通过DNA甲基化的靶向编辑下调SNCA的表达

摘要

本发明公开了用于SNCA基因的表观基因组修饰的基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9的表观基因组修饰剂组合物及其使用方法。

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请要求2018年4月23日提交的美国临时专利申请号62/661,134、2018年5月24日提交的美国临时专利申请号62/676,149、2019年1月8日提交的美国临时专利申请号62/789,932和2019年3月26日提交的美国临时专利申请号62/824,195的优先权，每个所述临时专利申请的内容通过引用并入本文。

政府利益的陈述

本申请在美国国家神经障碍和中风研究所(National Institutes ofNeurological Disorders&Stroke)(NIH/NINDS)授予的联邦资助号为NS085011的政府支持下做出。美国政府对本发明拥有一定权利。

技术领域

本公开涉及用于SNCA基因的表观基因组修饰的基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9的表观基因组修饰剂组合物及其使用方法。

背景技术

帕金森氏病(PD)是全世界第二常见的神经变性障碍。没有有效的治疗方法来预防PD或阻止其发展。SNCA基因被认为是PD的高度重要的遗传风险因子。另外，越来越多的证据表明，野生型α-突触核蛋白水平的升高是PD发病的原因。迄今为止，由SNCA基因编码的α-突触核蛋白是用于PD的最确认和有希望的治疗靶点之一。此外，SNCA水平的操控已显示出有益的影响。然而，利用RNA干扰(RNAi)工具直接靶向SNCA转录本的研究，已经报道了与SNCA水平的剧烈降低有关的神经毒性。因此，需要鉴定和确认用于实现SNCA转录的严格调控、允许维持α-突触核蛋白的正常生理水平的靶点。

几种调控机制对SNCA表达水平有贡献，包括遗传和表观遗传调控。DNA甲基化是转录调控的重要机制，并且SNCA表达的提高可能与SNCA内含子1处CpG的去甲基化暗合。此外，研究显示了与疾病相关的SNCA内含子1的差异DNA甲基化。对PD患者的尸检脑组织和血液的分析表明，与对照供体相比，SNCA内含子1处的甲基化水平较低。在路易体痴呆(DLB)患者中也报道了SNCA内含子1处的DNA甲基化变化与SNCA-mRNA表达的升高相关联。DNA甲基化是操控SNCA基因表达的一种有吸引力的方法。此外，DNA甲基化代表了稳定的表观遗传标记，具有长期影响基因表达的潜力。

特异性靶向α-突触核蛋白表达水平是一种有吸引力的神经保护策略，并且对SNCA水平的操控已显示出有益的效果。操控SNCA水平的一种方法是通过siRNA。然而，RNAi方法具有两个重大缺点。首先，在需要严格调节以实现SNCA表达的“生理”水平的情况下，RNAi不能为敲落提供高分辨率。例如，在大鼠模型中，作为SNCA水平剧烈降低的结果，携带针对SNCA-mRNA的siRNA的AAV载体表现出高水平的毒性，并导致黑质纹状体多巴胺能神经元的显著丧失。与此相一致，MN9D细胞中SNCA的下调降低了细胞存活率。其次，RNAi可以影响除其目标靶点之外的其他基因的表达，正如通过siRNA转染后的全基因组表达谱分析所证实的。一方面SNCA过表达在PD发病机理中的作用，另一方面对维持α-突触核蛋白的正常生理水平的需求，强调了开发靶向SNCA表达的调控机制的新治疗策略的迄今为止尚未满足的需求。因此，对开发靶向SNCA表达的调控的新治疗策略，存在着尚未满足的需求。

发明内容

本发明涉及一种用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物。所述组合物包含：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性或其组合的活性的肽，和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)或(b)(ii)编码至少一种指导gRNA的核酸序列，其中所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

本发明涉及一种分离的多核苷酸，其编码所述组合物。

本发明涉及一种载体，其包含所述分离的多核苷酸。

本发明涉及一种宿主细胞，其包含所述分离的多核苷酸或所述载体。

本发明涉及一种药物组合物，其包含所述组合物、所述分离的多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞中的至少一者或其组合。

本发明涉及一种试剂盒，其包含所述组合物、所述分离的多核苷酸、所述载体中的至少一者或其组合。

本发明涉及一种在细胞中体内调节SNCA基因的表达的方法。所述方法包括将所述细胞与足以调节所述基因的表达的量的所述组合物、所述分离的多核苷酸、所述载体、所述药物组合物中的至少一者或其组合相接触。

本发明还涉及一种在对象中体内调节SNCA基因的表达的方法。所述方法包括将所述对象与足以调节所述基因的表达的量的所述组合物、所述分离的多核苷酸、所述载体、所述药物组合物中的至少一者或其组合相接触。

本发明涉及一种在对象中治疗与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的方法。所述方法包括向所述对象给药所述组合物、所述分离的多核苷酸、所述载体、所述药物组合物中的至少一者或其组合。所述方法可以包括向所述对象中的细胞给药所述组合物、所述分离的多核苷酸、所述载体、所述药物组合物中的至少一者或其组合。

本发明涉及一种在细胞中体内调节SNCA基因的表达的方法。本发明涉及一种在对象中的细胞中体内调节SNCA基因的表达的方法。本发明涉及一种在对象中体内调节SNCA基因的表达的方法。所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的下述组分相接触：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(b)(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

本发明涉及一种在对象中治疗与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的方法。本发明还涉及一种在所述对象中的细胞中治疗与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的方法。所述方法包括向所述对象或对象中的细胞给药足以调节所述基因的表达的量的下述组分：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(b)(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

本发明涉及一种用于表观基因组编辑的病毒载体系统。所述病毒载体系统包含：(a)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)编码至少一种指导RNA(gRNA)的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

附图说明

图1A-1E示出了靶向SNCA内含子1的甲基化系统的设计。图1A示出了SNCA内含子1中的被靶向区域的示意描述。上图说明了SNCA基因结构。下图描绘了内含子1中含有CpG岛的序列[Chr4：89,836,150-89,836,593(GRCh38/hg38)]。gRNA序列用粗体标注，PAM用S-字体突出，CpG被编号并用大写字母显示。图1B示出了设计的载体表达盒的示意图谱。产生了一个慢病毒载体骨架以包括单一BsrGI限制性酶位点，其两侧具有两个BsmBI位点，用于克隆gRNA。将dCAS9-DNMT3A融合转入基因整合到所述表达盒中EFS-NC启动子的下游。所述载体还表达嘌呤霉素选择标记。所述载体的其他调控元件包括引物结合位点(PBS)、剪接供体(SD)和剪接受体(SA)、中央聚嘌呤束(cPPT)和PPT、Rev响应元件(RRE)、WPRE和反转录病毒载体包装元件、psi(ψ)信号。人巨细胞病毒(hCMV)启动子、核心延伸因子1α启动子(EFS-NC)和人U6启动子被突出。图1C示出了通过p24gag ELISA测定法确定的ICLV-dCas9-DNMT3A和IDLV-dCas9-DNMT3A载体的生产滴度。所述结果以每毫升的拷贝数为单位记录，将1ngp2gag等同于1×10

图2A-2L示出了稳定转导的SNCA-Tri MD NPC的表征。图2A-2J示出了带有gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的SNCA-Tri MD NPC的代表性免疫细胞化学图像。图2A-E示出了巢蛋白的表达，图2F-2J示出了FoxA2的表达。标尺条＝10μ。图2K和图2L分别示出了巢蛋白和FoxA2在MD NPC中的表达水平。使用定量实时RT-PCR来评估标志物。mRNA的水平通过TaqMan表达测定法来测量，并使用2

图3示出了在SNCA内含子1CpG岛区域处的DNA甲基化的表征。示出了在带有gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的4个hiPSC来源的MD NPC细胞系和没有gRNA转入基因的对照细胞系中，SNCA内含子1[Chr4：89,836,150-89,836,593(GRCh38/hg38)]中的23个CpG位点的甲基化水平(％)。将来自于所述5个细胞系中的每一者的DNA进行亚硫酸氢盐转化，并通过焦磷酸测序定量确定各个CpG的甲基化(％)。条代表两个独立实验的甲基化CpG％的平均值，并且误差条代表S.E.M.。甲基化％降低的显著性使用Dunnett’s方法来检验，并进行了附加校正用于多重比较(n＝23)；**p<0.005，*p<0.05，双尾Student’s t检验。表5概述了所有甲基化％的值和所有统计学比较。

图4A-4C示出了在带有gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的MD NPC细胞系中的SNCA-mRNA和α-突触核蛋白水平。图4A示出了SNCA-mRNA的水平。所述水平使用定量RT-PCR来评估。不同细胞系中的SNCA-mRNA水平通过基于TaqMan的基因表达测定法来测量，并使用2

图5A-5B示出了gRNA4-dCas9-DNMT3A转入基因对线粒体超氧化物生产和细胞存活率的影响。图5A示出了线粒体超氧化物生产，图5B示出了细胞存活率。两者都在带有gRNA4-dCas9-DNMT3A转入基因的SNCA-Tri MD NPC和未带有gRNA转入基因的对照MD NPC细胞系中测量。将细胞在最近18个小时用或不用20μM鱼藤酮处理，然后使用MitoSox测定法确定线粒体相关的超氧化物生产(图5A)，并通过刃天青测定法确定细胞存活率(图5B)。条表示两个技术和两个生物学独立实验的各6个平行样(n＝24)的相对荧光单位的平均值±S.E.M；**p<0.005，*p<0.05；双尾Student’s t检验。

图6示出了全局DNA甲基化的分析。带有gRNA4-dCas9-DNMT3A和未带有gRNAdCas9-DNMT3A转入基因的hiPSC来源的MD NPC细胞系的全局5-mC％分析。带有gRNA4转入基因的MD NPC细胞系的全局DNA甲基化(5-mC％)与原始的未转导的hiPSC来源的MD NPC细胞系相比没有显示出统计学显著性差异(p＝0.97)。相反，未带有gRNA转入基因的细胞系相对于原始的未转导的MD NPC细胞系显示出全局DNA甲基化的显著增加(p＝0.009)。每一柱代表两个生物和技术平行样的平均值。误差条表示S.E.M。

图7示出了通过荧光活化细胞分拣(FACS)进行的iPSC来源的MD NPC的细胞表征。在多巴胺能分化中表达的神经细胞内标志物的FACS剖析。示出了巢蛋白、FOXA2的流式细胞术分析。MD祖细胞的巢蛋白和FOXA2的组合FACS分析(83.1％双阳性)。

图8示出了在大鼠成神经细胞瘤F98细胞系中通过ICLV-dCas9-DNMT3A系统下调SNCA表达。大鼠F98细胞系中的SNCA-mRNA用带有gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的慢病毒载体转导。在转导后14天，使用定量实时RT-PCR评估SNCA-mRNA的水平。不同细胞系(设计并使用了4种不同的gRNA)中SNCA-mRNA的水平通过基于Cyber green的基因表达测定法来测量，并使用2

图9A示出了用带有gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)转导的MD NPC细胞系中的SNCA-mRNA。在转导后7天使用定量实时RT-PCR来评估SNCAmRNA。不同细胞系中的SNCA-mRNA水平通过基于TaqMan的基因表达测定法来测量，并使用2

图9B示出了用带有gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)转导的MD NPC细胞系的代表性图像。图9B显示到转导后第7天IDLV基因组减少接近80％。

图10A示出了原始载体(无gRNA载体)pBK539(SEQ ID NO：40)的图谱，所述载体含有融合到dCas9的DNMT3A的催化结构域和被p2A切割信号分隔开的GFP标志物。

图10B示出了含有靶向大鼠SNCA基因的gRNA的gRNA3-载体pBK744(SEQ ID NO：41)的图谱，所述载体含有融合到dCas9的DNMT3A的催化结构域和被p2A切割信号分隔开的嘌呤霉素抗性基因。

图11示出了含有gRNA4序列的慢病毒载体表达盒(gRNA4-载体)pBK500(SEQ IDNO：38)的图谱，所述载体含有融合到dCas9的DNMT3A的催化结构域和被p2A切割信号分隔开的嘌呤霉素抗性基因。

图12A示出了原始载体(无gRNA载体)pBK492(也被称为pBK546)(SEQ ID NO：39)的图谱，所述载体含有融合到dCas9的DNMT3A的催化结构域。

图12B示出了原始载体(无gRNA载体)pBK546(也被称为pBK492)(SEQ ID NO：39)的更详细的图谱，所述载体含有融合到dCas9的DNMT3A的催化结构域和被p2A切割信号分隔开的嘌呤霉素抗性基因。

图13A-13C示出了用介质或鱼藤酮治疗的大鼠中的SNCA-mRNA和α-突触核蛋白水平。图13A示出了通过基于TaqMan的基因表达测定法评估的SNCA-mRNA水平。图13B示出了通过Western印迹半定量的α-syn蛋白的水平。图13C示出了SN和小脑中的α-突触核蛋白的相对水平。定量使用ImageJ软件来进行(Schneider等，“NIH Image到ImageJ：图像分析的25年”(NIH Image to ImageJ:25years of image analysis)，Nature Methods 9,671-675,2012)。

图14示出了对照和鱼藤酮治疗的大鼠的脑组织中的PSer129-α-突触核蛋白和遍在蛋白。与对照相比，在鱼藤酮治疗的大鼠中pSer129Syn信号提高。

图15A-15C示出了在用gRNA3(pBK744)或PBS治疗后大鼠黑质中的SNCA表达。动物用鱼藤酮治疗5天。图15A示出了mRNA水平。图15B和15C示出了蛋白质水平。图16C中示出的定量使用ImageJ软件来进行(Schneider等，“NIH Image到ImageJ：图像分析的25年”(NIHImage to ImageJ:25years of image analysis)，Nature Methods 9,671-675,2012)。

图16A-16C示出了DNA甲基化介导的SNCA减少对DNA损伤的影响。图16A和图16B分别示出了在用对照载体(无gRNA)或带有gRNA的载体处理的细胞中DNA损伤的Olive尾矩(OTM)分析。图16C示出了OTM值。

图17A-17C示出了DNA甲基化介导的SNCA减少对异常核膜形态：细胞核圆度的影响。图17A和图17B分别示出了在用对照载体(无gRNA)或带有gRNA的载体处理的细胞中使用核纤层蛋白B1标志物进行的细胞核圆度的分析。图17C示出了细胞核圆度的量。

图18A-18C示出了DNA甲基化介导的SNCA减少对异常核膜形态：细胞核折叠的影响。图18A和图18B分别示出了在用对照载体(无gRNA)或带有gRNA的载体处理的细胞中使用核纤层蛋白A/C标志物进行的细胞核折叠和鼓泡的分析。图18C示出了折叠细胞核的百分率。

图19示出了对带有gRNA4-dCas9-DNMT3A转入基因的NPC细胞和无gRNA对应物施加的热激处理和渗透处理。在所述处理后细胞核圆度的分析如本申请中别处所述使用核纤层蛋白B1标志物来进行(图19B)。带有gRNA 4的载体(gRNA4-dCas9-DNMT3A)与无gRNA对照载体相比显示出细胞核圆度的显著提高，表明它挽救了所述异常细胞核表型(图19B)。在所述处理后细胞核折叠的分析如别处所述使用核纤层蛋白A/C标志物来进行(图19A)。带有gRNA4的载体(gRNA4-dCas9-DNMT3A)与无gRNA对照载体相比显示出细胞核折叠的显著增加，表明它挽救了所述异常细胞核表型(图19C)。带有gRNA 4的载体(gRNA4-dCas9-DNMT3A)与无gRNA对照载体相比显示出细胞核对渗透处理的抗性的显著提高，表明它挽救了所述异常细胞核表型(图19C)。在这个实验中，将带有SNCA基因的三重重复的NPC与不同浓度的NaCl(范围为0至1000mM)温育，以评估核膜对渗透冲击的恢复力。条表示三个独立实验的平均值。

图20示出了用带有gRNA4-dCas9-DNMT3A(pBK500)转入基因或无gRNA-dCas9-DNMT3A对照(pBK492)的整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)转导的SH-SY5Y细胞(人类成神经细胞瘤细胞)中的SNCA-mRNA。在转导后第4、7、9、16、22、27、33和42天，使用定量实时RT-PCR评估SNCA mRNA。不同细胞系中的SNCA-mRNA水平通过基于TaqMan的基因表达测定法来测量，并使用2

图21示出了在SNCA内含子1CpG岛区域处DNA甲基化的表征。SNCA内含子1[Chr4：89,836,150-89,836,593(GRCh38/hg38)]中的23个CpG位点的甲基化水平(％)。23个CpG被突出。位于第22和23位处的CpG之间的gRNA4被突出。在这个实验中，将SH-SY5Y细胞用带有gRNA4-dCas9-DNMT3A(pBK500)转入基因或无gRNA-dCas9-DNMT3A对照(pBK492)的整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)转导。在第3、16和29天测量DNA甲基化。将来自于所述样品的DNA进行亚硫酸氢盐转化，并通过焦磷酸测序定量确定各个CpG的甲基化(％)。条代表两个独立实验的甲基化CpG％的平均值，并且误差条代表S.E.M.。甲基化％降低的显著性使用Dunnett’s方法来检验，并进行了附加校正用于多重比较(n＝23)；**p<0.005，*p<0.05，双尾Student’s t检验。

详细描述

本文描述了一种系统，其包含用于SNCA基因的靶向表观基因组编辑的一体式慢病毒载体。所公开的表观基因组修饰剂组合物可用于修饰SNCA基因中的任何调控靶点，例如内含子1和内含子4。所述系统是基于CRISPR/与催化结构域例如DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)融合的失活的Cas9核酸酶(dCas9)。本公开提供了概念验证，即通过表观基因组编辑来操控基因表达例如逆转过表达，是涉及基因表达失调的神经障碍例如PD的一种有价值的治疗策略。

CRISPR/Cas9系统为以精密方式调节基因表达提供了独一无二的机会。使用表观基因组编辑是基因疗法的一种手段，并且代表了新的智能药物，因为它被设计成靶向特定基因。在本文中，描述了创新的表观基因组编辑方法的开发和实施，用于操控内源SNCA水平以挽救疾病相关的表型。例如，在来自于具有SNCA基因座的三重重复的PD患者的人类诱导多能干细胞(hiPSC)来源的神经元中使用基于CRISPR/Cas9表观基因组的系统，通过SNCA内含子1的靶向DNA甲基化，例如沿着SNCA内含子1的CpG岛中的甲基化，引起SNCA表达的下调例如SNCA-mRNA和蛋白质的下调，并逆转了疾病相关的表型扰动。通过gRNA-dCas9-DMNT3A系统降低SNCA水平，挽救了SNCA三重重复hiPSC来源的多巴胺能神经元的与疾病相关的细胞表型特征，例如线粒体ROS生产和细胞存活率。这些发现确立了SNCA内含子1中的CpG岛的DNA超甲基化允许有效且足够严密地下调SNCA表达水平，表明了该靶序列与CRISPR/dCas9技术的组合作为PD的新的基于表观遗传学的治疗方法的潜力。

在本节和本文的整个公开中使用的节标题仅出于组织的目的而不打算用于限制。

定义

除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在有冲突的缺陷，以包括定义在内的本文件为准。下文描述了优选的方法和材料，尽管与本文中描述的相似或等效的方法和材料也可用于本发明的实践或试验。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献整体通过引用并入本文。本文公开的材料、方法和实例仅仅是说明性的而不打算用于限制。

当在本文中使用时，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“含有”及其变化形式打算作为开放性过渡短语、术语或词语，其不预先排除另外的行动或结构的可能性。不带具体数量的指称物包括复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。本公开还设想了“包含”本文中呈现的实施方式或要素、“由它们构成”或“基本上由它们构成”的其他实施方式，不论是否明确阐述。

对于本文中数值范围的叙述来说，明确考虑到了在它们之间具有相同精确度的每个居间数字。例如，对于6-9的范围来说，除了6和9之外还考虑到了数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围来说，明确考虑到了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

当在本文中使用时，术语“约”或“大约”意味着对于特定值来说在由本领域普通技术人员确定的可接受的误差范围之内，所述误差范围部分取决于如何测量或确定所述值，即测量系统的限度。例如，根据本领域中的实践，“约”可以意味着在3或大于3个标准偏差之内。或者，“约”可以意味着给定值的最高20％、优选地最高10％、更优选地最高5％、更优选地最高1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程而言，所述术语可以意味着在值的数量级之内，优选地在5倍之内，更优选地在2倍之内。

在本文中可互换使用的“腺相关病毒”或“AAV”是指属于细小病毒科依赖病毒属的小病毒，其感染人类和一些其他灵长类物种。目前尚不知道AAV会引起疾病，因此所述病毒引起非常轻微的免疫应答。

当在本文中使用时，“嵌合的”可以是指其中至少两个组分源自于不同来源(例如不同生物体、不同编码区)的核酸分子和/或多肽。当在本文中使用时，嵌合的也指称包含连接到核酸的多肽的构建物。

在本文中可互换使用的“成簇规律间隔短回文重复序列”和“CRISPR”是指含有多个短的正向重复序列的基因座，其存在于大约40％的被测序细菌和90％的被测序古菌的基因组中。

当在本文中使用时，“编码序列”或“编码核酸”意味着包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列还可以包括起始和终止信号，其可操作连接到能够在所述核酸被给药到的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件，包括启动子和多腺苷化信号。所述编码序列可以是密码子优化的。

当在本文中使用时，“互补的”意味着核酸可以满足核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。“互补性”是指两个核酸序列之间共有的性质，使得当它们彼此反向平行对齐时，在每个位置处的核苷酸碱基将是互补的。

当在本文中使用时，“互补的”可以意味着与比较性核苷酸序列100％的互补性(完全互补)，或者它可以意味着低于100％的互补性(例如基本上互补的)(例如约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的互补性等)。互补的也可以以“突变的互补体”或“与突变互补”措词使用。

当在本文中使用时，“表观基因组修饰”是指不源自于基因组修饰的影响基因活性和表达的在一个或多个染色体中的修饰或改变。表观基因组修饰是指对基因组做出的不涉及核苷酸序列改变的与功能相关的改变。表观基因组修饰可以包括对组蛋白的修饰，例如乙酰化、甲基化、磷酸化、遍在蛋白化和/或苏素化。表观基因组修饰可以包括对DNA的修饰，例如甲基化。

当在本文中使用时，“功能性”和“全功能性”描述具有生物活性的蛋白质。“功能性基因”是指转录成mRNA的基因，所述mRNA被翻译成功能性蛋白质。

当在本文中使用时，“融合蛋白”是指通过将最初编码分开的蛋白质的两个或更多个基因相连而产生的嵌合蛋白。融合基因的翻译产生具有源自于每个原始蛋白质的功能性质的单一多肽。

当在本文中使用时，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、反义microRNA、调控RNA等的核酸分子。基因可能能够或可能不能够用于产生功能性蛋白质或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区两者(例如内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区)。基因可以是“分离的”，这意味着核酸实质上或基本上不含在天然状态下通常与所述核酸相伴发现的组分。此类组分包括其他细胞材料、来自于重组生产的培养基和/或在化学合成所述核酸中使用的各种不同化学物质。

当在本文中使用时，“遗传构建物”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包括起始和终止信号，其可操作连接到能够在所述核酸被给药到的个体的细胞中指导表达的调控元件，包括启动子和多腺苷化信号。当在本文中使用时，术语“可表达形式”是指含有可操作连接到编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，使得当存在于个体的细胞中时所述编码序列将被表达的基因构建物。

当在本文中使用时，术语“基因组”包括生物体的染色体/核基因组以及任何线粒体和/或质粒基因组。

当在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中使用时，“一致的”或“同一性”意味着所述序列在指定区域内具有指定百分率的相同残基。所述百分率可以如下计算：将所述两个序列最佳对齐，在所述指定区域内比较所述两个序列，确定在两个序列内出现一致残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，用所述匹配位置的数目除以所述指定区域中的位置总数并将结果乘以100，得到序列同一性的百分率。在所述两个序列具有不同长度或所述对齐产生一个或更多个交错末端并且所述比较的指定区域只包括单一序列的情况下，所述单一序列的残基被包括在计算的分母中但不包括在分子中。当比较DNA与RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性分析可以手动或使用计算机序列算法例如BLAST或BLAST 2.0来进行。

当在本文中使用时，术语“提高”和“增强”(及其语法变化形式)描述了与对照相比升高至少约25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。

“分离的”多核苷酸或“分离的”多肽是通过人工操作而独立于其本源环境存在并因此不是自然界的产物的核苷酸序列或多肽序列。在某些实施方式中，本公开的多核苷酸和多肽是“分离的”。分离的多核苷酸或多肽可以以纯化的形式存在，其至少部分与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分例如细胞或病毒结构组分或通常与所述多肽或多核苷酸相伴发现的其他多肽或多核苷酸分离开。在代表性实施方式中，所述分离的多核苷酸和/或分离的多肽的纯度为至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。

在其他实施方式中，分离的多核苷酸或多肽可以存在于非本源环境例如重组宿主细胞中。因此，例如对于核苷酸序列而言，术语“分离的”意味着它与它天然存在于其中的染色体和/或细胞分离开。如果多核苷酸与它天然存在于其中的染色体和/或细胞分离开，然后被插入到它不天然存在于其中的遗传背景、染色体和/或细胞(例如与自然界中发现的相比不同的宿主细胞、不同的调控序列和/或不同的基因组位置)中，则所述多核苷酸也是分离的。因此，所述多核苷酸和它们编码的多肽是“分离的”，因为它们通过人工操作而独立于其本源环境存在并因此不是自然界的产物，然而在某些实施方式中，它们可以被引入到并存在于重组宿主细胞中。

在本文中可互换使用的“多顺反子的”或“多顺反子”是指具有超过一个编码区的多核苷酸，以便从同一个多核苷酸产生超过一种蛋白质。所述多顺反子多核苷酸序列可以包括内部核糖体进入位点(IRES)、切割肽(p2A、t2A等)、不同启动子的利用等。

在本文中可互换使用的“突变体基因”或“突变基因”是指经历了可检测突变的基因。突变体基因已经历了影响所述基因的正常传递和表达的变化，例如遗传物质的丧失、获得或交换。

“本源的”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，“野生型mRNA”是天然存在于所述生物体中或所述生物体内源的mRNA。“同源”核酸是与其被引入到其中的宿主细胞天然相伴的核苷酸序列。

“神经变性疾病”是以包括神经元死亡在内的神经元结构或功能的渐进性丧失为特征、由它们引起或导致它们的障碍。神经变性疾病包括例如阿兹海默氏病(AD)、淀粉样变性、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病(PD)、亨廷顿病、朊病毒疾病、运动神经元疾病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、神经元丧失、认知缺陷、原发性年龄相关性tau蛋白病(PART)/以神经原纤维缠结为主的老年痴呆、慢性创伤性脑病包括拳击手痴呆、路易体痴呆(路易体痴呆症)、神经轴突营养不良和多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、皮克氏病、皮质基底节变性、某些形式的额颞叶变性、额颞叶痴呆和与17号染色体有关的帕金森氏症、Lytico-Bodig病(关岛帕金森-痴呆综合症)、神经节神经胶质瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤、脑炎后帕金森氏症、亚急性硬化性全脑炎、铅中毒脑病、结节性硬化症、Hallervorden-Spatz病和脂褐质沉积症。当在本文中使用时，“正常基因”是指未经历变化例如遗传物质的丧失、获得或交换的基因。所述正常基因经历正常的基因传递和基因表达。

当在本文中使用时，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意味着共价连接在一起的至少两个核苷酸。单个链的描绘也定义了互补链的序列。因此，核酸也涵盖所描绘的单个链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸也涵盖基本上一致的核酸及其互补体。单链提供了在严紧杂交条件下可以杂交到靶序列的探针。因此，核酸还涵盖在严紧杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列两者的部分。所述核酸可以是作为基因组DNA和cDNA两者的DNA、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。

在本文中可互换使用的“核定位信号”、“核定位序列”或“NLS”是指为蛋白质添加“标签”，用于将所述蛋白质通过核转运输入到细胞核中的氨基酸序列。通常，该信号由暴露在蛋白质表面上的带正电荷的赖氨酸或精氨酸的一个或多个短序列构成。不同的核定位的蛋白质可以共有相同的NLS。NLS具有与将蛋白质靶向到细胞核外的核输出信号相反的功能。

当在本文中使用时，“可操作连接的”是指基因的表达在与其空间上相连的启动子的控制之下。启动子可以位于在其控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。所述启动子与基因之间的距离可以与在所述启动子所源自的基因中所述启动子与在其控制之下的基因之间的距离大致相同。正如本领域中已知的，在这个距离之内的变动可以被适应而不丧失启动子功能。

当在本文中使用时，术语“序列同一性百分率”或“同一性百分率”是指当最佳对齐时，与测试(“对象”)多核苷酸分子(或其互补链)相比，在参比(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸中一致的核苷酸的百分率。在某些实施方式中，“同一性百分率”可以是指氨基酸序列中一致的氨基酸的百分率。

当在本文中使用时，术语“多核苷酸”是指核苷酸的异聚物或这些核苷酸从核酸分子的5'至3'末端的序列，并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成的(例如化学合成的)DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其中的任一者可以是单链或双链的。术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”和“寡核苷酸”在本文中也可互换使用，以指称核苷酸的异聚物。除非另有指明，否则本文中提供的核酸分子和/或多核苷酸在本文中以从左至右5’至3’的方向呈现，并使用在美国序列规则37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中阐述的表示核苷酸特点的标准密码来表示。

术语“预防”(及其语法变化形式)是指在对象中阻止和/或延迟感染、疾病、病症和/或临床症状的发作，和/或相对于在所述疾病、障碍和/或临床症状发作之前不执行本公开的方法的情况下所发生的，所述感染、疾病、病症和/或临床症状发作的严重性的降低。

当在本文中使用时，“启动子”意味着合成或天然来源的分子，其能够在细胞中提供、激活或增强核酸的表达。启动子可以包含一个或多个特定转录调控序列，以进一步增强核酸的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子也可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对之处。启动子可以源自于多种来源，包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物。启动子可以组成性地或针对表达发生在其中的细胞、组织或器官或针对表达发生时的发育阶段或对外部刺激例如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂做出响应而差异性地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括EFS启动子、噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子、人类U6(hU6)启动子和CMV IE启动子。

“原型间隔物序列”是指靶双链DNA，并且具体来说是指所述靶DNA(或例如基因组中的靶区域)的与CRISPR阵列的间隔物序列完全或基本上互补(并与其杂交)的部分。I型系统中的原型间隔物序列在3’末端处侧翼直接带有PAM。间隔物被设计成与所述原型间隔物互补。

“原型间隔物邻近基序(PAM)”是直接出现在原型间隔物的3’或5’端的2-4个碱基对的短基序。

当在本文中使用时，术语“降低”、“减小”、“抑制”和“减少”(及其语法变化形式)描述了例如与对照相比减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在特定实施方式中，所述降低导致没有或基本上没有(即不显著的量例如少于约10％或甚至少于约5％)可检测的活性或量。

当在本文中使用时，“序列同一性”是指两个最佳对齐的多核苷酸或肽序列在组分例如核苷酸或氨基酸的整个比对窗口中不变的程度。“同一性”可以通过已知方法容易地计算，包括但不限于在下述文献中描述的方法：《计算分子生物学》(ComputationalMolecular Biology)(Lesk,A.M.主编)Oxford University Press,New York(1988)；《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)(Smith,D.W.主编)Academic Press,New York(1993)；《序列数据的计算机分析第I部分》(ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I)(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.主编)HumanaPress,New Jersey(1994)；《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis inMolecular Biology)(von Heinje,G.主编)Academic Press(1987)；和《序列分析初级读本》(Sequence Analysis Primer)(Gribskov,M.和Devereux,J.主编)Stockton Press,NewYork(1991)。

在本文中可互换使用的“对象”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如奶牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人类灵长类动物(例如猴如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人类)。在某些实施方式中，所述对象可以是人类或非人类动物。所述对象或患者可能正经历其他形式的治疗。

当在本文中使用时，“靶基因”是指编码已知或推测的基因产物的任何核苷酸序列。所述靶基因可以是涉及遗传疾病或障碍的突变的基因。所述靶基因可以是SNCA。

当在本文中使用时，“靶区域”是指靶基因和/或染色体的所述用于靶基因的表观基因组修饰的组合物被设计将会结合和修饰的区域。

在本文中可互换使用的术语“转化”、“转染”和“转导”是指将异源核酸分子引入细胞中。这种在细胞中的引入可以是稳定或瞬时的。因此，在某些实施方式中，将宿主细胞或宿主生物体用本公开的多核苷酸稳定转化。在其他实施方式中，将宿主细胞或宿主生物体用本公开的多核苷酸瞬时转化。在多核苷酸的情形中，“瞬时转化”意味着将多核苷酸引入到所述细胞中并且不整合到所述细胞的基因组中。在将多核苷酸引入到细胞中的情形中，“稳定引入”意指所引入的多核苷酸被稳定地并入到所述细胞的基因组中，因此所述细胞被所述多核苷酸稳定转化。当在本文中使用时，“稳定转化”意味着核酸分子被引入到细胞中并整合到所述细胞的基因组中。因此，所整合的核酸分子能够被其后代、更具体来说被多个连续世代的后代遗传。当在本文中使用时，“基因组”还包括核、质粒和质体基因组，并因此包括核酸构建物在例如叶绿体或线粒体基因组中的整合。当在本文中使用时，稳定转化也可以是指在染色体外例如作为微型染色体或质粒维持的转入基因。在某些实施方式中，所述核苷酸序列、构建物、表达盒可以被瞬时表达，和/或它们可以被稳定地并入到宿主生物体的基因组中。

当在本文中使用时，“转入基因”是指含有已从一个生物体分离并被引入到不同生物体中的基因序列的基因或遗传物质。这种非本源DNA区段可以保留在所述转基因生物体中产生RNA或蛋白质的能力，或者它可以改变所述转基因生物体的遗传密码的正常功能。转入基因的引入具有改变生物体的表型的潜力。

术语“治疗”打算是指对象的疾病或障碍的严重性降低或至少部分改善或改变以及实现至少一种临床症状的一定程度的缓和、减轻或减少，和/或存在所述疾病或障碍的进展的延迟和/或疾病或障碍的发作的延迟。在某些实施方式中，所述术语是指例如所述疾病或障碍的症状或其他表现的减轻。在某些实施方式中，治疗提供了所述疾病或障碍的症状或其他表现的至少约5％的减轻，例如约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的减轻。

本文中针对核酸使用的“变体”意味着(i)所指核苷酸序列的部分或片段；(ii)所指核苷酸序列的互补体或其部分；(iii)与所指核酸或其互补体基本上一致的核酸；或(iv)在严紧条件下与所指核酸、其互补体或与其基本上一致的序列杂交的核酸。

对于肽或多肽来说，“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守替换而导致氨基酸序列不同，但保留了至少一种生物活性的肽或多肽。变体也可以意味着具有与所指蛋白质基本上一致的氨基酸序列，并保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守替换，即将氨基酸用性质(例如亲水性、带电荷区域的程度和分布)相似的不同氨基酸代替，在本领域中被认为通常涉及微小变化。正如本领域中理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中，已知亲水指数相近的氨基酸可以替换并仍保留蛋白质功能。一方面，将具有±2的亲水指数的氨基酸进行替换。氨基酸的亲水性也可用于揭示将会产生保留生物功能的蛋白质的替换。在肽的情形中，考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性。替换可以使用亲水性值在彼此的±2之内的氨基酸来进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受到该氨基酸的具体侧链的影响。与该观察相一致，与生物功能相容的氨基酸替换被理解为取决于所述氨基酸、特别是那些氨基酸的侧链的相对相似性，正如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭示的。

当在本文中使用时，“载体”意味着含有复制原点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并且优选地是DNA质粒。

除非在本文中另有定义，否则与本公开相结合使用的科学和技术术语均应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，本文中描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学和杂交相结合使用的任何名称以及所述领域的任何技术，均为本领域中公知且常用的。术语的含义和范围应当清楚；然而，在有任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。

用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物

本发明涉及用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物。所述表观基因组修饰可以直接或间接激活或阻遏SNCA基因的表达。已将SNCA基因与帕金森氏病(PD)相关联，并且越来越多的证据表明野生型SNCA水平升高是致病的。SNCA基因的调控区的表观基因组修饰可以包括甲基化和其他表观遗传修饰。例如，针对SNCA基因、特别是内含子1或内含子4的DNA甲基化编辑，是用于神经变性障碍例如SNCA相关疾病或障碍、用于SNCA表达的下调和逆转疾病相关的细胞扰动的潜在治疗靶点。另一方面，正常生理水平的SNCA是维持神经元功能所需要的。SNCA内含子1处的DNA甲基化对SNCA转录的调控有贡献，并且在PD与对照之间发现了SNCA内含子1处的差异甲基化水平。SNCA基因的内含子4约为90kb并跨越所述基因的整个基因组序列的大部分。基于与DNaseI超敏性位点(DHS)、H3K4Me3、H3K4Me1或H3K27Ac标记的重叠和强RepeatMasker信号，可以将内含子4分成子区域。内含子4与阿兹海默氏病中的路易体病相关，并且可能参与SNCA表达。因此，SNCA内含子1基因座或内含子4处的DNA修饰，包括甲基化或乙酰化，是用于SNCA水平的精细下调的有吸引力的靶点。

所述组合物包括但不限于可用于SNCA基因的表观基因组修饰的融合蛋白或编码所述融合蛋白的核酸。所述融合蛋白包括两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包括成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包括具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽。在某些实施方式中，所述融合蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO：13。

在某些实施方式中，所述组合物包括融合蛋白或编码融合蛋白的核酸，以及至少一种指导RNA(gRNA)或编码至少一种指导RNA的核酸，所述至少一种指导RNA将所述融合蛋白靶向到SNCA基因中的靶区域。在某些实施方式中，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到SNCA基因的内含子1中的靶区域。在某些实施方式中，所述组合物修饰SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域。所述CpG岛区域可以包括CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG10、CpG11、CpG12、CpG13、CpG14、CpG15、CpG16、CpG17、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22、CpG23或其组合。例如，所述CpG岛区域可以包括CpG1、CpG3、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22或其组合。在某些实施方式中，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到SNCA基因的内含子4中的靶区域。

在某些实施方式中，所述第二多肽结构域包括具有甲基转移酶活性的肽。在此类实施方式中，所述融合蛋白将SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域甲基化。在某些实施方式中，所述第二多肽结构域包含DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A(DNMT3A)、其功能性片段和/或其变体。在某些实施方式中，所述第二多肽结构域被融合到所述第一多肽结构域的C-端、N-端或两端。在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含核定位序列。在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含将所述第一多肽结构域连接到所述第二多肽结构域的连接物。在某些实施方式中，所述第二多肽结构域包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

a.CRISPR系统

在本文中可互换使用的“成簇规律间隔短回文重复序列”和“CRISPR”是指含有多个短的正向重复序列的基因座，其存在于大约40％的被测序细菌和90％的被测序古菌的基因组中。所述CRISPR系统是一种涉及针对侵入的噬菌体和质粒的防御的微生物核酸酶系统，其提供了一种形式的获得性免疫。在微生物宿主中，CRISPR基因座含有CRISPR相关蛋白(Cas)基因以及能够规划CRISPR介导的核酸切割的特异性的非编码RNA元件的组合。被称为间隔物的短的外来DNA区段被并入到所述基因组中CRISPR重复序列之间，并充当过去暴露的“记忆”。Cas9与sgRNA(在本文中也被可互换地称为“gRNA”)的3’末端形成复合体，并且所述蛋白质-RNA对通过所述sgRNA序列的5’末端与预先确定的被称为原型间隔物的20bp DNA序列之间的互补碱基配对来识别它的基因组靶。这种复合体通过crRNA内编码的区域即所述原型间隔物和病原体基因组内的原型间隔物邻近基序(PAM)，被导向病原体DNA的同源基因座。所述非编码CRISPR阵列被转录，并在正向重复序列内切割成含有单个间隔物序列的短的crRNA，其将Cas核酸酶导向所述靶位点(原型间隔物)。通过仅仅更换被表达的sgRNA的20bp识别序列，可以将所述Cas9核酸酶导向新的基因组靶点。以与真核生物体中的RNAi类似的方式，CRISPR间隔物被用于识别和沉默外源遗传元件。

已知三种类型的CRISPR系统(I、II和III型效应物系统)。所述II型效应物系统使用单一效应物酶Cas9切割dsDNA，在4个顺序步骤中执行靶向DNA双链断裂。与需要多种不同效应物作为复合体起作用的I型和III型效应物系统相比，所述II型效应物系统可以在可选的背景例如真核细胞中起作用。所述II型效应物系统由从含有间隔物的CRISPR基因座转录的长的pre-crRNA、Cas9蛋白和参与pre-crRNA加工的tracrRNA构成。所述tracrRNA杂交到分隔所述pre-crRNA的间隔物的重复区，因此启动内源RNase III对dsRNA的切割。在这个切割之后是在每个间隔物内通过Cas9进行的第二个切割事件，产生仍然与所述tracrRNA和Cas9结合的成熟crRNA，形成Cas9:crRNA-tracrRNA复合体。

所述Cas9:crRNA-tracrRNA复合体解开DNA双链体并搜索与所述crRNA匹配的序列进行切割。在靶DNA中的“原型间隔物”序列与crRNA中的剩余间隔物序列之间检测到互补性后，发生靶识别。如果在原型间隔物的3’末端处也存在正确的原型间隔物邻近基序(PAM)，则Cas9介导靶DNA的切割。为了进行原型间隔物靶向，所述序列必须在后面紧跟有原型间隔物邻近基序(PAM)这种被DNA切割所需的Cas9核酸酶识别的短序列。不同的II型系统具有不同的PAM要求。酿脓链球菌(S.pyogenes)CRISPR系统可能具有用于这种Cas9(SpCas9)的PAM序列5’-NRG-3’，其中R是A或G，并且在人类细胞中表征了这个系统的特异性。所述基于CRISPR/Cas9的表观基因组修饰剂和修饰系统的独立无二的能力是通过将单一Cas9蛋白与两种或更多种sgRNA共表达而同时靶向多个不同基因组位点的直截了当的能力。例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)II型系统天然偏好使用“NGG”序列，其中“N”可以是任何核苷酸，但是也接受其他PAM序列，例如工程化系统中的“NAG”(Hsu等，NatureBiotechnology(2013)doi:10.1038/nbt.2647)。同样地，源自于脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的Cas9(NmCas9)通常具有NNNNGATT的本源PAM，但在各种不同的PAM中也具有活性，包括高度简并的NNNNGNNN PAM(Esvelt等，Nature Methods(2013)doi:10.1038/nmeth.2681)。

已显示，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型效应物系统的工程化改造的形式在人类细胞中起作用，可用于基因组工程。在这个系统中，Cas9蛋白通过合成重建的“指导RNA”(“gRNA”，在本文中也可互换地用作嵌合单一指导RNA(“sgRNA”))导向基因组靶位点，所述指导RNA是crRNA-tracrRNA融合体，这总体上消除了对RNase III和crRNA加工的需求。

b.Cas

所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物可以包含Cas融合蛋白。在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物可以包含Cas9融合蛋白，其中所述Cas9蛋白被突变以便失活核酸酶活性，即Cas9变体。Cas9蛋白是一种切割核酸的核酸内切酶，由CRISPR基因座编码并参与II型CRISPR系统。所述Cas9蛋白可以来自于任何细菌或古菌物种，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophiles)或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)。最近，已在细菌、酵母和人类细胞中将没有核酸内切酶活性的失活的Cas9蛋白(“iCas9”，也被称为“dCas9”)通过gRNA靶向到基因，以通过空间位阻来沉默基因表达。当在本文中使用时，“iCas9”和“dCas9”两者都是指具有氨基酸替换D10A和H840A并且核酸酶活性被失活的Cas9蛋白。例如，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物可以包括SEQ ID NO：10的dCas9。

c.Cas融合蛋白

所述组合物包括Cas融合蛋白。所述融合蛋白可以包括两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包括成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包括具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽。在某些实施方式中，所述第二多肽结构域被融合到所述第一多肽结构域的C-端、N-端或两端。在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含核定位序列。在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含将所述第一多肽结构域连接到所述第二多肽结构域的连接物。在某些实施方式中，所述融合蛋白阻遏SNCA基因的转录。在某些实施方式中，所述融合蛋白由包含SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的多核苷酸序列编码。

i.转录激活活性

所述第二多肽结构域可以具有转录激活活性，即反式激活结构域。例如，所述反式激活结构域可以包括VP16蛋白、多个VP16蛋白，例如VP48结构域或VP64结构域，或者具有NFκB转录激活物活性的p65结构域。

ii.转录阻遏活性

所述第二多肽结构域可以具有转录阻遏活性。所述第二多肽结构域可以具有Kruppel结合盒活性例如KRAB结构域、ERF阻遏物结构域活性、Mxi1阻遏物结构域活性、SID4X阻遏物结构域活性、Mad-SID阻遏物结构域活性或TATA盒结合蛋白活性。

iii.转录释放因子活性

所述第二多肽结构域可以具有转录释放因子活性。所述第二多肽结构域可以具有真核释放因子1(ERF1)活性或真核释放因子3(ERF3)活性。

iv.组蛋白修饰活性

所述第二多肽结构域可以具有组蛋白修饰活性。组蛋白修饰是对组蛋白进行的一种共价翻译后修饰(PTM)，其包括甲基化、磷酸化、乙酰化、遍在蛋白化和苏素化。所述对组蛋白做出的PTM可以通过改变染色质结构或召集组蛋白修饰物来影响基因表达。组蛋白的作用是包装DNA，DNA围绕8个组蛋白缠绕成染色体。组蛋白修饰参与多种生物过程，例如转录激活/失活、染色体包装和DNA损伤/修复。所述第二多肽结构域可以具有组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白脱甲基酶或组蛋白甲基转移酶活性。

v.核酸结合活性

所述第二多肽结构域可以具有核酸结合活性或核酸结合蛋白DNA结合结构域(DBD)，所述结构域是独立折叠的蛋白质结构域，其含有至少一个识别双链或单链DNA的基序。DBD可以识别特定DNA序列(识别序列)或对DNA具有普遍亲和性。核酸结合区可以是螺旋-转角-螺旋区、亮氨酸拉链区、有翼螺旋区、有翼螺旋-转角-螺旋区、螺旋-环-螺旋区、免疫球蛋白折叠、B3结构域、锌指、HMG盒、Wor3结构域、TAL效应物DNA结合结构域。

vi.甲基转移酶活性

所述第二多肽结构域可以具有甲基转移酶活性，所述活性包括将甲基转移到DNA、RNA、蛋白质、小分子、胞嘧啶或腺嘌呤。DNA甲基化在调节α-突触核蛋白表达中发挥作用。已报道了与健康个体相比在PD和路易体痴呆症(DLB)患者中SNCA内含子1中富含CpG的区域的差异甲基化，具体来说，在PD和DLB脑中检测到CpG处的超甲基化。本文中的实施例证实了SNCA内含子1中的CpG的直接甲基化足以实现SNCA-mRNA的可持续且长期的下调。此外，正如通过线粒体ROS产生和提高细胞存活率所测量的，SNCA-mRNA的降低通过提高细胞存活率、改善线粒体功能和缓解氧化应激的细胞诱导的易感性，逆转了SNCA-Tri MD NPC的异常表型。

在某些实施方式中，所述第二多肽结构域可以包括DNA甲基转移酶。在某些实施方式中，所述甲基化酶活性结构域可以是DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A(DNMT3a)。DNMT3a是一种催化甲基向DNA中的特定CpG结构转移的酶。在人类中所述酶由DNMT3A基因编码。在某些实施方式中，所述第二多肽结构域可以直接或间接引起DNA的甲基化。

vii.脱甲基酶活性

所述第二多肽结构域可以具有脱甲基酶活性。所述第二多肽结构域可以包括从核酸、蛋白质(特别是组蛋白)和其他分子移除甲基(CH

viii.乙酰转移酶活性

所述第二多肽结构域可以具有乙酰转移酶活性。所述第二多肽结构域可以包括将乙酰基(CH

ix.脱乙酰酶活性

所述第二多肽结构域可以具有脱乙酰酶活性。所述第二多肽结构域可以包括从分子移除乙酰基(CH

d.gRNA

在某些实施方式中，所述组合物包括融合蛋白或编码融合蛋白的核酸，以及至少一种指导RNA(gRNA)或编码至少一种指导RNA的核酸，所述至少一种指导RNA将所述融合蛋白靶向到SNCA基因中的靶区域。所述gRNA提供了基于CRISPR/Cas9的表观基因组修饰系统的靶向。所述gRNA是两个非编码RNA的融合体：crRNA和tracrRNA。所述sgRNA可以通过更换编码20bp原型间隔物的序列来靶向任何所需DNA序列，所述原型间隔物通过与所述所需DNA靶的互补碱基配对来提供靶向特异性。gRNA模拟包含在II型效应物系统中的天然存在的crRNA:tracrRNA双链体。这种可以包括例如42个核苷酸的crRNA和75个核苷酸的tracrRNA的双链体充当Cas9的向导。

所述gRNA可以靶向并结合SNCA基因的靶区域。在某些实施方式中，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到SNCA基因的内含子1中的靶区域。在某些实施方式中，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到SNCA基因的内含子4中的靶区域。例如，所述至少一种gRNA可以将所述融合蛋白靶向到SNCA基因的内含子1的CpG岛区域。在某些实施方式中，所述组合物修饰SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域。所述CpG岛区域可以包括CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG10、CpG11、CpG12、CpG13、CpG14、CpG15、CpG16、CpG17、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22、CpG23或其组合。例如，所述CpG岛区域可以包括CpG1、CpG3、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22或其组合。

在某些实施方式中，所述至少一种gRNA包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、其互补体、其变体中的至少一者或其组合的多核苷酸序列。在某些实施方式中，所述组合物包含1至10种之间的不同gRNA分子。在某些实施方式中，所述系统包含两种或更多种gRNA分子。在某些实施方式中，本公开的表观基因组修饰系统包括至少一种gRNA、至少两种不同gRNA、至少三种不同gRNA、至少四种不同gRNA、至少五种不同gRNA、至少六种不同gRNA、至少七种不同gRNA、至少八种不同gRNA、至少九种不同gRNA或至少十种不同gRNA。在某些实施方式中，所述组合物包含十种不同gRNA。在某些实施方式中，所述表观基因组修饰系统包括包含SEQ ID NO：2中阐述的核苷酸序列的gRNA、包含SEQ ID NO：3中阐述的核苷酸序列的gRNA、包含SEQ ID NO：4中阐述的核苷酸序列的gRNA和包含SEQ ID NO：5中阐述的核苷酸序列的gRNA。

3.构建物和质粒

所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物可以包含编码所述组合物的遗传构建物。所述遗传构建物例如质粒可以包含编码所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的核酸。所述遗传构建物可以编码所述cas融合蛋白和/或至少一种所述gRNA。如上所述，所述组合物可以包含编码修饰的AAV载体或慢病毒载体的遗传构建物和编码本文中公开的组合物的核酸序列。所述遗传构建物例如重组质粒或重组病毒粒子可以包含编码所述Cas融合蛋白和至少一种gRNA的核酸。在某些实施方式中，所述遗传构建物可以包含编码所述Cas融合蛋白和至少两种不同gRNA的核酸。在某些实施方式中，所述遗传构建物可以包含编码所述Cas融合蛋白和超过两种不同gRNA的核酸。在某些实施方式中，本公开包括编码所公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的分离的多核苷酸。所述分离的多核苷酸可以编码所述Cas融合蛋白和至少一种gRNA。所述分离的多核苷酸可以包含SEQ ID NO：14的多核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述遗传构建物可以包含可操作连接到编码所述至少一种gRNA分子和/或Cas融合蛋白分子的核苷酸序列的启动子。在某些实施方式中，所述启动子被可操作连接到编码两种或更多种gRNA分子和/或Cas融合蛋白分子的核苷酸序列。所述遗传构建物可以作为功能性染色体外分子存在于细胞中。所述遗传构建物可以是包括着丝粒、端粒在内的线性微型染色体或者质粒或粘粒。

所述遗传构建物也可以是包括重组慢病毒、重组腺病毒和重组腺相关病毒在内的重组病毒载体的基因组的一部分。所述遗传构建物可以是减弱的活微生物或生活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的一部分。所述遗传构建物可以包含用于核酸编码序列的基因表达的调控元件。所述调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多腺苷化信号。

在某些实施方式中，所述遗传构建物是载体。所述载体可以是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒载体。所述载体可以是质粒。所述载体可用于体内基因疗法。所述载体可以是重组的。所述载体可以包含编码所述Cas融合蛋白的异源核酸。所述载体可用于用编码所述Cas融合蛋白的核酸转染细胞，将被转化的宿主细胞在其中发生所述Cas融合蛋白的表达的条件下培养和维持。

为了获得稳定性和高水平的表达，可以将编码序列优化。在某些情况下，对密码子进行选择以减少RNA二级结构的形成，例如由于分子内键合而形成的二级结构。

所述载体可以包含编码所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的异源核酸，并且还可以包含可能在所述编码序列上游的起始密码子和可能在所述编码序列下游的终止密码子。所述起始和终止密码子可以与所述编码序列同框。所述载体还可以包含可操作连接到所述编码序列的启动子。所述可操作连接到编码序列的启动子可以是来自于猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子或hCMV、Epstein Barr病毒(EBV)启动子、EFS启动子、U6启动子例如人类U6启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子也可以是来自于人类基因例如人遍在蛋白C(hUbC)、人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸激酶或人金属硫蛋白的启动子。所述启动子也可以是天然或合成的组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子。这些启动子的实例描述在美国专利申请公布号US20040175727和US20040192593中，其内容整体通过引用并入本文。肌肉特异性启动子的实例包括Spc5-12启动子(描述在整体通过引用并入本文的美国专利申请公布号US20040192593；Hakim等，Mol.Ther.Methods Clin.Dev.(2014)1:14002；和Lai等，Hum MolGenet.(2014)23(12):3189–3199中)、MHCK7启动子(描述在Salva等，Mol.Ther.(2007)15:320-329中)、CK8启动子(描述在Park等，PLoS ONE(2015)10(4):e0124914中)和CK8e启动子(描述在Muir等，Mol.Ther.Methods Clin.Dev.(2014)1:14025中)。在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的表达由tRNA驱动。

每个所述编码gRNA分子和/或Cas融合蛋白分子的多核苷酸序列可以各自被可操作连接到启动子。所述可操作连接到gRNA分子和/或Cas融合蛋白分子的启动子可以是相同启动子。所述可操作连接到gRNA分子和/或Cas融合蛋白分子的启动子可以是不同启动子。所述启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、阻遏型启动子或调控型启动子。

所述载体也可以包含多腺苷化信号，其可以在所述编码序列的下游。所述多腺苷化信号可以是SV40多腺苷化信号、LTR多腺苷化信号、牛生长激素(bGH)多腺苷化信号、人生长激素(hGH)多腺苷化信号或人β-珠蛋白多腺苷化信号。所述SV40多腺苷化信号可以是来自于pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的多腺苷化信号。

所述载体还可以包含在所述编码序列上游的增强子。所述增强子可能是DNA表达所必需的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸激酶的增强子或病毒增强子例如来自于CMV、HA、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强子被描述在美国专利号5,593,972、5,962,428和WO94/016737中，每个所述专利的内容通过引用完全并入。所述载体还可以包含哺乳动物复制原点，以便在染色体外维持所述载体并在细胞中产生所述载体的多个拷贝。所述载体还可以包含调控序列，其可以良好地适合于在所述载体被给药到的哺乳动物或人类细胞中的基因表达。所述载体还可以包含报告基因例如绿色荧光蛋白(“GFP”)和/或可选择标记例如潮霉素(“Hygro”)。

所述载体可以是表达载体或系统，以通过常规技术和容易获得的起始原料生产蛋白质，包括整体通过引用并入的Sambrook等，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloningand Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor(1989)。在某些实施方式中，所述载体可以包含编码所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的核酸序列，包括SEQ IDNO：14的编码Cas融合蛋白的核酸序列和包含SEQ ID NO：2-5或其互补体中的至少一者的核酸序列的编码至少一种gRNA的核酸序列。

所述分离的多核苷酸或包含所述分离的多核苷酸的载体可以被引入到宿主细胞中。将核酸引入到宿主细胞中的方法在本领域中是已知的，并且可以使用任何已知方法将核酸(例如表达构建物)引入到细胞中。适合的方法包括例如病毒或噬菌体感染、转染、接合、原生质体融合、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、脂转染、电穿孔、核转染、免疫脂质体、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米粒子介导的核酸递送等。在某些实施方式中，所述组合物可以通过mRNA递送和核糖核蛋白(RNP)复合体递送来引入。

a.慢病毒载体

通过能够进行特定调控序列和表观遗传标记的直接操作，CRISPR/dCas9系统具有革新表观遗传学领域的潜力。所述技术为精细调节特定表观遗传标记和校正疾病相关的表达异常提供了前所未有的机遇。然而，为了实现有效的表观基因组靶向修饰，dCas9-效应物工具的稳定转导通常是必需的，特别是当应用于原代细胞或iPSC时。基于慢病毒载体(LV)的递送平台对于CRISPR/Cas9组分来说是可行且高效的，这是因为它们能够容纳大的DNA有效载荷并高效稳定地转导广泛的分裂和非分裂细胞。LV也表现出低细胞毒性和免疫原性，并对转导的细胞的生命周期具有极小影响。在本文中，采用优化的一体式慢病毒载体进行CRISPR/dCas9-DNMT3A组分的高效递送。使用这种LV系统，实现了hiPSC来源的多巴胺能神经元的高效转导，这引起SNCA内含子1中的CpG的甲基化状态的有效且靶向的修饰。

在某些实施方式中，所述载体可以是慢病毒载体。慢病毒载体这种体外稳定递送CRISPR/Cas9组分的常用方法的大包装容量，可以容纳4.2kb的酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9、表观遗传学调节物融合体、单个gRNA和表达所需的相关调控元件。在某些实施方式中，所述慢病毒载体可以包含编码所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的核酸序列，包括SEQ ID NO：14的编码所述Cas融合蛋白的核酸序列和包含SEQ ID NO：2-5或其互补体中的至少一者的核酸序列的编码所述至少一种gRNA的核酸序列。在某些实施方式中，所述慢病毒载体包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：39的多核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述慢病毒载体可以是修饰的慢病毒载体。例如，所述慢病毒载体可以被修饰以提高载体滴度。在某些实施方式中，所述病毒载体可以是游离型整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)。所述IDLV可以包含编码所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的核酸序列，包括SEQ ID NO：14的编码所述Cas融合蛋白的核酸序列和包含SEQ IDNO：2-5或其互补体中的至少一者的核酸序列的编码所述至少一种gRNA的核酸序列。

游离型整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)是在只需要转入基因的瞬时表达的情况下用于递送大的遗传运载物的理想平台。IDLV保留了～0.2％-0.5％(每200–500个转导的细胞一次整合事件)的残留(不依赖于整合酶和不正规的)整合率，这可以通过将新的3′多嘌呤序列(PPT)缺失的慢病毒载体包装到整合酶缺陷粒子中来进一步降低。尽管对于体外递送来说有效，但在某些情况下，由于担心插入诱变，慢病毒递送通常不适合体内基因调控。相反，IDLV与其他慢病毒载体相比可能表现出更低的诱导脱靶突变的能力。

在某些实施方式中，所述病毒载体可以包括游离型整合酶活性慢病毒载体(ICLV)。所述ICLV可以包含编码所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的核酸序列，包括SEQ ID NO：14的编码所述Cas融合蛋白的核酸序列和包含SEQ ID NO：2-5或其互补体中的至少一者的核酸序列的编码所述至少一种gRNA的核酸序列。

b.腺相关病毒载体

所述组合物也可以包括不同的病毒载体递送系统。在某些实施方式中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。所述AAV载体是属于细小病毒科依赖病毒属的小病毒，其感染人类和一些其他灵长类物种。使用各种不同的构建物配置，AAV载体可用于递送所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物。例如，AAV载体可以在分开的载体上或在同一载体上递送Cas融合蛋白和gRNA表达盒。或者，如果使用源自于例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的物种的小Cas9蛋白，则所述Cas融合蛋白和最多两个gRNA表达盒可以组合在单一AAV载体中的4.7kb包装极限内。

在某些实施方式中，所述AAV载体是修饰的AAV载体。例如，所述修饰的AAV载体可以是AAV-SASTG载体(Piacentino等，(2012)Human Gene Therapy 23:635–646)。所述修饰的AAV载体可以在体内将核酸酶递送到骨骼肌和心肌。所述修饰的AAV载体可以基于包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9在内的几种衣壳类型中的一者或多者。所述修饰的AAV载体可以基于具有可选的肌肉向性AAV衣壳的AAV2假型，例如AAV2/1、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAV2.5和AAV/SASTG载体，其通过全身和局部递送来高效转导骨骼肌或心肌(Seto等，Current Gene Therapy(2012)12:139-151)。所述修饰的AAV载体可以是AAV2i8G9(Shen等，J.Biol.Chem.(2013)288:28814-28823)。

4.药物组合物

本公开提供了包含所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、分离的多核苷酸、载体或宿主细胞的药物组合物。所述药物组合物可以包含约1ng至约10mg的用于SNCA基因的表观基因组修饰的编码所述组合物的DNA、多核苷酸、载体或宿主细胞。例如约1ng至约100ng、约10ng至约250ng、约50ng至约500ng、约100ng至约750ng、约500ng至约1mg、约750ng至约2mg、约1mg至约5mg、2mg至约6mg、约3mg至约7mg、约4mg至约8mg、约5mg至约10mg或其间的任何值。根据本发明所述的药物组合物根据待使用的给药方式来配制。在药物组合物是注射用药物组合物的情况下，它们是水性、除菌过滤和无热原的。优选使用等渗制剂。通常，用于等渗的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖和上述物质的任何组合。在某些情况下，等渗溶液例如磷酸盐缓冲盐水是优选的。在某些情况下，所述药物组合物还包含一种或多种稳定剂。稳定剂包括但不限于明胶和白蛋白。在某些实施方式中，向所述制剂添加血管收缩药剂。

所述含有DNA靶向系统的药物组合物还可以包含可药用赋形剂。所述可药用赋形剂可以是功能性分子例如介质、佐剂、载体(carrier)或稀释剂。给药方法决定待使用的载体的类型。可以使用任何适合于所需给药方法的可药用赋形剂。所述可药用赋形剂可以是转染促进剂。所述转染促进剂可以包括表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、包括单磷酰脂A在内的LPS类似物、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡例如如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。所述转染促进剂可以是聚阴离子，聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)，或脂质。所述转染促进剂可以是聚L-谷氨酸。所述聚L-谷氨酸可以以低于6mg/ml的浓度存在于所述药物组合物中。所述药物组合物可以包括转染促进剂例如脂质、脂质体、包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其他脂质体、作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。优选地，所述转染促进剂是聚阴离子，聚阳离子，包括聚L-谷氨酸(LGS)，或脂质。

5.调节SNCA基因表达的方法

本公开提供了体内调节SNCA基因的表达的方法。所述方法可以包括在细胞中体内调节SNCA基因的表达。所述方法可以包括在对象中体内调节SNCA基因的表达。所述方法可以包括向所述细胞或对象给药本文公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。所述方法可以包括向所述细胞或对象给药包含它们的药物组合物。

在某些实施方式中，本公开提供了一种在细胞或对象中体内调节SNCA基因的表达的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的下述组分相接触：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白或用于共表达双/多顺反子系统的任何其他方式(内部核糖体进入位点(IRES)、切割肽(p2A、t2A等)、不同启动子的利用等)的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性或其组合的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，其将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(b)(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。所述方法可以包括向所述细胞或对象给药(a)(ii)和(b)(ii)、(a)(i)和(b)(i)、(a)(i)和(b)(ii)或(a)(ii)和(b)(i)中的任一者。

在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物的给药可以引起所述细胞或对象中SNCA基因的表达降低。例如，所述方法可以引起与对照相比SNCA基因表达降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方式中，SNCA基因的表达可以被降低至少20％。在某些实施方式中，SNCA基因的表达可以被降低至少90％。所述方法可以将SNCA基因表达降低到对照中的生理水平。

在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物的给药可以引起所述细胞或对象中α-突触核蛋白的水平降低。例如，所述方法可以引起与对照相比α-突触核蛋白的水平降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方式中，α-突触核蛋白的水平可以被降低至少25％。在某些实施方式中，α-突触核蛋白的水平可以被降低至少36％。

在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物的给药可以引起所述细胞或对象中线粒体超氧化物生产的降低。例如，所述方法可以引起与对照相比线粒体超氧化物生产降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在某些实施方式中，线粒体超氧化物生产可以被降低至少25％。在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物的给药可以引起细胞存活率提高。例如，与对照相比细胞存活率可以提高至少1倍。例如，与对照相比细胞存活率可以提高至少1倍、至少1.2倍、至少1.4倍、至少1.6倍、至少1.8倍、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍或至少10倍。在某些实施方式中，与对照相比细胞存活率可以提高至少1.4倍。在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物的给药可以引起与对照相比线粒体超氧化物生产降低和/或细胞存活率提高。例如，线粒体超氧化物生产可以被降低至少25％和/或细胞存活率可以被提高至少1.4倍。在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物的给药可以逆转DNA损伤和/或挽救衰老相关的异常细胞核，例如提高细胞核圆度或减少折叠细胞核。

6.治疗疾病的方法

本公开提供了用于治疗与SNCA基因表达升高相关的疾病或障碍的方法。所述方法可以包括向所述对象给药本文公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。所述方法可以包括向细胞给药本文公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。所述细胞可以在对象中。在某些实施方式中，所述用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物的给药可以逆转DNA损伤和/或挽救衰老相关的异常细胞核，例如提高细胞核圆度或减少折叠细胞核，从而治疗和/或改善与SNCA基因表达升高相关的疾病或障碍的相关病症。

在某些实施方式中，本公开提供了一种在对象中治疗与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象或对象中的细胞给药足以调节所述基因的表达的量的下述组分：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性或其组合的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，其将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域。所述方法可以包括向所述对象或对象中的细胞给药(a)(ii)和(b)(ii)、(a)(i)和(b)(i)、(a)(i)和(b)(ii)或(a)(ii)和(b)(i)中的任一者。

所述疾病或障碍可以是神经变性障碍。在某些实施方式中，所述神经变性障碍是SNCA相关疾病或障碍。SNCA相关疾病或障碍可以是与没有所述SNCA相关疾病或障碍的对照对象相比以SNCA基因的异常表达为特征的疾病或障碍。在某些实施方式中，所述SNCA相关疾病或障碍以与对照相比SNCA基因的表达提高为特征。在其他实施方式中，所述SNCA相关疾病或障碍以与对照相比SNCA基因的表达降低为特征。在某些实施方式中，所述SNCA相关疾病或障碍是神经变性障碍。所述神经变性障碍可以是突触核蛋白病。突触核蛋白病是以α-突触核蛋白聚集体的异常积累为特征的神经变性疾病。聚集体的积累可以发生在神经元、神经纤维或神经胶质细胞中。突触核蛋白病包括帕金森氏病、路易体痴呆和多系统萎缩症。例如，所述神经变性障碍可以是帕金森氏病。作为另一个实例，所述神经变性障碍可以是路易体痴呆。

7.递送方法

本文提供了一种将本文公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物递送到细胞的方法。细胞可以用本文中描述的核酸组合物转染。所述核酸组合物可以通过电穿孔来递送。细胞可以例如通过电穿孔来转染。所递送的核酸分子可以在所述细胞中表达，其中所得到的蛋白质被递送到所述细胞的表面。电穿孔方法可以使用BioRad Gene PulserXcell或Amaxa Nucleofector IIb装置。可以使用几种不同的缓冲液，包括BioRad电穿孔溶液、Sigma磷酸盐缓冲盐水产品号D8537(PBS)、Invitrogen OptiMEM I(OM)或AmaxaNucleofector溶液V(N.V.)。转染可以包括转染试剂例如阳离子型转染试剂。阳离子型转染试剂包括但不限于siLentifect

在将本文公开的遗传构建物或组合物递送到组织后，并且在所述载体进入哺乳动物的细胞后，被转染的细胞将表达所述gRNA分子和Cas融合蛋白分子。可以将所述遗传构建物或组合物给药到哺乳动物以改变基因表达或重新工程化改造或改变基因组。所述哺乳动物可以是人类、非人类灵长动物、奶牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛、鹿、刺猬、象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠或鸡，并且优选为人类、奶牛、猪或鸡。

编码所述gRNA分子和Cas融合蛋白分子的遗传构建物(例如载体)可以通过伴有和不伴有体内电穿孔的DNA注射(也被称为DNA疫苗接种)、脂质体介导的、纳米粒子促进的和/或重组载体而递送到哺乳动物。所述重组载体可以通过任何病毒方式来递送。所述病毒方式可以是重组慢病毒、重组腺病毒和/或重组腺相关病毒。本文公开的遗传构建物(例如载体)或包含它们的组合物可以被引入到细胞中用于表观基因组修饰。

8.给药途径

本文公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物可以通过任何适合的途径给药到所述对象或对象中的细胞。例如，所述公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物可以通过包括口服、肠胃外、舌下、透皮、直肠、透粘膜、局部、通过吸入、通过颊给药、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内、关节内或其组合在内的不同途径给药到对象或对象中的细胞。在某些实施方式中，本文公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物被肌肉内、静脉内或其组合给药到对象。在某些实施方式中，所述公开的用于表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物被直接给药到所述对象的中枢神经系统。例如，直接给药到所述对象的中枢神经系统可以包括颅内或脑室内注射。对于兽医用途来说，本文公开的遗传构建物(例如载体)或组合物可以根据正常的兽医实践作为适合的可接受的制剂给药。兽医可以容易地确定最适合于特定动物的给药方案和给药途径。所述组合物可以通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其他物理方法例如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来给药。

本文公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物可以通过几种技术递送到哺乳动物，所述技术包括伴有和不伴有体内电穿孔的DNA注射(也被称为DNA疫苗接种)、脂质体介导的、纳米粒子促进的和/或重组载体例如重组慢病毒、重组腺病毒和重组腺相关病毒。所述组合物可以被注射到骨骼肌或心肌中。

9.细胞类型

任何这些递送方法和/或给药途径可以与众多细胞类型一起使用，例如包括但不限于真核细胞或原核细胞。在某些实施方式中，所述真核细胞可以是来自于任何真核生物体的任何真核细胞。真核生物体的非限制性实例包括哺乳动物、昆虫、两栖动物、爬行动物、鸟类、鱼类、真菌、植物和/或线虫类。在某些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，所述细胞是人类细胞。在某些实施方式中，所述细胞是神经元细胞。例如，所述细胞可以是中脑多巴胺能神经元(mDA)。所述细胞可以是基底前脑胆碱能神经元(BFCN)。在其他实施方式中，所述细胞可以是神经祖细胞。例如，所述细胞可以是多巴胺能(中脑腹侧)神经祖细胞(MD NPC)。所述细胞可以在所述SNCA基因中包含突变。例如，所述细胞可以在所述SNCA基因中包含引起所述细胞或对象中SNCA基因表达提高的突变。在某些实施方式中，所述细胞可以包含SNCA基因三重重复(SNCA-Tri)，其中SNCA水平与不具有SNCA-Tri的对照细胞中的生理水平相比升高。所述细胞可以是人类诱导多能干细胞(hiPSC)。例如，所述细胞可以是源自于患有疾病或障碍的患者的hiPSC。例如，所述细胞可以是源自于被诊断为帕金森氏病或具有发生帕金森氏病风险的患者的hiPSC。所述细胞可以是源自于被诊断为路易体痴呆或具有发生路易体痴呆风险的患者的hiPSC。

10.试剂盒

本文中提供了可用于SNCA基因的表观基因组修饰的试剂盒。所述试剂盒可以包含所述公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体或药物组合物。所述试剂盒可以包含使用所述公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物、多核苷酸、载体或药物组合物的使用说明。包含在试剂盒中的使用说明可以附贴于包装材料，或者可以作为包装插页被包含。尽管所述使用说明通常是书写或打印的材料，但它们不限于此。本公开设想了能够储存这些使用说明并将它们传播到最终用户的任何媒介。此类媒介包括但不限于电子存储媒介(例如磁盘、磁带、卡盒、芯片)、光学媒介(例如CD ROM)等。当在本文中使用时，术语“使用说明”可以包括提供所述使用说明的因特网站点的地址。

11.实施例

对本领域技术人员来说显而易见的是，本文描述的本公开的方法的其他适合的修改和改编可以被容易地应用和认识到，并且可以使用适合的等效物做出而不背离本公开的范围或本文公开的方面和实施方式。尽管现在已详细描述了本公开，但通过参考下面的实施例可以更清楚地理解它，所述实施例仅打算用于说明本公开的某些方面和实施方式，并且不应被视为对本公开范围的限制。本文中提到的所有杂志参考文献、美国专利和出版物的公开内容整体通过引用并入本文。

本发明具有由下述非限制性实施例说明的方面。

实施例1

材料和方法

质粒设计和构建。dCas9-DNMT3A转入基因源自于pdCas9-DNMT3A-EGFP(Addgene质粒号71666)，并如下克隆到pBK301(生产优化的慢病毒载体)中：通过将用AgeI-BamHI限制性酶消化的dCas9片段克隆到pBK301中，产生了pBK456质粒。接下来，通过使用含有BamHI限制性位点的引物从质粒扩增DNMT3A片段，将DNMT3A催化结构域从pdCas9-DNMT3A-EGFP转移到pBK456中：BamHI-429/R 5’-GAGCGGATCCCCCTCCCG-3’(SEQ ID NO：15)，BamHI-429/L 5’-CTCTCCACTGCCGGATCCGG-3’(SEQ ID NO：16)。然后将所述pBK456用BamHI限制性酶消化以备克隆，产生pBK492质粒(无gRNA质粒)。接下来，通过定点诱变将位于所述DNMT3A片段中的额外BsmBI位点消除，以产生pBK546(SEQ ID NO：39；参见图12B)。这个质粒包含从EFS-NC启动子表达的dCas9-DNMT3A-p2a-嘌呤霉素和位于U6启动子下游的gRNA克隆位点(BsmBI-BsrGI-BsmBI)。使用了靶向内含子1-SNCA基因的四个gRNA序列：1)5’-TTGTCCCTTTGGGGAGCCTA-3’(SEQ ID NO：2)；2)5’-AATAATGAAATGGAAGTGCA-3’(SEQ ID NO：3)；3)5’-GGAGGCTGAGAACGCCCCCT-3’(SEQ ID NO：4)；4)5’-CTGCTCAGGGTAGATAGCTG-3’(SEQID NO：5)。所述含有gRNA的质粒分别被命名为pBK497/gRNA1、pBK498/gRNA2、pBK499/gRNA3、pBK500/gRNA4(SEQ ID NO：38；参见图11)。所有质粒通过限制性消化分析和桑格测序来验证。用于所述gRNA序列的靶序列示出在表1中。

表1

产生了下述质粒以靶向大鼠/小鼠Snca-内含子1序列。产生了pBK539以用GFP标志物代替嘌呤霉素。所述代替对于转入基因表达的体内评估来说是必需的。如下所述产生了PBK539(SEQ ID NO：40；参见图10A)：通过用FseI限制性酶消化从pBK201a(pLV-GFP)产生GFP片段。将所述片段凝胶纯化并克隆到用FseI消化的pBK546载体中。得到的质粒pBK539带有dCas9-DNMT3A-p2a-GFP转入基因。该母体质粒被进一步用于产生pBK744(SEQ ID NO：41；参见图10B)。为此目的，将所述质粒用BsmBI消化并与带有下述序列的gRNA一起克隆：5’-TTTTTCAAGCGGAAACGCTA-3’(SEQ ID NO：42)。

载体产生。慢病毒载体使用瞬时转染方案来产生。将15μg载体质粒、10μg psPAX2包装质粒(Addgene,#12260，在Dr.Didier Trono的实验室产生，EPFL,Switzerland)、5μgpMD2.G包膜质粒(Addgene#12259，在Dr.Trono的实验室产生)和2.5μg pRSV-Rev质粒(Addgene#12253，在Dr.Trono的实验室产生)转染到293T细胞中。在转染后72h，从过滤的调制培养基收集载体粒子。所述粒子使用蔗糖梯度方法来纯化并通过超速离心(2h，20,000rpm)浓缩>250倍。将载体和病毒储用物分成等分试样并储存在-80℃。

对载体制备物进行滴定。通过对嘌呤霉素抗性集落进行计数并通过p24

细胞培养、神经祖细胞分化和表征。来自于具有SNCA基因的三重重复(SNCA-Tri，ND34391)的患者的人类诱导多能干细胞(hiPSC)系购自NINDS人类细胞和数据存储库(NINDS Human Cell and Data Repository)。所述ND34391细胞系显示出正常核型。所述hiPSC在符合hESC要求的基质胶包被的板上，在mTeSR

多巴胺能神经元是在PD中受影响的原代神经元类型，因此使用特定方案将所述hiPSC分化成多巴胺能(中脑腹侧)神经祖细胞(MD NPC)。使用基于拟胚体的方案将所述hiPSC分化成MD NPC。将hiPSC用细胞消化液(Accutase)(StemCell Technologies)解离并接种在Aggrewell 800板(每个微孔10,000个细胞；Stem Cell Technologies)中的增补有Y27632(10μM)的神经元诱导培养基(NIM-Stem Cell Technologies)中，以形成拟胚体(EB)。在第5天，将EB在基质胶包被的板上重新铺板在NIM中。在第6天，向NIM增补200ng/mLSHH(Peprotech)，导致神经玫瑰花结的形成。在第12天，使用神经玫瑰花结选择试剂(按照制造商的说明书使用；StemCell Technologies)选择神经玫瑰花结，并在基质胶包被的板中重新铺板在增补有3μM CHIR99021、2μM SB431542、5μg/ml BSA、20ng/ml bFGF和20ng/mlEGF的N2B27培养基中，导致MD NPC的形成。MD NPC每两天使用细胞消化液(Accutase)(StemCell Technologies)进行传代。成功的分化通过实时PCR和免疫细胞化学，分别使用列于表2和3中的MD NPC特异性标志物来评估。

将稳定转导的带有不同gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的MD NPC细胞系每5天分拆一次，并在基质胶包被的板上在嘌呤霉素选择培养基中培养。在培养7-14天后进行分子和细胞表征。

表2用于hiPSC来源的MD NPC细胞的表征和SNCA-mRNA定量的TaqMan测定法

表3用于通过免疫细胞化学对hiPSC来源的MD NPC细胞进行表征的第一抗体

转导和嘌呤霉素选择。将MD NPC用LV/gRNA-dCas9-DNMT3A载体以感染复数(MOI)＝2进行转导。转导后16小时更换培养基，并在转导后48小时以1ug/mL的终浓度施加嘌呤霉素。将细胞在嘌呤霉素选择培养基上维持21天，以获得带有每个所述不同LV/dCas9-DNMT3A载体的5个稳定的MD NPC细胞系。

DNA提取、亚硫酸氢盐转化和焦磷酸测序。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)，按照制造商的说明书从每个稳定转导的细胞系提取gDNA。使用Zymo EZ DNAMethylation

表4用于评估SNCA内含子1处的23个CpG的甲基化水平的焦磷酸测序测定法

列出了用于扩增和测序的引物

*指示生物素标记的引物。

RNA提取和表达分析。按照制造商的方案，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从每个稳定转导的MD NPC细胞系提取总RNA，然后使用RNeasy试剂盒(Qiagen)纯化。RNA浓度通过分光光度法在260nm处确定，所述纯化的质量通过260nm/280nm比率来确定，所述比率显示出1.9至2.1之间的值，指示高的RNA质量。cDNA使用MultiScribe RT酶(AppliedBiosystems)，使用下述条件来合成：25℃10min和37℃120min。

使用实时PCR来定量MD NPC标志物的水平和SNCA表达水平。简单来说，使用TaqMan表达测定法和ABI QuantStudio 7通过相对定量实时PCR测定每个样品的两个平行样。所使用的ABI MGB探针和引物组测定法(Applied Biosystems)列于表2中。使用TaqManUniversal PCR主混合物试剂(Applied Biosystems)和下述条件，将每种cDNA(20ng)在两个独立实验的各至少两次独立运行中进行一式两份扩增(总共≥8次重复)：50℃2min；95℃10min；95℃15sec和60℃1min的40个循环。作为所述扩增的特异性的阴性对照，我们在每块板中使用未转变成cDNA的RNA对照样品(无RT)和无cDNA/RNA样品(无模板)。在对照反应中没有检测到扩增产物。数据使用设定在扩增的线性范围中的阈值来分析。然后使用任何特定样品跨过该阈值时的循环数(Ct)来确定倍数差异，而两个对照基因的几何平均值充当用于归一化的参比。倍数差异被计算为2

免疫细胞化学和成像。在免疫染色之前，将MD NPC铺于基质胶包被的细胞成像盖玻片(Eppendorf，0030742060)上。将MD NPC在4％聚甲醛中固定并在0.1％Triton-X100中通透化。免疫细胞化学如下所述进行：将细胞在5％山羊血清中阻断1小时，然后与第一抗体在4℃温育过夜(表3)。与第二抗体(AlexaFluor,Life Technologies)在室温温育1小时。细胞核按照制造商的说明书用Nuc

Western印迹分析。人类α-突触核蛋白在稳定转导的MD NPC细胞系中的表达水平通过Western印迹分析，使用α-突触核蛋白兔单克隆抗体(ab138501，Abcam)来确定，并使用mAbβ-肌动蛋白(Transduction Labs)进行归一化。将细胞从培养皿刮下，并在10倍体积的50mM Tris–HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1％Nonidet P-40中，在蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,MO)存在下匀浆。将样品超声处理3次，每个循环15sec。总蛋白浓度通过DC蛋白质测定法(Bio-Rad,Hercules,CA)来确定，并将50μg的每种样品在4-20％Tris–甘氨酸SDS–PAGE凝胶上运行。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并将印迹用含有5％奶粉的PBSTween 20阻断。与第一抗体在4℃温育过夜。第二抗体是山羊抗兔抗体770和山羊抗小鼠抗体680(1:10000，Biotium)。将荧光免疫反应性在LI-COR Odyssey上成像并使用ImageStudio Lite软件定量。将α-突触核蛋白表达归一化到同一条道中的β-肌动蛋白表达。所述实验重复两次，并代表了两个独立的生物平行样。

线粒体超氧化物和细胞存活率测定法。将MD NPC在黑色96孔板(Greiner)中以3.5x10

使用C12刃天青测定法来测量细胞存活率。简单来说，如上所述制备细胞，然后加入不含酚红的高葡萄糖培养基中的3μM C-12刃天青(Ex./Em：563/587nm)(LifeTechnologies)，在暗处和37℃下温育30min。将细胞用含有1μM Hoechst 33342的培养基清洗两次。将C12-刃天青荧光强度归一化到Hoechst荧光。对于每种MD NPC转导细胞系来说，每个实验在6个技术平行样中进行，并且每个实验重复两次并代表两个独立的生物平行样。

全局DNA甲基化。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从每种稳定转导的MDNPC细胞系提取DNA。全局DNA甲基化使用可商购的基于5-甲基胞嘧啶(5-mC)的免疫测定法平台(MethylFlash

5-mC的百分率使用两个独立实验中的各两个平行样来确定。

统计学分析。所述MD NPC稳定细胞系之间和不同条件之间的差异的显著性使用下述成对比较检验(GraphPad Prism7)进行统计学分析：(i)两组比较使用Student’s t检验；(ii)多重比较使用Dunnett’s方法。

实施例2

用于基于CRISPR/Cas9的表观遗传学工具的高效递送的新型慢病毒载体系统的开发

用于递送基于CRISPR/Cas9的材料的一体式整合型慢病毒载体系统的一个缺点是低生产滴度。克服这些问题的方法包括开发将所述Cas9和gRNA组分分开递送的二元质粒载体系统。这种方法具有提高的产量，但不适合于包括体内筛选和疾病建模在内的基因编辑应用。最近开发的第二代一体式载体与第一代系统相比显示出生产滴度和转导效率的提高，但它们与传统载体相比产量仍低约25倍。通过单一载体同时递送Cas9和sgRNA的能力使得能够轻松鲁棒地进行体内基因编辑，这对于开发可翻译的基因疗法产物来说特别有利。本公开通过在LV表达盒中包含Sp1转录因子结合位点(在人类U6(hU6)启动子上游)和现有技术的从5’U3消除了TATA盒的U3’缺失，涉及一种慢病毒载体介导的CRISPR/Cas9基因转移的有效手段(图1B)。这个新的系统可以被高效包装在整合酶活性慢病毒粒子(ICLV)和整合酶缺陷慢病毒粒子(IDLV)中。此外，所述系统能够在人胚胎肾.(HEK293T)细胞和有丝分裂后的脑神经元中体内介导快速且鲁棒的基因编辑。

为了进一步开发用于基于表观遗传学的基因编辑扰动的慢病毒载体系统，对所述骨架进行了进一步修饰，在其中整合了dCas9-DNMT3A转入基因并产生ICLV-dCas9-DNMT3A-嘌呤霉素/GFP和IDLV-dCas9-DNMT3A-嘌呤霉素/GFP载体(对于IDLV载体来说，在Int基因的催化结构域中引入了点突变(D64E)(图1B))。使用p24gag ELISA测定法测量了所得到的载体的生产滴度。发现ICLV-dCas9-DNMT3A和IDLV-dCas9-DNMT3A两者的滴度在1-2x10

实施例3

结果-使用一体式慢病毒载体-dCas9-DNMT3A系统进行的SNCA-内含子1的靶向甲基化

SNCA内含子1含有一个包含23个CpG的CpG岛(CGI)区域[Chr4：89,836,150-89,836,593(GRCh38/hg38)](图1A)，其中甲基化状态随着SNCA表达的提高而改变。此外，在疾病状态下SNCA内含子1子区域可能被差异甲基化。内含子1的这个子区域中的CpG位点可以作为与SNCA转录的精细调控相关的表观遗传学操作的候选靶点，而这些CpG位点中DNA甲基化的增强可能允许SNCA表达的严格下调和PD相关表型的逆转。为了评估这个假设，使用生产和表达优化的骨架构建了一体式gRNA-dCas9-DNMT3A慢病毒载体，所述骨架含有在人类U6(hU6)启动子上游的转录因子Sp1结合位点的重复序列和现有技术的U3’区域内3’长末端重复序列(LTR)的缺失(图1B)。这种骨架载体高效递送和表达CRISPR/Cas9组分。在所述骨架中克隆了在gRNA表达盒下游表达的dCas9-DNMT3A蛋白的融合版本(图1B)。靶向SNCA内含子中的不同CpG的四个gRNA被设计并克隆在母体载体1中(图1A)。

具有SNCA基因座的三重重复的患者显示出SNCA-mRNA表达水平的组成性加倍表达并表现出PD的早期发作。因此，SNCA-Tri细胞系代表了在SNCA过表达的背景中研究PD的适当的模型。为了测试正如在图1C中提出的内含子1内的CpG岛中的DNA甲基化的增强是否将下调SNCA基因表达，将gRNA-dCas9-DNMT3A表达盒包装到慢病毒载体中，并将得到的粒子转导到源自于具有SNCA三重重复(SNCA-Tri)的患者的hiPSC细胞系中，所述细胞系分化成多巴胺能祖细胞神经元(MD NPC)这种在PD中受影响的主要神经元类型。为了再次验证神经元类型和分化阶段，将稳定转导的hiPSC来源的MD NPC细胞系通过免疫荧光和实时RT-PCR，使用MD NPC的特异性标志物巢蛋白和叉头盒蛋白A2(FOXA2)进行表征(图2)。

接下来，对于5个稳定转导的hiPSC来源的MD NPC细胞系中的每一者，定量确定了SNCA内含子1中的23个CpG中的每一者的甲基化百分率。图3和表5呈现了对于稳定携带gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的每个hiPSC来源的MD NPC细胞系来说，各个CpG位点处的甲基化％，并表明相对于对照MD NPC无gRNA细胞系，甲基化％显著提高。与带有dCas9-DNMT3A的无gRNA转入基因的细胞系相比，每个gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因引起SNCA内含子1中几个CpG的甲基化的显著提高。值得注意的是，尽管某些显著超甲基化的CpG为特定MD NPC细胞系独有(gRNA2 CpG 9；gRNA3 CpG 19；gRNA4 CpG 6和7)，但几个CpG在多个gRNA转入基因细胞系中被修饰(gRNA 1和4>CpG 1、3；所有gRNA>CpG 8；gRNA 1、3和4>CpG 18、20-22)(图3，表5)。

表5稳定携带不同gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的hiPSC来源的MD NPC细胞系中的23个CpG位点中的每一者处甲基化％

实施例4

SNCA-mRNA和蛋白质水平的下调

以前的报告显示，内含子1甲基化的变化调控SNCA转录。本实施例使用带有dCas9-DNMT3A gRNA的hiPSC来源的MD NPC细胞系测试了SNCA-内含子1的DNA甲基化编辑是否可以降低SNCA-mRNA和α-突触核蛋白的内源表达水平。

首先，测量了用每种gRNA-dCas9-DNMT3A载体转导的hiPSC来源的MD NPC中的SNCA-mRNA表达水平。与为带有dCas9-DNMT3A的无gRNA对应物的对照MD NPC细胞系所观察到的相比，带有gRNA4-dCas9-DNMT3A转入基因的MD NPC细胞系中SNCA-mRNA的表达水平显著更低，相当于降低～30％(p＝0.006；Student’s t检验)(图4A)。与无gRNA转入基因的MDNPC相比，带有含gRNA3的转入基因的MD NPC也显示出SNCA-mRNA水平的降低，然而，这种降低更加微妙并且未达到统计学显著性(降低17％，p＝0.06；Student’s t检验)。在带有含gRNA1或gRNA2的转入基因的MD NPC细胞系中没有观察到对SNCA-mRNA表达的显著影响(分别为p＝0.2286和p＝0.5248)，表明在这些细胞系中修饰的CpG和/或甲基化率的变化程度不足以驱动转录本表达的改变。所有MD NPC细胞系的DNA甲基化剖析和SNCA-mRNA表达的变化的整体结果，为SNCA内含子1中与SNCA基因的转录调控相关的CpG位点提供了线索。因此，CpG位点6、7是用于甲基化操作以使SNCA表达水平正常化的强大候选靶点。

接下来，在用gRNA4-dCas9-DNMT3A载体稳定转导的MD NPC细胞系中评估了所述系统对α-突触核蛋白表达水平的影响。与SNCA-mRNA结果相符，与不带有gRNA转入基因的对照MD NPC细胞系相比，内源α-突触核蛋白的蛋白质丰度降低接近25％(p＝0.0055；Student’st检验)(图4B)。使用对SNCA和MD NPC标志物巢蛋白的双重染色，通过免疫荧光对MD NPC的“纯”群体中的α-突触核蛋白水平进行了进一步确认。双重染色细胞的分析证实了与对照无gRNA细胞系相比，gRNA4 MD NPC细胞系中的内源α-突触核蛋白水平降低，相当于低～36％的水平(p<0.0001；Student’s t检验)(图4C-G)。值得注意的是，MD NPC的成功分化率为～80％，这可以解释通过双重免疫荧光方法观察到的对α-突触核蛋白水平的更大影响，因为它与包含全细胞培养物的western印迹和实时PCR分析相比将分析仅仅局限于分化的神经元(图7)。

合在一起，这些一致的数据表明由含有gRNA4的dCas9-DNMT3A转入基因赋予的内含子1的超甲基化足以显著改变内源SNCA-mRNA表达和α-突触核蛋白水平(分别为p＝0.006和0.0055)，导致与不带有gRNA转入基因的对照细胞相比甲基化水平的提高和相对更低的SNCA-mRNA和蛋白质丰度(图4)。

实施例5

SNCA-Tri细胞表型的挽救

PD以黑质和别处的神经元丧失和神经元细胞培养物中诱导凋亡性细胞死亡的SNCA的过表达为特征。此外，通过较高的线粒体活性氧类(ROS)的产生度量的线粒体功能障碍已与PD相关联。与其相一致，SNCA-Tri hiPSC来源的神经元在暴露于环境线粒体复合体I毒素鱼藤酮之下时显示出存活率降低和线粒体相关的超氧化物生产提高。由内含子1超甲基化介导的α-突触核蛋白水平降低对所述SNCA-Tri hiPSC来源的NPC特有的细胞表型即线粒体超氧化物生产和细胞存活率的影响，通过将带有含gRNA4的转入基因的MD NPC细胞系与无gRNA转入基因对照进行比较来确定。表达含有gRNA4的表达盒的MD NPC改善了线粒体相关的超氧化物生产的提高(2.5相比于3.3，p＝0.0016；Student’s t检验)(图5A)并表现出细胞存活率提高(1.7相比于1.2，p＝0.0492；Student’s t检验)(图5B)。同样地，在暴露于鱼藤酮(20μM，18hrs)之下，与对照无gRNA对应物相比，在用gRNA4-Cas9-DNMT3A载体转导的MD NPC中线粒体相关的超氧化物生产显著更低(3.6相比于5.4，p＝0.0462；Student’s t检验)(图5A)，并且存活率显著更高(2.3相比于1.1，p＝0.0365；Student’s t检验)(图5B)。总的来说，在表达gRNA4的细胞系中，α-突触核蛋白降低对线粒体相关的超氧化物生产和细胞存活率的影响在所述细胞用鱼藤酮激惹时更加显著(超氧化物生产减少25％相比于在鱼藤酮暴露后的33％，存活率提高1.4倍相比于使用鱼藤酮时的2倍)。这些结果表明具有gRNA4的MD NPC细胞系与无gRNA对照细胞相比对胁迫条件的抗性更高。此外，与鱼藤酮对带有无gRNA载体的对照MD NPC的影响相比，gRNA4 MD NPC细胞系对鱼藤酮表现出更低的易损性，正如通过线粒体相关的超氧化物生产分别提高63％相比于44％所度量的(图5)。合在一起，所述结果证实超甲基化介导的SNCA-mRNA减少伴有较低的α-突触核蛋白水平，挽救了SNCA-Tri hiPSC来源的神经元的表型扰动。

实施例6

gRNA4-dCas9-DNMT3A转入基因对全局甲基化的极小影响

上述实施例证实了gRNA4-dCas9-DNMT3A转入基因介导整个SNCA内含子1中鲁棒且持续的甲基化，足以逆转疾病相关的细胞表型的能力。接下来评估所述系统的靶特异性。为此目的，使用基于ELISA的免疫测定法，通过测量带有gRNA4和无gRNA的稳定转导的hiPSC来源的MD NCP样品的5-甲基胞嘧啶(5-mC％)(40)的百分率定量了全局DNA甲基化，并与未转导的SNCA-Tri MD NPC细胞系进行比较(图6)。组成性表达gRNA4-dCas9-DNMT3A转入基因的hiPSC来源的MD NPC细胞系与原始SNCA-Tri MD NPC细胞系相比未显示出5-mC％的显著变化，分别为0.53％相比于0.37％(p＝0.97)(图6)。另一方面，SNCA-Tri/无gRNA dCas9-DNMT3A细胞系表现出全局DNA甲基化的显著增加(5-mC％0.37％相比于1.51％，p＝0.009)(图6)。在带有gRNA4-dCas9-DNMT3A转入基因的细胞系中观察到的稳定全局DNA甲基化表明DNA甲基化的脱靶极少。因此，支持了所述系统特异性靶向SNCA内含子1中的CpG岛区域的甲基化的有效性和安全性。相反，不含gRNA的转入基因不维持DNA甲基化的靶特异性修饰并导致全局甲基化提高。

实施例7

讨论

人类诱导多能干细胞(hiPSC)来源的神经元系统是对包括PD在内的人类神经变性疾病的各个方面更准确地建模的一种有力工具。它代表了用于更好地理解隐含在神经疾病之下的分子机制和用于定义细胞疾病过程的有价值的体外系统，并且也用于高效药物筛选。源自于具有SNCA基因的基因组三重重复(SNCA-Tri)的PD患者的hiPSC的出现，为开发靶向SNCA表达水平的新的治疗途径提供了独一无二且有价值的工具。在本文中，这种模型系统作为策略被用于评估表观基因组编辑，用于将SNCA严格下调回到维持神经元功能所需的正常生理水平。

在本文中，使用了表达靶向SNCA内含子1中的CpG岛不同区域的四个gRNA的一体式慢病毒载体。每个所述gRNA载体的转导引起SNCA内含子1中多个CpG的DNA甲基化增强。然而，只有一个gRNA，即位于CpG岛区域的3’处的gRNA4，引起SNCA-mRNA水平的阻遏。值得注意的是，每个gRNA载体引起整个人类SNCA内含子1中DNA甲基化分布情况的特异性修饰。23个位点中特定CpG位点的显著变化与其他位点相比可能更有效地影响转录效率。因此，这些特定CpG位点的超甲基化可能参与将甲基化编辑转变成转录失活。基于本文中呈现的合并的结果，CpG位点6和7可能是用于制药性甲基化编辑以执行严格调控，用于实现归一化的SNCA表达水平的强有力靶点。

在由SNCA失调引起的PD中，准确和高效靶向是基因疗法的最终目标，并且表观基因组编辑是进行治疗性干预的有吸引力的策略。本工作的结果解决了在治疗性药物的开发中必不可少的关键障碍，因为开发以受控方式降低SNCA过表达的新策略是重要的。

实施例8

在大鼠细胞系中SNCA表达的下调

大鼠F98细胞系中的SNCA-mRNA用带有gRNA-dCas9-DNMT3A转入基因的慢病毒载体转导。在转导后14天使用定量实时RT-PCR评估SNCA-mRNA的水平。图8示出了不同细胞系中的SNCA-mRNA水平(设计并使用了四种不同的gRNA，条1-4)，它们通过基于Cyber green的基因表达测定法测量，并使用2

实施例9

IDLV的使用

游离型整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)是在只需要转入基因的瞬时表达的情况下用于递送大的遗传运载物的理想平台。IDLV保留了～0.2％–0.5％(每200–500个转导的细胞一次整合事件)的残留(不依赖于整合酶和不正规的)整合率，这可以通过将新的3′多嘌呤序列(PPT)缺失的慢病毒载体包装在整合酶缺陷粒子中来进一步降低。IDLV用于遗传疾病的精确体内分析在研究人员中获得了显著兴趣，因为它们显著降低了整合型递送平台固有的插入突变的风险。通过单一载体同时递送Cas9和sgRNA的能力使得能够轻松鲁棒地进行体内基因编辑，这对于开发可翻译的基因疗法产物来说特别有利。然而，许多病毒载体平台，特别是那些旨在用于临床应用的病毒载体平台，不完全适合于运载尺寸过大的CRISPR/Cas9系统。此外，这些载体的生产和表达效率低。为了解决这些缺点，开发了用于体外和体内高效基因编辑的一体式IDLV-CRISPR/Cas9系统。这些载体允许在HEK293T细胞和有丝分裂后的脑神经元中体内进行高效、快速且可持续的CRISPR/Cas9介导的基因编辑。此外，所述IDLV-CRISPR/Cas9系统被瞬时表达，并且与其整合型对应物相比具有显著更低的诱导脱靶突变的能力。合在一起，IDLV是用于可编程核酸酶的体内递送的鲁棒、有效且安全的手段，与其他递送平台相比具有显著优势。

在这里，将所述载体表达盒进一步修饰以建立新的表观遗传学编辑手段。所述新的IDLV载体带有一体式gRNA/CRISPR/dCas9-DNMT3A转入基因，用于高效且特异性靶向源自于带有SNCA基因座的三重重复的人类诱导多能干细胞(hiPSC)的神经祖细胞(NPC)的SNCA内含子1区域中的超甲基化CpG岛中的DNA甲基化。在转导后7天使用定量实时RT-PCR评估SNCA-mRNA的水平。在不同细胞系中SNCA-mRNA的水平通过基于TaqMan的基因表达测定法测量，并使用2

实施例10

衰老表型的挽救

细胞核折叠通过如下所述的免疫细胞化学，使用核纤层蛋白A/C标志物(核纤层蛋白A/C抗体：Ab108595，Abcam)来分析，并且折叠的核膜形状被认为是异常的。对于两个独立实验来说，每种染色分析>100个细胞(参见图18A-18C)。

免疫细胞化学：在免疫染色之前，将细胞铺于PLO/层粘连蛋白包被的细胞成像盖玻片(Eppendorf，0030742060)上。将细胞在4％聚甲醛中固定，并在0.1％Triton-X100中通透化。免疫细胞化学如下所述来进行：将细胞在5％山羊血清中阻断1小时，然后与第一抗体在4℃温育过夜。与第二抗体(Alexa fluor，Life Technologies)在室温温育1小时。细胞核用Nuc

所公开的实施例证实了SNCA上调(表达提高)对多种衰老相关标志物的影响。总的来说，SNCA增加加剧神经元核衰老，并且在青少年阶段就已显示出衰老特征。

核纤层蛋白参与核膜的结构完整性，并且已将核膜完整性的丧失与衰老相关联。核膜完整性使用标志物核纤层蛋白A/C

由内含子1超甲基化介导的α-突触核蛋白水平的降低对SNCA-Tri hiPSC来源的NPC的衰老特有的细胞表型特征即细胞核折叠/细胞核圆度的影响，通过将带有含gRNA4的转入基因的MD NPC细胞系与无gRNA转入基因对照进行比较来确定。表达含有gRNA4的表达盒的MD NPC逆转了异常细胞核的增加，证实了衰老相关表型的挽救(图17-18)。

这些结果扩展了超甲基化介导的SNCA-mRNA的降低和相伴的较低α-突触核蛋白水平对逆转与衰老相关的表型扰动的作用。

实施例11

基于CRISPR的基于表观基因组修饰剂的系统的用途

为了进一步了解在突触核蛋白病中通常被扰乱的遗传病因和分子机制以及可能导致该组中不同疾病之间的异质性的遗传病因和分子机制，深度表征源自于患者和衰老背景下的健康对象的不同病理相关神经元的等基因hiPSC来源的模型是非常重要的。从获自老年供体的成纤维细胞重编程的hiPSC的特征在于与胚胎干细胞更为相似的多种分子和细胞特点，例如端粒尺寸、氧化损伤、线粒体代谢、转录组和表观遗传学特征。因此，存在着hiPSC来源的模型不完全适合于研究衰老相关病症的担忧。

为了解决这些问题，开发了一种在hiPSS来源的神经元中诱导衰老的优化且可选的新方法。来自于表观健康个体和具有SNCA基因的三重重复(SNCA670)的患者的人类诱导多能干细胞(hiPSC)分别购自Coriell细胞储存库和NINDS人类细胞和数据储存库。GM23280和ND34391细胞系具有正常核型。hiPSC在符合hESC要求的基质胶包被的板上，在mTeSRTM1培养基中在无饲养细胞条件下培养。使用温和细胞解离试剂(StemCell Technologies)，按照制造商的手册将细胞传代。多巴胺能神经元(mDA)源自于中脑腹侧(MD)，而基底前脑胆碱能神经元(BFCN)源自于内侧神经节隆起(MGE)。使用特定方案将hiPSC分化成mDA和BFCN。向mDA的分化使用基于拟胚体的方案来进行。将hiPSC用细胞消化液(Accutase)(StemCellTechnologies)解离并接种在Aggrewell 800板(每个微孔10,000个细胞；Stem CellTechnologies)中的增补有Y27632(10μM)的神经元诱导培养基(NIM-Stem CellTechnologies)中，以形成拟胚体(EB)。在第5天，将EB在基质胶包被的板上重新铺板在NIM中。在第6天，向NIM增补200ng/mL SHH(Peprotech)，导致神经玫瑰花结的形成。在第12天，使用神经玫瑰花结选择试剂(按照制造商的说明书使用；StemCell Technologies)选择神经玫瑰花结，并在基质胶包被的板中重新铺板在增补有3μM CHIR99021、2μM SB431542、5μg/ml BSA、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的N2B27培养基中，导致神经前体细胞(NPC)的形成。NPC向mDA的分化在将所述NPC在聚L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的板上传代后1天开始。将NPC维持培养基用最终的分化培养基替换并温育14天，所述分化培养基由增补有100ng/mlFGF8(Peprotech)、2μM Purmorphamine、300ng/ml二丁酰cAMP(db-cAMP)和200μM L695抗坏血酸(L-AA)的N2B27培养基构成。从第14天起，将细胞用由20ng/ml GDNF、20ng/ml BDNF、10μM DAPT、0.5mM db-cAMP和200μM L-AA构成的熟化培养基饲养。每隔天更换培养基。向BFCN的分化如下所述来进行。在Aggrewell 800板中在NIM中形成EB。在第5天，将EB重新铺板并每日更换培养基。从第8天起，将神经玫瑰花结生长在NEM(7份KO-DMEM比3份F12，2mMGlutamax，1％青霉素和链霉素，增补有2％B27(均来自于Life Technologies)，并添加20ng/ml FGF、20ng/ml EGF、5g/ml肝素、20M SB431542和10M Y27632、1.5MPurmorphamine)中。在第12天，使用神经玫瑰花结选择试剂选择神经玫瑰花结，并在基质胶包被的板上重新铺板在NEM中。在第23天，撤除Y27632，并且最终分化在PLO/层粘连蛋白包被的板上，在增补有N2、B27、BDNF、GDNF、L-抗坏血酸和db-cAMP的BrainPhys培养基(Stemcell Technologies)存在下进行，直至第45-50天。每隔天更换培养基。

为了产生幼体和衰老神经元，将NPC在它们的相应培养基中每两天传代一次。NPC使用细胞消化液(Accutase)(StemCell Technologies)传代并铺于基质胶包被的板上(2.5*10

上述衰老神经元将被用于涉及所公开的组合物的实验。例如，上述衰老神经元可以与所公开的组合物一起用于降低SNCA表达的方法中。例如，可以向上述衰老神经元添加上述构成所公开的用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物的IDLV。SNCA、α-突触核蛋白和衰老的其他标志物的水平可以按照本文中描述的方法来测量。

用于确定SNCA-mRNA水平的RNA提取和表达分析：使用TRIzol试剂(Invitrogen)从每个稳定转导的MD NPC细胞系提取总RNA，然后使用RNeasy试剂盒(Qiagen)按照制造商的方案进行纯化。RNA浓度在260nm处通过分光光度法确定，而纯化的质量通过260nm/280nm比率来确定，所述比率显示出1.9至2.1之间的值，表明高的RNA质量。cDNA使用MultiScribeRT酶(Applied Biosystems)，使用下述条件来合成：25℃10min和37℃120min。

使用实时PCR来定量MD NPC标志物的水平和SNCA表达水平。简单来说，使用TaqMan表达测定法和ABI QuantStudio 7，通过相对定量实时PCR来测定每个样品的两份平行样。具体的测定法是：用于SNCA靶的Hs00240906，以及分别用于看家参比物GAPDH和PPIA的Hs99999905和Hs99999904。

对于两个独立实验来说，将每种cDNA(20ng)在至少两次独立运行中一式两份扩增(总共≥8次重复实验)，使用了TaqMan Universal PCR主混合物试剂(AppliedBiosystems)和下述条件：50℃2min；95℃10min；95℃15sec和60℃1min共40个循环。作为扩增的特异性的阴性对照，我们在每块板中使用了未被转变成cDNA的RNA对照样品(无RT)和无cDNA/RNA样品(无模板)。在对照反应中没有检测到扩增产物。数据使用设定在扩增的线性范围中的阈值来分析。然后使用任何特定样品跨过该阈值时的循环数(Ct)来确定倍数差异，而两个对照基因的几何平均值充当用于归一化的参比。倍数差异被计算为2

用于确定α-突触核蛋白水平的Western印迹分析：人类α-突触核蛋白在稳定转导的MD NPC细胞系中的表达水平通过Western印迹分析，使用α-突触核蛋白兔单克隆抗体(ab138501，Abcam；1:1000)来确定，并使用mAbβ-肌动蛋白(AM4302，Ambion；1:5000)进行归一化。将细胞从培养皿刮下，并在10倍体积的50mM Tris–HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1％Nonidet P-40中，在蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,MO)存在下匀浆。将样品超声处理3次，每个循环15sec。总蛋白浓度通过DC蛋白质测定法(Bio-Rad,Hercules,CA)来确定，并将25μg的每种样品在12％Tris–甘氨酸SDS–PAGE凝胶上运行。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并将印迹用含有5％奶粉的PBS Tween 20阻断。与第一抗体在4℃温育过夜(Abcam，ab138501，1:1000；Thermofisher AM4302，1:5000)。与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体在室温温育1h(Abcam；1:10000)。使用HyGLO Quick Spray(Denville Scientific)检测信号并使用ChemiDoc MP成像系统(Biorad)对免疫印迹进行成像。使用ImageJ软件测量光密度，并将α-突触核蛋白表达归一化到同一条道中的β-肌动蛋白表达。所述实验重复两次，并代表了两个独立的生物平行样。

α-突触核蛋白聚集体的免疫细胞化学定量：使用Leica Application Suite X软件分析α-突触核蛋白聚集体的免疫荧光图像。对于每个细胞系的50个细胞分析聚集体数目和大小。分析中包括的每个细胞的聚集体数目的基线参考在对照细胞系中观察到的聚集体数目来确定。聚集体的大小被定义为3组：小(<1μm)，中(1-2μm)和大(2-5μm)。频率分布图代表基于数据的自然分组通过任意单位增量划分的聚集体的数目和大小。

彗星测定法：彗星测定法被用于使用如下所述的方案测量hiPSC来源的神经元中的DNA损伤。简单来说，通过将载片在A1溶液[1.2M NaCl，100mM Na

实施例12

体内表观基因组编辑方法的验证

作为将所开发的通过DNA甲基化-CRISPR/Cas9工具调节SNCA的基因表达的方法向前推进到临床场景的关键步骤，在暴露到鱼藤酮的大鼠中验证了靶向SNCA的LV-gRNA/dCas9-DNMT3A-2系统以精细调节和精确的方式降低SNCA过表达的能力。简单来说，将作为退休种鼠的4只6-9月龄的Lewis大鼠通过每日i.p.注射用2.75-3.0mg/mL的鱼藤酮给药共5天。对照动物(n＝4)接受介质(鱼藤酮稀释剂)。分析黑质(SN)和作为对照脑区域的小脑中的SNCA表达水平。在SN中发现SNCA-mRNA(图13A)和蛋白质(图13B-13C)水平的显著提高，相当于高出>50％的水平(P＜0.05，student’s t-检验)。在小脑中没有检测到SNCA-mRNA的增加(图13A)，而SNCA蛋白表达轻度升高(图13B-13C)。治疗性开发被设计成靶向SNCA转录的调控，因此所述在mRNA水平上SNCA表达升高的结果证实了所述鱼藤酮诱导的PD大鼠模型对于LV-gRNA-dCas9-DNMT3A系统的体内验证研究的适合性。路易体(LB)中α-突触核蛋白的主要修饰是第129位处丝氨酸残基上的磷酸化(pSer129Syn)，它是所有α-突触核蛋白病原性聚集体的特异性标志物。因此评估了对pSer129Syn的反应性。使用PSer129抗体对固定的脑进行的免疫荧光(IF)分析显示，与对照大鼠相比，在用鱼藤酮处理的大鼠中pSer129Syn增加(图14)。

此外，在鱼藤酮处理的大鼠中检测到了磷酸化α-突触核蛋白的包含(聚集)，并且发现了所述磷酸化α-突触核蛋白与遍在蛋白共定位的证据(图14)。这些结果证明了PD大鼠模型用于捕获PD的病理表型的可行性。概括来说，所述PD动物模型复制了PD的关键表型特征，因此为在体内测试我们的系统提供了极好的工具。

为了尝试校正鱼藤酮诱导的SNCA在mRNA水平上的过表达，将大鼠用通过立体定向注射递送到SN中的病毒粒子进行治疗。在注射后2周，将大鼠用鱼藤酮或介质处理5天。

如图15A中所述，在LV-gRNA-dCas9-DNMT3A递送后SNCA mRNA水平提高。在用所述载体治疗(使用2.5x10

实施例13

神经元细胞核PD表型的挽救

使用彗星测定法，具体来说是Olive尾矩(OTM)的测量来分析DNA损伤。OTM是对DNA损伤的综合度量，其包括迁移的DNA的最小可检测部分以及尾部中断裂DNA的数量。使用德国的Zeiss Axio Observer广视野荧光显微镜进行成像。彗星使用OpenComet软件，MA，USA进行分析，以确定OTM这个被选择作为每个彗星的定量度量的参数。所述OTM在100个细胞中确定，两个独立的彗星实验各50个细胞。带有gRNA 4的载体(gRNA4-dCas9-DNMT3A)显示出明显更低的OTM值，表明它逆转了DNA损伤表型(图16A-16C)。

SNCA基因的过表达(～2倍)与核膜的衰老相关表型的恶化有关。使用核纤层蛋白B1标志物进行细胞核圆度的分析。细胞核圆度使用内置的ImageJ圆度插件进行定量，并根据核纤层蛋白B1标志物进行评估。1.0的圆度值指示正圆。接近0的值指示越来越延长的多边形。核膜圆度的定量表明，与无gRNA对照载体相比，用gRNA4转导的NPC细胞系中的核膜圆度提高。数据被作图为200个细胞的频率分布。n＝2，对两个独立实验来说每种染色分析一百个细胞，****根据Kolmogorov-Smirnov检验P 0.0001>。细胞核圆度使用内置的ImageJ圆度插件进行定量，并根据核纤层蛋白B1标志物进行评估。1.0的圆度值指示正圆。接近0的值指示越来越延长的多边形。数据代表两个独立实验的平均值。带有gRNA 4的载体(gRNA4-dCas9-DNMT3A)显示出细胞核圆度的显著提高，表明它挽救了异常细胞核的表型(图17A-17C)。

图18A-18C示出了使用核纤层蛋白A/C标志物进行的细胞核折叠和鼓泡的分析。带有gRNA 4的载体(gRNA4-dCas9-DNMT3A)显示出折叠细胞核的显著减少，表明它挽救了异常细胞核形状的表型。

实施例14

用于慢病毒载体设计和生产的方案

出于几个原因，LV代表了递送CRISPR/dCas9组分的有效手段：(i)携带大体积DNA插入片段的能力；(ii)高效转导包括分裂和非分裂细胞两者在内的广范围的细胞30；(iii)诱导极小的细胞毒性和免疫原性应答的能力。

慢病毒平台与最流行的载体平台腺相关病毒载体(AAV)相比具有重要优点，其特征在于前者容纳更大遗传插入片段的能力。AAV可以以显著更高的产量产生，但具有低的包装容量(<4.8kb)，这损害了它们用于递送一体式CRISPR/Cas9系统的用途。本文描述的方案进一步概述了通过对载体表达盒中的元件进行顺式修饰来提高所述载体的生产和表达能力的策略。所述策略强调了系统产生10

表6材料表

表6的材料可以在Tagliafierro L.等(J.Vis.Exp.2019Mar.29:145)中找到。

培养HEK-293T细胞并将细胞铺板以备转染-注：将人胚胎肾293T(HEK-293T)细胞在完全高葡萄糖DMEM(10％小牛血清，1x抗生素-抗真菌剂，1x丙酮酸钠，1x非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺)中，在37℃5％CO

使用低传代细胞开始新的培养(低于第20次传代)。在细胞达到90-95％合生后，吸出培养基并用无菌1x PBS轻柔清洗。

添加2mL胰蛋白酶-EDTA 0.05％并在37℃温育3-5min。为了失活解离试剂，添加8mL完全高葡萄糖DMEM并用10mL血清移液管吸打10-15次，以产生4x10

对于转染来说，将15cm板用0.2％明胶包被。添加22.5mL高葡萄糖培养基，并通过添加2.5mL细胞悬液接种细胞(总共～1x10

转染HEK-293T细胞-按照35制备2x BES缓冲的溶液BBS和1M CaCl

为了制备质粒混合物，使用了列出的四种质粒，下述混合物足够用于一个15cm板：37.5μg CRISPR/dCas9转移载体pBK492(DNMT3A-PURO-无gRNA)或pBK539(DNMT3A-GFP-无gRNA)；25μg pBK240(psPAX2)；12.5μg pMD2.G；6.25μg pRSV-rev(图26A)。在浓度的基础上计算所述质粒的体积，并将所需的量添加到15-ml锥形管中。添加312.5μL 1M CaCl2并使用无菌dd-H

吸出培养基并将它用22.5mL新鲜制备的不含血清的高葡萄糖DMEM代替。向每个15-cm板逐滴添加2.5mL转染混合物。旋转板，并在37℃和5％CO2下温育2-3h。

3h后，每块板添加2.5mL(10％)血清，并在37℃5％CO

转染后第1天-转染后1d，观察细胞以确保不存在或存在极少的细胞死亡，并且所述细胞形成合生培养物(100％)。通过向每块板添加25mL新鲜制备的高葡萄糖DMEM+10％血清来更换培养基。

在37℃、5％CO

收获病毒-从所有转染的细胞收集上清液并合并在50mL锥形管中。以400-450x g离心10min。将上清液通过0.45μm真空过滤装置过滤。在过滤后，可以将上清液保持在4℃短期储存(最多4天)。对于长期储存来说，制备等分试样并将等分试样储存在-80℃。

注：未浓缩的病毒制备物预期为～2-3x10

病毒粒子的浓度-注：对于纯化来说，进行包括蔗糖梯度步骤和蔗糖垫步骤的两步双蔗糖方法(图26B)。

为了产生蔗糖梯度，以下述顺序准备锥形超速离心管：0.5mL在1x PBS中的70％蔗糖，0.5mL在DMEM中的60％蔗糖，1mL在DMEM中的30％蔗糖，2mL在1x PBS中的20％蔗糖。

向所述梯度小心地添加在步骤1.4中收集的上清液。由于从4个15cm板收集的总体积为100mL，因此使用6个超速离心管来处理所述病毒上清液。

将病毒上清液在每个超速离心管之间均等分配。为了避免离心期间管破裂，将超速离心管装填到它们的总体积容量的至少四分之三。用1x PBS平衡离心管。将样品在17℃下以70,000x g离心2h。

注：为了在加速和减速步骤期间维持蔗糖层，允许离心机分别在离心的前3min和最后3min缓慢地从0至200g加速和从200g至0减速转子。

将30-60％蔗糖级分轻柔收集在干净的管中。添加1x PBS(冷)直至100mL总体积。通过多次吸打进行混合。

通过向所述管添加4mL 20％蔗糖(在1x PBS中)，小心地使病毒制备物在蔗糖垫上成层。继续为每个管吸取～20-25mL病毒溶液。如果管的容量小于四分之三，用1x PBS填充。小心地平衡离心管。在17℃以70,000x g离心2h。排空上清液并将管倒置在纸巾上，以允许剩余的液体排干。

通过小心地吸出剩余液体移除所有液体。在这个步骤中，含有病毒的沉积物勉强可见为小的半透明斑点。向第一个管添加70μL 1x PBS以重悬浮所述沉积物。彻底吸移悬液并将它转移到下一个管，直至所有沉积物均被重悬浮。

用另外50μL 1x PBS清洗离心管并如前所述混合。在这个步骤中，最终悬液的体积为～120μL并显得略微乳浊。为了获得透明悬液，以10,000x g进行60s离心。将上清液转移到新的管，制作5μL等分试样并将它们储存在-80℃。

注：慢病毒载体制备物对冻融的重复循环敏感。此外，建议剩余的步骤在组织培养隔离区或在具有足够生物安全标准水平方面合格的指定区域中进行。(图26B)。

病毒滴度的定量-注：病毒滴度的估算使用p24酶联免疫吸附测定(ELISA)方法(p24gag ELISA)，并按照略微修改的NIH AIDS疫苗项目用于HIV-1p24抗原捕获测定法的方案来进行。

使用200μL在冷1x PBS中的0.05％Tween 20(PBS-T)将96孔板的孔清洗三次。

为了包被板，使用100μL在1x PBS中1:1500稀释的单克隆抗p24抗体。将板在4℃温育过夜。

制备阻断试剂(1x PBS中的1％BSA)并向每个孔添加200μL以避免非特异性结合。使用200μL PBS-T在室温将所述孔清洗三次，至少1h。

进行样品制备：当使用浓缩载体制备物工作时，通过使用1μL样品、89μL dd-H20和10μL Triton X-100(终浓度为10％)将载体1:100稀释。对于未浓缩的制备物来说，将样品1:10稀释。

使用2倍连续稀释(起始浓度为5ng/mL)获得HIV-1标准品。

将浓缩的样品(在步骤1.6.4中制备的)在增补有0.2％Tween 20和1％BSA的RPMI1640中稀释，以获得1:10,000、1:50,000和1:250,000稀释度。同样地，将未浓缩的样品(在步骤1.6.4中制备的)在增补有0.2％Tween 20和1％BSA的RPMI 1640中稀释，以建立1:500、1:2500和1:12,500稀释度。

在板上一式三份添加样品和标准品。在4℃温育过夜。

第二天，将孔清洗6次。

添加100μL在RPMI 1640、10％FBS、0.25％BSA和2％正常小鼠血清(NMS)中1:1000稀释的多克隆兔抗p24抗体，并在37℃温育4h。

将孔清洗6次。添加在增补有5％正常山羊血清、2％NMS、0.25％BSA和0.01％Tween20的RPMI 1640中1:10,000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG抗体。在37℃温育1h。

将孔清洗6次。添加TMB过氧化物酶底物并在室温温育15min。

为了终止反应，添加100μL 1N HCL。在微孔板读板器中测量450nm处的吸光度。

荧光报告物强度的测量-使用病毒悬液获得在1x PBS中的10倍连续稀释液(10

将5x10

如下所述进行荧光活化细胞分拣(FACS)分析：通过添加200μL0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液使细胞脱壁。将细胞在37℃温育5min，并将它们重悬浮在2mL DMEM培养基(含血清)中。将样品收集在15mL锥形管中并在4℃以400g离心。将沉积物重悬浮在500μL冷1x PBS中。

通过添加500μl 4％PFA并在室温温育10min来固定细胞。

在4℃以400g离心，并将沉积物重悬浮在1mL 1x PBS中。使用FACS仪器分析GFP表达。

为了确定病毒的功能滴度，使用下述公式：

每mL的转导单位(TU)＝Tg/Tn×N×1000/V

Tg＝GFP阳性细胞的数目；Tn＝细胞总数；N＝转导的细胞总数；V＝用于转导的体积(以μL计)。

GFP阳性细胞计数-注：确定用于转导的感染复数(MOI)。测试广范围的MOI(从MOI＝1至MOI＝10)。

在6孔板的每个孔中接种3-4x10

当细胞达到>80％合生时，使用载体以感兴趣的MOI转导。

在37℃5％CO

对GFP阳性细胞的数目进行计数。使用荧光显微镜(PLAN 4X物镜，0.1N.A，40X放大倍数)，使用GFP滤光片(激发波长：470nm，发射波长：525nm)。使用未转导的细胞设置GFP阴性细胞的对照群体。

使用下述公式确定病毒的功能滴度。

每mL的转导单位(TU)＝(N)×(D)×(M)×V

注：N＝GFP阳性细胞的数目，D＝稀释倍数，M＝放大倍数，V＝用于转导的病毒的体积。依照下述计算实例来计算结果：对于在10μL样品(V)中以10

MD NPC分化

培养hiPSC-注：来自于具有SNCA基因座的三重重复的患者的人诱导多能干细胞(hiPSC)ND34391从NINDS目录获得(参见表6)。

在hESC合格的基础基质膜(BMM)包被的板(参见表6)上，在无饲养细胞的ESC-iPSC培养基(参见表6)中将hiPSC在不依赖于饲养细胞的条件下进行培养。用1mL DMEM-F12清洗合生集落，添加1mL解离试剂(参见表6)并在室温温育3min。

吸出解离试剂并添加1mL无饲养细胞ESC-iPSC培养基。

使用细胞铲刮板，并通过使用硼硅酸盐移液管吸打4-5次，将集落重悬浮在11mL无饲养细胞ESC-iPSC培养基中。

将2mL集落悬液铺于BMM包被的板上，并将板置于37℃5％CO

向MD NPC的分化-注：hiPSC向多巴胺能神经祖细胞(MD NPC)的分化使用可商购的神经诱导培养基方案，按照制造商的说明书并做出略微修改来进行(参见表6)。分化的第一天被当作第0天。为了高效的神经分化，需要高质量的hiPSC。MD NPC的诱导使用基于拟胚体(EB)的方案来进行。

在开始hiPSC的分化之前，按照制造商的说明书准备微孔培养板(参见表6)。

在准备好微孔培养板后，添加1mL增补有10μM Y-27632的神经诱导培养基(NIM，参见表6)。

将板放置在一边直至准备使用。

用DMEM-F12清洗hiPSC，添加1mL细胞脱离溶液(参见表6)，并在37℃5％CO

将单细胞重悬浮在DMEM-F12中，并以300g离心5min。

小心地吸出上清液，并将细胞重悬浮在NIM+10μM Y-27632中，以获得3x10

向微孔培养板的单个孔添加1mL单细胞悬液，并将板以100g离心3min。

在显微镜下检查板，以确保细胞在微孔之间平均分配，并将细胞在37℃5％CO

第1天-第4天：进行每日培养基部分更换。

使用1mL微量移液管取出1.5mL培养基并舍弃。缓慢地添加1.5mL新鲜的不含Y-27632的NIM。

重复步骤2.2.10直至第4天。

第5天：用BMM包被6孔板的1个孔。

将37μm可逆过滤器(参见表6)置于50mL锥形管(废)顶上。使可逆过滤器的箭头指向上方。

在不扰动形成的EB的情况下从微孔培养板取出培养基。

使用硼硅酸盐移液管添加1mL DMEM-F12并立即收集EB，并通过所述过滤器过滤。

重复步骤直至所有EB均从微孔培养板取出。

将所述过滤器倒置在新的50mL锥形管上方，并添加2mL NIM以收集所有EB。

使用硼硅酸盐移液管将2mL所述EB悬液铺于BMM包被的板的单个孔中。将EB在37℃5％CO

第6天：制备2mL NIM+200ng/mL SHH(参见材料表)并进行每日培养基更换。

第8天：检查神经元诱导的百分率。

对所有附着的EB计数并具体确定装填有神经玫瑰花结的每个个体EB的数目。使用下述公式对神经玫瑰花结诱导进行定量：

注：如果神经诱导<75％，神经玫瑰花结选择可能无效。

第12天：如下所述制备250mL N2B27培养基：119mL神经基础培养基，119mL DMEM/F12培养基，2.5mL Glutamax，2.5mL NEAA，2.5mL N2增补物，5mL不含维生素A的B27，250μL50mg/mL的庆大霉素，19.66μL 7mg/mL的BSA。

为了制备50mL完全N2B27培养基，添加3μM CHIR99021、2μM SB431542、20ng/mLbFGF、20ng/mL EGF和200ng/mL SHH。

注：重要的是在即将使用前制备完全培养基。

从含有神经玫瑰花结的孔吸出培养基并用1mL DMEM-F12清洗。

添加1mL神经玫瑰花结选择试剂(参见表6)并在37℃5％CO

取出所述选择试剂，并使用1mL移液器直接对准玫瑰花结簇。

将所述悬液添加到15mL锥形管，并重复(取出所述选择试剂，使用1mL移液器直接对准玫瑰花结簇，并添加到标准管)，直至大部分神经玫瑰花结簇已被收集。

注：为了避免非神经元细胞类型的污染，不要过度选择。

将玫瑰花结悬液以350g离心5min。吸出上清液并将神经玫瑰花结重悬浮在N2B27+200ng/mL SHH中。向BMM包被的孔添加神经玫瑰花结悬液，并将板在37℃ 5％CO

第13天-第17天：使用完全N2B27培养基进行每日培养基更换。当培养物达到80-90％合生时将细胞传代。

为了分拆细胞，制备BMM包被的板。

将细胞用1mL DMEM-F12清洗，吸出培养基并添加1mL解离试剂(参见表6)。

在37℃温育5min，添加1mL DMEM-F12并通过上下吸打分散附连的细胞。将NPC悬液收集到15mL锥形管。以300g离心5min。

吸出上清液并将细胞重悬浮在1mL完全N2B27+200ng/mL SHH中。

对细胞进行计数，以1.25x 10

每隔天使用完全N2B27+200ng/mL SHH更换培养基。

注：在这个传代时，NPC被认为是P0传代。在P2时可以从N2B27培养基中撤除SHH。

在细胞达到80-90％合生后将细胞传代。

在这个阶段，使用免疫细胞化学和qPCR确认细胞表达巢蛋白和FoxA2标志物。这个方案导致产生85％的对巢蛋白和FoxA2标志物双阳性的细胞。

为了将细胞传代，重复段落[00318]–[00324]中的步骤。将始于P2传代的细胞冷冻。为了将细胞冷冻，重复步骤2.[00318]–[00324]，并使用冷的神经祖细胞冷冻介质(参见表6)将细胞沉淀物以2-4x10

将1mL细胞悬液转移到每个冷冻管中，并使用标准的慢速受控冷却系统冷冻细胞。对于长期储存来说，将细胞保持在液氮中。

融化MD NPC-制备BMM包被的板和温热的完全N2B27。向15mL锥形管添加10mL温热DMEM-F12。将冷冻管置于37℃加热块中2min。

将细胞从冷冻管转移到含有DMEM-F12的管。300g离心5min。

吸出上清液，将细胞重悬浮在2mL N2B27中，并向BMM包被的板的1个孔添加细胞悬液。将细胞在37℃ 5％CO

MD NPC的转导和甲基化改变的分析

MD NPC的转导

用LV-gRNA/dCas9-DNMT3A载体以2的感染复数(MOI)转导70％合生时的MD NPC。转导后16h替换N2B27培养基。

转导后48h添加增补有1至5μg/mL嘌呤霉素的N2B27培养基，以获得稳定的MD NPC细胞系。细胞随时可用于下游应用(DNA、RNA、蛋白质分析以及表型表征，如本文中所述冷冻和传代)。

MD NPC的分化。本文中描述的基于EB的方案允许MD NPC的分化。参见Tagliafierro,L.等，J.Vis.Exp.2019Mar 29:145。这个分化方案产生83.3％的对巢蛋白和FOXA2标志物双重阳性的细胞，证实了这些细胞的成功分化。

焦磷酸测序测定法验证SNCA-内含子1的甲基化概貌。建立了7种焦磷酸测序测定法以评估SNCA内含子1中的DNA甲基化状态。参见Kantor等，Mol.Ther.2018；Nov.7:26(11):2638-2649。Chr4：89,836,150-89,836,593(GRCh38/hg38)区域含有23个CpG。使用未甲基化(U)和甲基化(M)的亚硫酸氢盐转化的DNA的不同混合物作为标准品，验证了设计的测定法的线性。使用下述比例的混合物：100U:0M，75U:25M，50U:50M，25U:75M，0U:100M。验证了所有7种测定法，它们显示出线性相关(R2>0.93)。使用所验证的测定法，我们能够确定用和未用gRNA 1-4载体处理的SNCA内含子1中的23个CpG处的甲基化水平(图3)。

应该理解，上面的详细描述和伴随的实施例仅仅是说明性的，并且不被当作对本发明范围的限制，本发明的范围仅由随附的权利要求书及其等同物定义。

对所公开的实施方式的各种不同改变和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些改变和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的改变和修改，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出。

出于完整性原因，本发明的各个不同方面被阐述在下述编号条目中：

条目1.一种用于SNCA基因的表观基因组修饰的组合物，所述组合物包含：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性或其组合的活性的肽，和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)或(b)(ii)编码至少一种指导gRNA的核酸序列，其中所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

条目2.根据条目1所述的组合物，其中所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因的内含子1中的靶区域。

条目3.根据条目2所述的组合物，其中所述组合物修饰所述SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域。

条目4.根据条目3所述的组合物，其中所述至少一个CpG岛区域包含CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG10、CpG11、CpG12、CpG13、CpG14、CpG15、CpG16、CpG17、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22、CpG23或其组合。

条目5.根据条目3或4所述的组合物，其中所述至少一个CpG岛区域包含CpG1、CpG3、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22或其组合。

条目6.根据条目3-5中的任一项所述的组合物，其中所述第二多肽结构域包含具有甲基化酶活性的肽，并且所述融合蛋白将所述SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域甲基化。

条目7.根据条目1-6中的任一项所述的组合物，其中所述至少一种gRNA包含SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、其互补序列、其变体中的至少一者或其组合的多核苷酸序列。

条目8.根据条目1所述的组合物，其中所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因的内含子4中的靶区域，并且任选地，其中所述内含子4中的靶区域是H3K4Me3、H3K4Me1和/或H3K27Ac标记。

条目9.根据条目1-8中的任一项所述的组合物，其中所述第二多肽结构域包含DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A(DNMT3A)、其功能性片段和/或其变体。

条目10.根据条目1-9中的任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白阻遏所述SNCA基因的转录。

条目11.根据条目1-10中的任一项所述的组合物，其中所述Cas蛋白包含具有至少一个氨基酸突变的Cas9核酸内切酶，所述突变敲除了Cas9的核酸酶活性。

条目12.根据条目11所述的组合物，其中所述至少一个氨基酸突变是D10A和H840A中的至少一者。

条目13.根据条目11或12所述的组合物，其中所述Cas蛋白包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

条目14.根据条目1-13中的任一项所述的组合物，其中所述第二多肽结构域被融合到所述第一多肽结构域的C-端、N-端或两端。

条目15.根据条目1-14中的任一项所述的组合物，其还包含核定位序列。

条目16.根据条目1-15中的任一项所述的组合物，其还包含将所述第一多肽结构域连接到所述第二多肽结构域的连接物。

条目17.根据条目1-16中的任一项所述的组合物，其中所述第二多肽结构域包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

条目18.根据条目1-17中的任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白包含SEQ IDNO：13的氨基酸序列。

条目19.根据条目1-18中的任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白由包含SEQID NO：14的多核苷酸序列的多核苷酸序列编码。

条目20.根据条目1-19中的任一项所述的组合物，其包括向所述对象给药或在所述对象中提供下述任一者：(a)(ii)和(b)(ii)，(a)(i)和(b)(i)，(a)(i)和(b)(ii)，或(a)(ii)和(b)(i)。

条目21.根据条目1-20中的任一项所述的组合物，其中(a)(ii)和/或(b)(ii)的核酸包含DNA或RNA。

条目22.根据条目1-21中的任一项所述的组合物，其中(a)和(b)中的一者或两者被包装在病毒载体中。

条目23.根据条目1-22中的任一项所述的组合物，其中(a)和(b)被包装在同一病毒载体中。

条目24.根据条目22或23所述的组合物，其中所述病毒载体包括慢病毒载体。

条目25.根据条目22-24中的任一项所述的组合物，其中所述病毒载体包括游离型整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)或游离型整合酶活性慢病毒载体(ICLV)。

条目26.根据条目22-25中的任一项所述的组合物，其中所述病毒载体包含包括多个启动子、p2a、t2a、IRES或其组合的多顺反子-蛋白质组合物。

条目27.一种分离的多核苷酸，其编码根据条目1-26中的任一项所述的组合物。

条目28.一种载体，其包含根据条目27所述的分离的多核苷酸。

条目29.根据条目28所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

条目30.根据条目28或29所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

条目31.根据条目28-30中的任一项所述的载体，其中所述病毒载体是游离型整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)或游离型整合酶活性慢病毒载体(ICLV)。

条目32.一种宿主细胞，其包含根据条目27所述的分离的多核苷酸或根据条目28-31中的任一项所述的载体。

条目33.一种药物组合物，其包含根据条目1-26所述的组合物、根据条目27所述的分离的多核苷酸、根据条目28-31中的任一项所述的载体、根据条目32所述的宿主细胞中的至少一者或其组合。

条目34.一种试剂盒，其包含根据条目1-26所述的组合物、根据条目27所述的分离的多核苷酸、根据条目28-31中的任一项所述的载体中的至少一者或其组合。

条目35.一种在细胞或对象中体内调节SNCA基因的表达的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的根据条目1-26所述的组合物、根据条目27所述的分离的多核苷酸、根据条目28-31中的任一项所述的载体、根据条目33所述的药物组合物中的至少一者或其组合相接触。

条目36.一种在对象中治疗与SNCA表达水平升高有关的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象或对象中的细胞给药根据条目1-26所述的组合物、根据条目27所述的分离的多核苷酸、根据条目28-31中的任一项所述的载体、根据条目33所述的药物组合物中的至少一者或其组合。

条目37.一种在细胞或对象中体内调节SNCA基因的表达的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的下述组分相接触：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，其将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(b)(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

条目38.一种在对象中治疗与SNCA表达水平升高有关的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象或对象中的细胞给药足以调节所述基因的表达的量的下述组分：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，其将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(b)(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

条目39.根据条目37或38所述的方法，其中所述至少一种gRNA或编码所述至少一种gRNA的核酸序列将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因的内含子1中的靶区域。

条目40.根据条目39所述的方法，其中所述融合蛋白修饰所述SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域。

条目41.根据条目40所述的方法，其中所述至少一个CpG岛区域包含CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG10、CpG11、CpG12、CpG13、CpG14、CpG15、CpG16、CpG17、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22、CpG23或其组合。

条目42.根据条目40或41所述的方法，其中所述至少一个CpG岛区域包含CpG1、CpG3、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22或其组合。

条目43.根据条目40-42中的任一项所述的方法，其中所述第二多肽结构域包含具有甲基化酶活性的肽，并且所述融合蛋白将所述SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域甲基化。

条目44.根据条目37-43中的任一项所述的方法，其中所述至少一种gRNA包含SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、其互补序列、其变体中的至少一者或其组合的多核苷酸序列。

条目45.根据条目37或38所述的方法，其中所述至少一种gRNA或编码所述至少一种gRNA的核酸序列将所述融合蛋白靶向到SNCA基因的内含子4中的靶区域，并且任选地，其中所述内含子4中的靶区域是H3K4Me3、H3K4Me1和/或H3K27Ac标记。

条目46.根据条目37-45中的任一项所述的方法，其中所述第二多肽结构域包含DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A(DNMT3A)、其功能性片段和/或其变体。

条目47.根据条目37-46中的任一项所述的方法，其中所述融合蛋白阻遏所述SNCA基因的转录。

条目48.根据条目37-47中的任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白包括具有至少一个氨基酸突变的Cas9核酸内切酶，所述突变敲除了Cas9的核酸酶活性。

条目49.根据条目48所述的方法，其中所述至少一个氨基酸突变是D10A和H840A中的至少一者。

条目50.根据条目48或49所述的方法，其中所述Cas蛋白包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

条目51.根据条目37-50中的任一项所述的方法，其中所述第二多肽结构域被融合到所述第一多肽结构域的C-端、N-端或两端。

条目52.根据条目37-51中的任一项所述的方法，其还包含核定位序列。

条目53.根据条目37-52中的任一项所述的方法，其还包括将所述第一多肽结构域连接到所述第二多肽结构域的连接物。

条目54.根据条目37-53中的任一项所述的方法，其中所述第二多肽结构域包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

条目55.根据条目37-54中的任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包含SEQ IDNO：13的氨基酸序列。

条目56.根据条目37-55中的任一项所述的方法，其中所述融合蛋白由包含SEQ IDNO：14的多核苷酸序列的多核苷酸序列编码。

条目57.根据条目37-56中的任一项所述的方法，其包括向所述对象给药或在所述对象中提供下述任一者：(a)(ii)和(b)(ii)，(a)(i)和(b)(i)，(a)(i)和(b)(ii)，或(a)(ii)和(b)(i)。

条目58.根据条目37-57中的任一项所述的方法，其中(a)(ii)和/或(b)(ii)的核酸包含DNA或RNA。

条目59.根据条目37-58中的任一项所述的方法，其中(a)和(b)中的一者或两者被包装在病毒载体中。

条目60.根据条目37-59中的任一项所述的方法，其中(a)和(b)被包装在同一病毒载体中。

条目61.根据条目59或60所述的方法，其中所述病毒载体包括慢病毒载体。

条目62.根据条目59-61中的任一项所述的方法，其中所述病毒载体包括游离型整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)或游离型整合酶活性慢病毒载体(ICLV)。

条目63.根据条目35-62中的任一项所述的方法，其中所述细胞包含SNCA基因三重重复(SNCA-Tri)，其中SNCA的水平与不具有SNCA-Tri的对照细胞中的生理水平相比提高。

条目64.根据条目63所述的方法，其中在向所述对象或对象中的细胞给药或提供下述任一者后，SNCA水平被降低到生理水平：(a)(ii)和(b)(ii)，(a)(i)和(b)(i)，(a)(i)和(b)(ii)，或(a)(ii)和(b)(i)。

条目65.根据条目35-64中的任一项所述的方法，其中所述SNCA基因的表达被降低至少20％。

条目66.根据条目35-65中的任一项所述的方法，其中所述SNCA基因的表达被降低至少90％。

条目67.根据条目35-66中的任一项所述的方法，其中α-突触核蛋白的水平被降低至少25％。

条目68.根据条目35-67中的任一项所述的方法，其中α-突触核蛋白的水平被降低至少36％。

条目69.根据条目35-68中的任一项所述的方法，其中线粒体超氧化物生产被降低至少25％和/或细胞存活率被提高至少1.4倍。

条目70.根据条目36或38-69中的任一项所述的方法，其中所述疾病或障碍是神经变性障碍。

条目71.根据条目70所述的方法，其中所述神经变性障碍是SNCA相关疾病或障碍。

条目72.根据条目70或71所述的方法，其中所述神经变性障碍是突触核蛋白病。

条目73.根据条目70-72中的任一项所述的方法，其中所述神经变性障碍是帕金森氏病或路易体痴呆。

条目74.根据条目35-73中的任一项所述的方法，其中所述细胞是多巴胺能(中脑腹侧)神经祖细胞(MD NPC)、中脑多巴胺能神经元(mDA)或基底前脑胆碱能神经元(BFCN)。

条目75.根据条目35-74中的任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

条目76.根据条目35-75中的任一项所述的方法，其中所述对象是人类或鼠类对象。

条目77.根据条目35-76中的任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含包括多个启动子、p2a、t2a、IRES或其组合的多顺反子-蛋白质组合物。

条目78.一种用于表观基因组编辑的病毒载体系统，所述病毒载体系统包含：(a)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)编码至少一种指导RNA(gRNA)的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

条目79.根据条目78所述的病毒载体系统，其中所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因的内含子1中的靶区域。

条目80.根据条目79所述的病毒载体系统，其中所述融合蛋白修饰所述SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域。

条目81.根据条目80所述的病毒载体系统，其中所述至少一个CpG岛区域包含CpG1、CpG2、CpG3、CpG4、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG10、CpG11、CpG12、CpG13、CpG14、CpG15、CpG16、CpG17、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22、CpG23或其组合。

条目82.根据条目80或81所述的病毒载体系统，其中所述至少一个CpG岛区域包含CpG1、CpG3、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9、CpG18、CpG19、CpG20、CpG21、CpG22或其组合。

条目83.根据条目80-82中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述第二多肽结构域包含具有甲基化酶活性的肽，并且所述融合蛋白将所述SNCA基因的内含子1中的至少一个CpG岛区域甲基化。

条目84.根据条目78-83中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述至少一种gRNA包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、其互补序列、其变体中的至少一者或其组合的多核苷酸序列。

条目85.根据条目78所述的病毒载体系统，其中所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到SNCA基因的内含子4中的靶区域，并且任选地，其中所述内含子4中的靶区域是H3K4Me3、H3K4Me1和/或H3K27Ac标记。

条目86.根据条目78-85中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述第二多肽结构域包含DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶3A(DNMT3A)、其功能性片段和/或其变体。

条目87.根据条目78-86中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述第二多肽结构域包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

条目88.根据条目78-87中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述Cas蛋白包括具有至少一个氨基酸突变的Cas9核酸内切酶，所述突变敲除了Cas9的核酸酶活性。

条目89.根据条目88所述的病毒载体系统，其中所述至少一个氨基酸突变是D10A和H840A中的至少一者。

条目90.根据条目88或89所述的病毒载体系统，其中所述Cas蛋白包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

条目91.根据条目78-90中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述第二多肽结构域被融合到所述第一多肽结构域的C-端、N-端或两端。

条目92.根据条目78-91中的任一项所述的病毒载体系统，其还包含核定位序列。

条目93.根据条目78-92中的任一项所述的病毒载体系统，其还包括将所述第一多肽结构域连接到所述第二多肽结构域的连接物。

条目94.根据条目78-93中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。

条目95.根据条目78-94中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述融合蛋白由包含SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的多核苷酸序列编码。

条目96.根据条目78-95中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

条目97.根据条目78-96中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述病毒载体是游离型整合酶缺陷慢病毒载体(IDLV)或游离型整合酶活性慢病毒载体(ICLV)。

条目98.一种在患有与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的对象中逆转DNA损伤的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的根据条目1-26所述的组合物、根据条目27所述的分离的多核苷酸、根据条目28-31中的任一项所述的载体、根据条目33所述的药物组合物中的至少一者或其组合相接触。

条目99.一种在患有与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的对象中挽救衰老相关的异常细胞核的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的根据条目1-26所述的组合物、根据条目27所述的分离的多核苷酸、根据条目28-31中的任一项所述的载体、根据条目33所述的药物组合物中的至少一者或其组合相接触。

条目100.一种在患有与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的对象中提高细胞核圆度或减少折叠细胞核的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的根据条目1-26所述的组合物、根据条目27所述的分离的多核苷酸、根据条目28-31中的任一项所述的载体、根据条目33所述的药物组合物中的至少一者或其组合相接触。

条目101.一种在患有与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的对象中逆转DNA损伤的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的下述组分相接触：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(b)(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

条目102.一种在患有与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的对象中挽救衰老相关的异常细胞核的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的下述组分相接触：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(b)(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

条目103.一种在患有与SNCA表达水平升高相关的疾病或障碍的对象中提高细胞核圆度或减少折叠细胞核的方法，所述方法包括将所述细胞或对象与足以调节所述基因的表达的量的下述组分相接触：(a)(i)融合蛋白或(a)(ii)编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含两个异源多肽结构域，其中第一多肽结构域包含成簇规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白，并且第二多肽结构域包含具有选自转录激活活性、转录阻遏活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸结合活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性和脱乙酰酶活性的活性的肽；和(b)(i)至少一种指导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA将所述融合分子靶向到所述SNCA基因中的靶区域，或(b)(ii)编码至少一种gRNA的核酸序列，所述至少一种gRNA将所述融合蛋白靶向到所述SNCA基因中的靶区域。

条目104.根据条目22-26中的任一项所述的组合物，其中所述病毒载体包含SEQID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：39的多核苷酸序列。

条目105.根据条目28-31中的任一项所述的载体，其中所述病毒载体包含SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：39的多核苷酸序列。

条目106.根据条目59-62中的任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：39的多核苷酸序列。

条目107.根据条目78-97中的任一项所述的病毒载体系统，其中所述病毒载体包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：39的多核苷酸序列。

附录(序列)

酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)dCas氨基酸序列(SEQ ID NO：10)

MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

DNMT3A氨基酸序列(SEQ ID NO：11)

PSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV

DNMT3A核苷酸序列(SEQ ID NO：12)

CCCTCCCGGCTCCAGATGttcttcgctaataaccacgaccaggaatttgaccctccaaaggtttacccacctgtcccagctgagaagaggaagcccatccgggtgctgtctctctttgatggaatcgctacagggctcctggtgctgaaggacttgggcattcaggtggaccgctacattgcctcggaggtgtgtgaggactccatcacggtgggcatggtgcggcaccaggggaagatcatgtacgtcggggacgtccgcagcgtcacacagaagcatatccaggagtggggcccattcgatctggtgattgggggcagtccctgcaatgacctctccatcgtcaaccctgctcgcaagggcctctacgagggcactggccggctcttctttgagttctaccgcctcctgcatgatgcgcggcccaaggagggagatgatcgccccttcttctggctctttgagaatgtggtggccatgggcgttagtgacaagagggacatctcgcgatttctcgagtccaaccctgtgatgattgatgccaaagaagtgtcagctgcacacagggcccgctacttctggggtaaccttcccggtatgaacaggccgttggcatccactgtgaatgataagctggagctgcaggagtgtctggagcatggcaggatagccaagttcagcaaagtgaggaccattactacgaggtcaaactccataaagcagggcaaaGACCAGCATTTTCCTGTGTTCATGAATGAGAAAGAGgacatcttatggtgcactgaaatggaaagggtatttggtttcccagtccactatactgacgtgtccaacatgagccgcttggcgaggcagagactgctgggccggtcatggagcgtgccagtcatccgccacctcttcgctcCGCTGAAGGAGTATTTTGCGTGTGTG

dCas9-DNMT3A融合蛋白(aa序列)(SEQ ID NO：13)

DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDKRPAATKKAGQAKKKKLEGGGGSGSPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFAC

dCas9-DNMT3A融合蛋白（nt序列）（SEQ ID NO：14）

GACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACGCTATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCTCGAGGGCGGAGGCGGGAGCGGATCCCCCTCCCGGCTCCAGATGttcttcgctaataaccacgaccaggaatttgaccctccaaaggtttacccacctgtcccagctgagaagaggaagcccatccgggtgctgtctctctttgatggaatcgctacagggctcctggtgctgaaggacttgggcattcaggtggaccgctacattgcctcggaggtgtgtgaggactccatcacggtgggcatggtgcggcaccaggggaagatcatgtacgtcggggacgtccgcagcgtcacacagaagcatatccaggagtggggcccattcgatctggtgattgggggcagtccctgcaatgacctctccatcgtcaaccctgctcgcaagggcctctacgagggcactggccggctcttctttgagttctaccgcctcctgcatgatgcgcggcccaaggagggagatgatcgccccttcttctggctctttgagaatgtggtggccatgggcgttagtgacaagagggacatctcgcgatttctcgagtccaaccctgtgatgattgatgccaaagaagtgtcagctgcacacagggcccgctacttctggggtaaccttcccggtatgaacaggccgttggcatccactgtgaatgataagctggagctgcaggagtgtctggagcatggcaggatagccaagttcagcaaagtgaggaccattactacgaggtcaaactccataaagcagggcaaaGACCAGCATTTTCCTGTGTTCATGAATGAGAAAGAGgacatcttatggtgcactgaaatggaaagggtatttggtttcccagtccactatactgacgtgtccaacatgagccgcttggcgaggcagagactgctgggccggtcatggagcgtgccagtcatccgccacctcttcgctcCGCTGAAGGAGTATTTTGCGTGTGTG

pBK500（带有gRNA4的一体式慢病毒载体）-含有融合蛋白和gRNA的慢病毒构建物序列（SEQ ID NO：38）

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pBK546完整序列，带有通过p2A切割信号连接到嘌呤霉素选择基因的dCas9-DNMT3A融合转入基因的质粒（以前被称为pBK492载体（原始（无gRNA-载体）-含有融合到dCas9的DNMT3A的催化结构域）（SEQ ID NO：39）

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pBK539完整序列，带有通过p2A切割信号连接到GFP选择基因的dCas9-DNMT3A融合转入基因的质粒(nt序列)(SEQ ID NO：40)

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pBK744完整序列，带有通过p2A切割信号连接到GFP选择基因的dCas9-DNMT3A融合转入基因的质粒。所述质粒带有靶向大鼠/小鼠内含子Snca-内含子1序列的gRNA3(参见图8)(nt序列)(SEQ ID NO：41)

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