、定长寡肽和聚乙烯亚胺)缩合的DNA，在某些情况下被包含在脂质体中；以及包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物的用途。

如本文所用，术语“基本上相同”与术语“可比较的”或“相似的”互换使用，在描述细胞毒性、存活率或细胞恢复时是指对细胞毒性、存活率或细胞倍增时间的两次测量彼此之间的差异不超过25％，不超过20％，不超过15％，不超过10％，不超过8％或不超过5％。

如本文所用，术语“细胞毒性”在被用于描述效应细胞(例如NK细胞)的活性时，涉及通过多种生物、生化或生物物理机制中的任一种杀死靶细胞。

为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，其不旨在影响本公开内容的范围。另外，下文更具体地定义了本说明书中使用的一些术语。

本公开提供了为生长

可在所述基础培养基中使用的示例性维生素可为一种或多种选自以下的维生素：生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、硫胺素盐酸盐、维生素B12和i-肌醇。

可在所述基础培养基中使用的示例性无机盐可为一种或多种选自以下的无机盐：CaCl

可在所述基础培养基中使用的示例性氨基酸可为一种或多种选自以下的氨基酸：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。

任选地，所述基础培养基还可包含碳水化合物，例如包含葡萄糖的糖类。任选地，所述基础培养基包含约3-6g/L的葡萄糖。

任选地，所述基础培养基还可包含亚硒酸钠，例如约10-25μg/L，例如17μg/L。

任选地，所述基础培养基可包含缓冲剂组分，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。任选地，所述基础培养基可包含一种或多种其他组分，例如酚红、次黄嘌呤单钠丙酮酸盐、亚油酸、硫辛酸、腐胺二盐酸盐、胸苷等。

任选地，所述基础培养基包含氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖和HEPES。

任选地，所述基础培养基包含2-6g/L的氯化钠(例如4-5g/L或4.505g/L的氯化钠)、1-5g/L的碳酸氢钠(例如2-4g/L或3.024g/L的碳酸氢钠)、0.1-0.6g/L的氯化钾(例如0.2-0.4g/L或0.33g/L的氯化钾)、0.1-0.4氯化钙(例如0.15-0.2 0.1653氯化钙)、0.05-0.2g/L的磷酸一氢钠(例如0.109g/L的磷酸二氢钠)、2-8g/L的葡萄糖(例如4.5g/L葡萄糖)、2-8g/L的HEPES(例如5.958g/L的HEPES)。

本文公开的定制的

白蛋白是细胞培养中用于将未酯化的脂肪酸送入细胞或从细胞中释放出的蛋白补充剂；白蛋白可为，例如人白蛋白(HA)或牛血清白蛋白(BSA)。任选地，白蛋白为人白蛋白或HA。人白蛋白(HA)是人血清中最丰富的蛋白质，约3.5-5.0g/dL，其充当血液中类固醇和脂肪酸的载体蛋白。可商购人白蛋白，例如可从CSL Behring,King of Prussia,PA,Griffiols,Octapharma等商购。任选地，所述基础培养基补充有0.05-1.0％HA，例如0.1-1.0％、0.125％、0.5％、或1.0％的HA。

定制的

本申请的发明人已发现，出乎意料的是，尽管人AB血清已经含有白蛋白，但是向已经补充有5％的人AB血清的培养基添加少量的HA(例如0.05-1.0％、0.1-1.0％或0.125％-1％)仍然可以显著增加

乙醇胺是具有式HOCH

乙醇胺衍生物是衍生自乙醇胺的化合物(例如通过化学反应)，并包含相似的化学结构。例如，乙醇胺衍生物可以是乙醇酰胺，其通过乙醇胺与羧酸之间的缩合反应形成。乙醇胺衍生物也可以是乙醇胺磷脂，例如磷脂酰乙醇胺。可被使用的乙醇酰胺的非限制性实例包括异油酸乙醇酰胺(VEA)(例如顺式异油酸乙醇酰胺)、油酸乙醇酰胺(OEA)(例如顺式油酸乙醇酰胺)、软脂酸乙醇酰胺(PAE)和硬脂酸乙醇酰胺(SEA)。这些化合物是通常可在人和大鼠血浆中被找到的脂肪酸乙醇酰胺。

为了产生所述定制的

除乙醇胺和/或其衍生物外，还可使用其他补充剂，所述其他补充剂包含胰岛素、转铁蛋白和硒中的一种或多种。胰岛素促进葡萄糖和氨基酸的摄取、脂肪生成、细胞内运输以及蛋白质和核酸的合成。转铁蛋白是一种铁载体，也可能有助于降低氧游离基和过氧化物的毒性水平。作为亚硒酸钠的硒是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白质的辅因子，其可在培养基中被用作抗氧化剂。在所述基础培养基中补充包含胰岛素、转铁蛋白、硒和乙醇胺的混合物的溶液。任选地，在所述定制的

任选地，被添加到所述基础培养基中的一种或多种补充剂包含泊洛沙姆188(泊洛沙姆188F68)。任选地，产生的定制的

任选地，所述定制的

任选地，当所述

已经在所述定制的

任选地，所述定制的

任选地，在所述基础培养基中补充乙醇胺和HA。在某些情况下，所述定制的

任选地，在所述基础培养基中补充乙醇胺、葡萄糖、胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。表5中显示了一个说明性的实例，例如F组。

任选地，在所述基础培养基中补充有乙醇胺、HA和葡萄糖。可以如上文所述的量补充乙醇胺和HA。可将葡萄糖添加到所述基础培养基中，使得所述的定制的

在一个说明性的实例中，所述基础培养基包含4.5g/L的葡萄糖，并在所述基础培养基中补充额外量的2.0g/L的葡萄糖(以使所述定制的

任选地，还将人AB血清和/或泊洛沙姆188添加至补充有本文所述的补充剂的多种组合的基础培养基中。

包含补充有本文公开的补充剂的多种组合的基础培养基的定制的

其他促进细胞生长的物质也可被用于补充基础培养基以培养

此外，为了防止培养基被细菌或支原体污染，可将抗菌剂(例如链霉素、制霉菌素、庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星)与上述补充剂组合使用。

生长

可通过离心收集如此产生的

任选地，评估如上所述在定制的

或者，可以使用钙黄绿素释放测定法评估产生的

任选地，评估的

在定制的

可以使用细胞倍增时间，即细胞增殖并达到初始细胞数目的两倍的时间来评估

测量细胞存活率的方法也是众所周知的，例如，台盼蓝排除测定，其中死细胞被染成蓝色，并且可以通过从总细胞中减去台盼蓝染色的细胞来计算存活细胞数。细胞计数可以在血细胞计数器的计数室上进行。基于细胞显示出很大的电阻这一事实，自动细胞计数通常也用于对细胞进行计数以及测量其体积。自动细胞计数器的一个实例是可从BeckmanCoulter,Brea,CA获得的Coulter计数器。另一个实例是可从Chemometec,Denmark获得的NC-200

任选地，将在本文公开的培养基中生长的

可以使用通过本文公开的方法培养的

发现

迄今为止，对内源性NK细胞的研究表明，IL-2(1000IU/mL)对于运输过程中NK细胞的激活至关重要，但是不必将细胞维持在37℃和5％的二氧化碳中。Koepsell等，Transfusion 53:398-403(2013)。

修饰的

尽管

对内源性NK细胞的研究表明，IL-2(1000IU/mL)对于运输过程中NK细胞的激活至关重要，但是不必将细胞维持在37℃和5％的二氧化碳中。Koepsell等，Transfusion 53:398-403(2013)。但是，内源性NK细胞与

Fc受体

Fc受体结合抗体的Fc部分。几种Fc受体是已知的，并且根据它们优选的配体、亲和力、表达和与抗体结合后的作用而不同。

表1.说明性Fc受体

任选地，修饰

任选地，Fc受体是CD16。在SEQ ID NO：2中显示编码CD16的代表性氨基酸序列。在SEQ ID NO：1中显示编码CD16的代表性多核苷酸序列。在一些实施方式中，通过引入编码CD16多肽的多核苷酸来修饰

同源多核苷酸序列包括那些编码多肽序列的序列，所述多肽序列编码CD16变体。任选地，同源CD16多核苷酸的长度可以是约150至约700、约750或约800个多核苷酸，尽管具有多于700至800个多核苷酸的CD16变体在本公开的范围内。

在其他实例中，具有改变CD16氨基酸序列的多态性的cDNA序列被用于修饰

在实例中，使用本领域已知的方法(例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变)来制备变体多肽。可以在克隆的DNA上进行位点定点诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等，1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。

只要人CD16多肽的氨基酸序列中的保守置换(其中一种类别的一个氨基酸被相同类别的另一个氨基酸替代)没有实质性地改变所述多肽的活性，该保守置换就落入所公开的CD16变体的范围内。保守置换是本领域技术人员众所周知的。影响(1)多肽主链结构(例如β-折叠或α-螺旋构象)，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点的侧链的大部分的非保守置换可以修饰CD16多肽的功能或免疫学特性。非保守置换需要将其中一个类别的成员交换为另一个类别。可以将置换引入保守置换位点或更优选地引入非保守位点。

任选地，CD16多肽变体的长度为至少200个氨基酸，并且与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。在一些实施方式中，CD16多肽变体的长度为至少225个氨基酸，并且与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。

在一些实施方式中，编码CD16多肽的核酸可以编码CD16融合蛋白。CD16融合多肽包括与非CD16多肽融合的CD16的任何部分或整个CD16。在一些实施方式中，可以产生融合多肽，其中异源多肽序列与CD16的C末端融合或位于CD16的内部。通常，至多约30％的CD16胞质结构域可被替换。这样的修饰可增强表达或增强细胞毒性(例如ADCC响应性)。在其他实例中，嵌合蛋白，例如来自其他淋巴细胞激活性受体的结构域(包括但不限于Ig-a、Ig-B、CD3-e、CD3-d、DAP-12和DAP-10)替换了CD16胞质结构域的一部分。

可以通过常规技术合成融合基因，所述常规技术包括自动化的DNA合成仪和使用锚定引物的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，随后可以对所述互补的突出端进行退火和重新扩增以生成嵌合基因序列(Ausubel，2002)。许多载体是可商购的，其有助于将CD16框内亚克隆到融合部分。

嵌合抗原受体

如本文所述，将

表2：肿瘤特异性抗原和相关的恶性肿瘤

任选地，CAR靶向CD19、CD33或CSPG-4。

在实例中，使用本领域已知的方法(例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变)来制备变体多肽。可以在克隆的DNA上进行位点定点诱变(Carter，1986；Zoller和Smith，1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等，1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel，2002；Sambrook和Russell，2001)。

任选地，所述CAR靶向与特定癌症类型相关的抗原。任选地，所述癌症选自白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞白血病(包括髓母细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病和红血球性白血病))和慢性白血病(例如慢性粒细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤(例如霍奇金病和非霍奇金病)，多发性骨髓瘤，沃尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)，重链疾病，实体瘤(包括但不限于肉瘤和癌瘤(例如纤维肉瘤、粘肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内膜肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑血管瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

在一些实施方式中，使编码CAR的多核苷酸突变以改变编码CAR的氨基酸序列，而不改变CAR的功能。例如，可以在以上公开的CAR中进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换的多核苷酸置换。可以如例如专利公开号WO 2014039523、US 20140242701、US20140274909、US 20130280285和WO 2014099671中工程化CAR，其各自的全部内容通过引用并入本文。任选地，所述CAR是CD19 CAR，CD33 CAR或CSPG-4CAR。

其他修饰-细胞因子

任选地，将表达FcR的

在一个实施方式中，表达IL-2含有将IL-2引导至所述内质网的信号序列。虽然不受理论束缚，但是将IL-2引导至内质网允许IL-2以足以自分泌激活的水平表达，但不会在细胞外释放IL-2。参见Konstantinidis等，“Targeting IL-2to the endoplasmicreticulum confines autocrine growth stimulation to

其他修饰-自杀基因

术语“自杀基因”是允许对细胞的阴性选择的基因。自杀基因被用作安全系统，其允许通过引入选择剂杀死表达该基因的细胞。如果重组基因引起导致细胞生长不受控制的突变，这是期望的。已经鉴定出许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(Escherichia coli)gpt基因和大肠杆菌(E.coli)Deo基因(另参见，例如Yazawa K,FisherW E,Brunicardi F C:Current progress in suicide gene therapy for cancer.WorldJ.Surg.2002年7月；26(7):783-9)。如本文所用，自杀基因在

在一个实施方式中，自杀基因是胸苷激酶(TK)基因。TK基因可以是野生型或突变TK基因(例如tk30、tk75、sr39tk)。可以使用更昔洛韦(ganciclovir)杀死表达TK蛋白的细胞。

在另一个实施方式中，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase)，其在存在5-氟胞嘧啶的情况下对细胞有毒。Garcia-Sanchez等，“Cytosine deaminaseadenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells1million-fold when they contaminate hematopoietic cells:a potential purgingmethod for autologous transplantation.”Blood 1998年7月15日；92(2)：672-82。

在另一个实施方式中，自杀基因是在存在异环磷酰胺或环磷酰胺的情况下有毒的细胞色素P450。参见例如，Touati等，“A suicide gene therapy combining theimprovement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of ananti-tumor immune response.”Curr Gene Ther.2014；14(3):236-46。

在另一个实施方式中，所述自杀基因是iCas9。Di Stasi,(2011)“Inducibleapoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.”N Engl J Med 365:1673–1683。另参见Morgan,“Live and Let Die:A New Suicide Gene Therapy Moves tothe Clinic”Molecular Therapy(2012)；20:11–13。所述iCas9蛋白在存在小分子API903的情况下诱导凋亡。API903是在临床研究中已被证明具有良好的耐受性并已在过继细胞疗法的背景下被使用的生物惰性小分子。

在一个实施方式中，在向患者施用之前，对经修饰的

转基因表达

可通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因(例如，CD19.CAR和CD16)工程化成表达载体。可以将转基因工程化到相同的表达载体或不同的表达载体中。在优选的实施方式中，将转基因工程化到相同的载体中。

在一些实施方式中，载体允许将转基因引入细胞的基因组中。在一些实施方式中，载体具有正选择标志物。正选择标志物包括在会杀死不表达所述基因的细胞的条件下允许细胞生长的任何基因。非限制性实例包括抗生素抗性，例如遗传霉素(来自Tn5的Neo基因)。

可以使用任何数量的载体来表达Fc受体和/或CAR。在一些实施方式中，载体是质粒。在一个实施方式中，载体是病毒载体。病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等。

可使用本领域已知的任何转染方法(包括但不限于感染、电穿孔、脂转染、核转染或“基因枪”)将转基因引入

公开的是材料、组合物和组分，所述材料、组合物和组分可以用于所公开的方法和组合物，可以与所公开的方法和组合物结合使用，可用于制备所公开的方法和组合物，或是所公开方法和组合物的产物。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解的是，虽然在公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时可能没有明确地公开这些化合物的各个单独的和集体的组合和排列中的每一个的具体引用，但是本文特别考虑并描述了每一个。例如，如果公开并讨论了一种方法，并且讨论了可以对包括所述方法在内的许多分子进行的许多修饰，则所述方法的每种组合和排列以及可能的修饰都被特别考虑，除非存在特别的相反指示。同样地，也特别考虑并公开了这些的任何子集或组合。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所述公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果可以执行多种附加步骤，则应理解的是，这些附加步骤中的每一个都可以用所公开的方法中的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行，以及每个这样的组合或子集都被特别考虑并应该被认为是公开的。

实施方式

本文公开的方法和组合物包括以下示例性实施方式。

实施方式1。一种培养

实施方式2。实施方式1所述的方法，其中所述乙醇胺衍生物为乙醇酰胺。

实施方式3。实施方式2所述的方法，其中所述乙醇酰胺为异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺，软脂酸乙醇酰胺或硬脂酸乙醇酰胺。

实施方式4。实施方式1所述的方法，其中所述乙醇胺衍生物是磷脂酰乙醇胺。

实施方式5。实施方式1-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂包含1-7％的人AB血清。

实施方式6。实施方式1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。

实施方式7。实施方式1-6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含300-600IU/mL白细胞介素-2。

实施方式8。实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。

实施方式9。实施方式1-8中任一项所述的方法，其中在所述定制的

实施方式10。实施方式1-9中任一项所述的方法，其中在所述定制的

实施方式11。实施方式1-10中任一项所述的方法，其中在所述定制的

实施方式12。实施方式1-11中任一项所述的方法，其中在所述定制的

实施方式13。实施方式1-12中任一项所述的方法，其中所述

实施方式14。实施方式1-13所述的方法，其中所述定制的

实施方式15。实施方式1-14所述的方法，其中所述定制的

实施方式16。实施方式1-15中任一项所述的方法，其中在所述定制的

实施方式17。一种细胞培养物，其包含在定制的

实施方式18。一种细胞培养物，其包含在定制的

实施方式19。实施方式17或18所述的细胞培养物，其中所述乙醇胺衍生物为乙醇酰胺。

实施方式20。实施方式19所述的细胞培养物，其中所述乙醇酰胺为顺式异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺。

实施方式21。实施方式18所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。

实施方式22。实施方式17-21中任一项所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。

实施方式23。实施方式17-22中任一项所述的细胞培养物，其中所述定制的

实施方式24。实施方式17-23中任一项所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂包含0.05％至1.0％的HA。

实施方式25。实施方式17-24中任一项所述的细胞培养物，其中所述

实施方式26。实施方式17-25中任一项所述的细胞培养物，其中所述定制的

实施方式27。实施方式17-26中任一项所述的细胞培养物，其中所述

实施方式28。实施方式17-27中任一项所述的细胞培养物，其中已在所述定制的

实施方式29。实施方式17-28中任一项所述的细胞培养物，其中已在所述定制的

实施方式30。实施方式17-29中任一项所述的细胞培养物，其中当使用10：1的效应子：靶标比率时，所述

实施方式31。实施方式1-16中任一项所述的方法，其中所述定制的

实施方式32。实施方式17-30中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物的体积至少为5升。

实施方式33。实施方式17-30中任一项所述的细胞培养物，其中所述

实施例

以下实施例仅用于说明目的，不应理解为限制。本领域技术人员可以使用将类似地允许他们成功地执行以下实施例的多种替代技术和程序。

将aNK

目前，在补充有人AB血清和IL-2的参照生长培养基中培养白细胞介素2(IL-2)依赖性

将在包含人AB血清和IL-2以及其他补充剂(表3)的IMDM基础培养基中培养的aNK

表3显示了本研究中使用的多种培养基的配方。

1.所有培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。

2.亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7μg/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。

3.葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。

在该研究中，两种培养基均补充有人AB血清和白细胞介素2。亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7g/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。

结果示于表4。

1.除表中所示的补充剂外，所有培养基均补充了人AB血清和白细胞介素-2。

2.通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器确定的每个生长周期开始和结束时的aNK

3.根据通过使用NC200自动细胞计数器确定的每个生长周期开始和结束时的aNK

4.按照标准方法使用钙黄绿素释放测定法，测定了针对K562细胞的细胞毒性。

在该研究中，除了表中所示的补充剂外，所有基础培养基均补充有人AB血清和白细胞介素-2。通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器确定的每个生长周期开始和结束时的aNK

如表4所示，虽然aNK

仅补充10.0mg/L胰岛素，5.5mg/L转铁蛋白，6.7μg/L亚硒酸钠(C和H组)的IMDM基础培养基不能恢复aNK

该配方中乙醇胺的缺乏增加了平均倍增时间，并略微降低了存活率(I组相比于G组)。此外，在不含乙醇胺的组中，在循环3和5中功能活性降低(I组相比于G组)。

该研究中显示的数据表明补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、1.0％人白蛋白的IMDM基础培养基相比有包含人AB血清的参照生长培养基具有同等的aNK

数据显示，在IMDM基础培养基的配方中不存在1％人白蛋白的补充的情况下，乙醇胺增强了aNK

在该实施例中，

如表5所示，除了在C组中存在胰岛素、转铁蛋白、硒外具有相同培养基组成的C组和F组显示出良好的并且基本相同的生长速率、存活率、直接细胞毒性和ADCC。相反的是，具有与F组相同的培养基组成但没有乙醇胺的D组的细胞生长速率比F组慢16％(相比于F组的细胞倍增时间44小时，D组的细胞倍增时间为51小时，)。这表明乙醇胺对于维持所需的生长速率是有用的。培养基组成与F组相同但缺少HA的E组显示出较差的细胞毒性，在第3个周期相比于90％仅为55％，而在第5个周期相比于77％仅为57％，表明在定制的

将

在包含人AB血清和泊洛沙姆188的参照生长培养基中培养

将在包含人AB血清、泊洛沙姆188和其他补充剂(表6)的IMDM基础培养基中培养的

1.所有培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。

2.亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7μg/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。

3.葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。

在该研究中，两种基础培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7g/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。

1.除表中所示的补充剂外，所有培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。

2.通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNK

3.根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNK

4.按照标准方法使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。

在该研究中，除表中所示的补充剂外，所有基础培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNK

结果表明，当在含有0.125％人白蛋白的IMDM基础培养基中生长时(C组相比于A组)，

最佳IMDM配方中缺少胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺的补充(G组相比于F组)导致

该研究的结果表明补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、0.125％的人白蛋白的IMDM基础培养基支持

确定了在IMDM基础培养基中用于

先前的研究表明，含有人AB血清和泊洛沙姆188，并另外补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、0.125％的人白蛋白的IMDM基础培养基将支持

在多参数格式中在24孔G-Rex板中测试了在补充有人AB血清、泊洛沙姆188、2.0g/L葡萄糖和一定范围浓度的乙醇胺和人白蛋白的IMDM基础培养基配方中培养的

在第五个生长周期后，将选择的组转移至T75烧瓶中并培养单个生长周期，并使用钙黄绿素AM释放测定法以针对Ramos细胞系的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和针对K562细胞的直接细胞毒性来测量功能活性。

在该研究中，第1-5列的孔含有补充了人AB血清、泊洛沙姆188、2.0g/L葡萄糖以及指定浓度的乙醇胺(EA)和人白蛋白(HA)的IMDM基础培养基。对照孔A6和B6含有参照生长培养基；对照孔C6和D6包含补充了人AB血清、泊洛沙姆188、10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖和1.0％的人白蛋白的IMDM基础培养基。

表9总结了培养基配方中

1.使用以下方程式，根据通过使用自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的

2.根据使用自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的

3.第1-5列中的孔含有补充了人AB血清、泊洛沙姆188、2g/L的葡萄糖以及指定浓度的乙醇胺(EA)和人白蛋白(HA)的IMDM基础培养基。

4.对照孔A6和B6包含

在这项研究中，使用以下方程式，根据通过使用自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的

根据使用使用自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的

第1-5列的孔包含补充有人AB血清、泊洛沙姆188、2g/L葡萄糖和指定浓度的乙醇胺(EA)和人白蛋白(HA)的IMDM基础培养基。对照孔A6和B6包含参照生长培养基；对照孔C6和D6包含补充了人AB血清、泊洛沙姆188、10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖和1.0％的人白蛋白的IMDM基础培养基。

在包含0-20mg/L乙醇胺和0.0％-0.5％人白蛋白的IMDM基础培养基配方中生长的

没有一种测试配方显示出比参照生长培养基对照更高的生长速率或存活率，表明补充乙醇胺和人白蛋白的组合不能弥补IMDM基础配方中胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠的缺乏。

IMDM对照配方表现出比参照生长培养基对照和测试配方更长的倍增时间，这与先前较高浓度的人白蛋白抑制

为了进行功能测试，将选择的组在T75烧瓶中扩增一个生长周期，并测试针对K562细胞的直接细胞毒性和针对Ramos细胞的ADCC(表10)。

1.除所列补充剂外，IMDM基础培养基还补充了人AB血清、泊洛沙姆188、2g/L的葡萄糖。

2.按照标准方法通过使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。

在该研究中，除了所列补充剂外，基础培养基还补充有人AB血清、泊洛沙姆188、2.0g/L的葡萄糖。通过使用钙黄绿素AM释放测定法按照标准方法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。

在含有0.25％人白蛋白且具有浓度降低的乙醇胺的IMDM基础培养基中培养的

结果表明，在IMDM基础培养基(包含人AB血清和泊洛沙姆188)中补充0.2-20mg/L的乙醇胺和0.125％-0.5％的HA不会改变

在本研究中测试的IMDM基础配方中的

在具有和不具有乙醇胺补充的IMDM基础培养基的当前配方中评估了

如实施例3所示，包含人AB血清和泊洛沙姆188并另外补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、0.125％的人白蛋白的的IMDM基础培养基将支持

将在含有人AB血清、泊洛沙姆188和其他补充剂的IMDM基础培养基中培养的

1.两种基础培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。

2.亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7μg/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。

3.葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。

在本研究中，两种基础培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7g/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2.0g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。

表12中总结了本研究的结果。

1.除表中所示的补充剂外，所有基础培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。

2.通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的

3.根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNK

4.按照标准方法使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。

除表中所示的补充剂外，所有基础培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。

通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的

根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNK

按照标准方法使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。

当细胞在含有具有(B组相比于A组)和不具有(C组相比于A组)乙醇胺的补充剂的IMDM基础培养基中生长时，

结果表明，含有人AB血清和泊洛沙姆188并另外补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0g/L的葡萄糖、0.125％的人白蛋白和2.0mg/L乙醇胺的IMDM基础培养基支持

通过流式细胞术测定在表13中所述的培养基组合物中生长的

*请注意

结果显示，C-F组中的细胞均具有在目标范围内的标志物的表达，这表明本文所公开的

为了确定培养基配方的稳健性和可扩展性，将

表14–按比例放大

表15–按比例放大

应当理解的是，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将提出基于其的各种修改或改变，这些修改或改变将被包括在本申请的精神和范围之内以及所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文。

非正式序列表

SEQ ID NO:1高亲和力变体免疫球蛋白γFc区受体III-A核酸序列(全长形式)。

ATGTGGCA GCTGCTGCTG CCTACAGCTC TCCTGCTGCT GGTGTCCGCC GGCATGAGAACCGAGGATCT GCCTAAGGCC GTGGTGTTCC TGGAACCCCA GTGGTACAGA GTGCTGGAAA AGGACAGCGTGACCCTGAAG TGCCAGGGCG CCTACAGCCC CGAGGACAAT AGCACCCAGT GGTTCCACAA CGAGAGCCTGATCAGCAGCC AGGCCAGCAG CTACTTCATCGACGCCGCCA CCGTGGACGA CAGCGGCGAG TATAGATGCCAGACCAACCT GAGCACCCTGAGCGACCCCG TGCAGCTGGA AGTGCACATC GGATGGCTGC TGCTGCAGGCCCCCAGATGGGTGTTCAAAG AAGAGGACCC CATCCACCTG AGATGCCACT CTTGGAAGAACACCGCCCTGCACAAAGTGA CCTACCTGCA GAACGGCAAG GGCAGAAAGT ACTTCCACCA CAACAGCGACTTCTACATCC CCAAGGCCAC CCTGAAGGAC TCCGGCTCCT ACTTCTGCAG AGGCCTCGTGGGCAGCAAGAACGTGTCCAG CGAGACAGTG AACATCACCA TCACCCAGGG CCTGGCCGTGTCTACCATCA GCAGCTTTTTCCCACCCGGC TACCAGGTGT CCTTCTGCCT CGTGATGGTGCTGCTGTTCG CCGTGGACAC CGGCCTGTACTTCAGCGTGA AAACAAACAT CAGAAGCAGCACCCGGGACT GGAAGGACCA CAAGTTCAAG TGGCGGAAGGACCCCCAGGA CAAGTGA

SEQ ID NO:2高亲和力变体免疫球蛋白γFc区受体III-A氨基酸序列(全长形式)。以下划线标记第176位处的Val。

Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala GlyMet Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr ArgVal Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu AspAsn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser TyrPhe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn LeuSer Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu GlnAla Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser TrpLys AsnThr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys TyrPhe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly SerTyr Phe Cys Arg Gly Leu

SEQ ID NO:3ER IL-2核酸序列

ATGTACCGGATG CAGCTGCTGA GCTGTATCGC CCTGTCTCTG GCCCTCGTGA CCAACAGCGCCCCTACCAGC AGCAGCACCA AGAAAACCCA GCTGCAGCTG GAACATCTGC TGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGGCA TCAACAACTA CAAGAACCCC AAGCTGACCC GGATGCTGACCTTCAAGTTC TACATGCCCAAGAAGGCCAC CGAACTGAAA CATCTGCAGT GCCTGGAAGAGGAACTGAAG CCCCTGGAAG AAGTGCTGAACCTGGCCCAG AGCAAGAACT TCCACCTGAGGCCCAGGGAC CTGATCAGCA ACATCAACGT GATCGTGCTGGAACTGAAAG GCAGCGAGACAACCTTCATG TGCGAGTACG CCGACGAGAC AGCTACCATC GTGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTC TGCCAGAGCA TCATCAGCAC CCTGACCGGC TCCGAGAAGG ACGAGCTGTGA

SEQ ID NO:4ER IL-2(ER保留信号以下划线标记)氨基酸序列

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu ValThr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu HisLeu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro LysLeu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu LysHis Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu AlaGln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val IleVal Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu ThrAla Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile SerThr Leu Thr Gly Ser Glu